CN114164297B - 一种特异性区分翅萼石斛和黑毛石斛的引物对、试剂盒及其应用 - Google Patents

一种特异性区分翅萼石斛和黑毛石斛的引物对、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种特异性区分翅萼石斛和黑毛石斛的引物对、试剂盒及其应用。本发明对翅萼石斛和黑毛石斛的叶绿体基因组accD基因3'末端到pafII基因5'端(包括accD基因与psaI基因的间隔区、psaI基因、psaI基因和pafII基因间隔区)进行了测序分析，发现accD基因3'末端到pafII基因5'端(包括accD基因与psaI基因的间隔区、psaI基因、psaI基因和pafII基因间隔区)在翅萼石斛和黑毛石斛之间存在显著差异；本发明对上述差异序列区间设计特异性引物对，利用该引物对对待测石斛样品进行PCR扩增，根据扩增产物可以特异性区分翅萼石斛和黑毛石斛，可以在不是花期的时候或DNA未降解的中药干品状态准确鉴定翅萼石斛和黑毛石斛。

Description

一种特异性区分翅萼石斛和黑毛石斛的引物对、试剂盒及其 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种特异性区分翅萼石斛和黑毛石斛的引物对、试剂盒及其应用。
背景技术
石斛属Dendrobium Sw.是兰科三大属之一，其原种将近2000种，中国有78种。石斛属植物多数都具有很高的药用价值和观赏价值。翅萼石斛(Dendrobium cariniferum)为石斛属植物中观赏价值较高的一个种，其花型优美，花色艳丽，花具有橘子香气，花期长，可达2～3个月，是很好的育种亲本。黑毛石斛(Dendrobium williamsonii)和翅萼石斛从外形上看，非常相似，只有花上有区别。从形态上识别黑毛石斛和翅萼石斛，花瓣与萼片近等宽，萼片背面中肋不明显隆起，子房非三棱形的为黑毛石斛，否则为翅萼石斛。由于形态上的区别不明显，只有在花期才能区别翅萼石斛和黑毛石斛，而且，经研究表明，翅萼石斛和黑毛石斛都具有药效功能，若做成中药干品更是难以区分，所以经常会出现将二者混淆的现象或根本没有办法准确鉴别二者。因此，有必要探索一种不在花期或中药干品状态(DNA未降解)下准确鉴定翅萼石斛和黑毛石斛的方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种特异性区分翅萼石斛和黑毛石斛的引物对及其应用。本发明提供的引物对可以特异性区分翅萼石斛和黑毛石斛，可以在不是花期的时候或DNA未降解的中药干品状态准确鉴定翅萼石斛和黑毛石斛。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种特异性区分翅萼石斛和黑毛石斛的引物对，所述引物对包括上游引物F和下游引物R；所述上游引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种特异性区分翅萼石斛和黑毛石斛的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物对。
本发明还提供了上述引物对或上述试剂盒在区分翅萼石斛和黑毛石斛中的应用。
本发明还提供了一种区分翅萼石斛和黑毛石斛的方法，包括以下步骤：
以待测样品基因组DNA为模板，利用上述引物对或上述试剂盒配制PCR反应体系，进行PCR扩增；
若扩增产物的长度为900～1000bp，则待测样品为翅萼石斛；
若扩增产物的长度为400～500bp，则待测样品为黑毛石斛。
优选的，所述PCR扩增的反应程序包括：95℃预变性5min；95℃变性30s；56℃退火30s，72℃延伸50s，30个循环；72℃延伸10min。
优选的，所述PCR扩增的反应体系以20μL计，包括模板0.5μL、上游引物1μL、下游引物1μL、10×TaqBuffer 2.0μl、Taq酶0.2μl、dNTP Mix 1.6μl和剩余ddH2O。
优选的，所述上游引物和下游引物的浓度均为10μmol/L；所述模板的浓度为50～200ng/μl。
优选的，所述Taq酶的酶活为5U、所述dNTP Mix的浓度为2.5mmol/L。
优选的，所述扩增产物的鉴定方法包括电泳或测序；
当鉴定方法为测序时，若扩增产物的序列与CE序列一致的支持率大于99％，则待测样品为翅萼石斛；所述CE序列如SEQ ID NO.3所示；
若扩增产物的序列与HM序列一致的支持率大于99％，则待测样品为黑毛石斛；所述HM序列如SEQ ID NO.4所示。
优选的，所述待测样品包括新鲜组织和/或DNA未降解的干品组织。
有益效果：
本发明提供了一种特异性区分翅萼石斛和黑毛石斛的引物对，所述引物对包括上游引物F和下游引物R；所述上游引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明对翅萼石斛和黑毛石斛的叶绿体accD基因3'末端到pafII基因5'端(包括accD基因与psaI基因的间隔区、psaI基因、psaI基因和pafII基因间隔区)进行了测序分析，发现accD基因3'末端到pafII基因5'端(包括accD基因与psaI基因的间隔区、psaI基因、psaI基因和pafII基因间隔区)在翅萼石斛和黑毛石斛之间存在显著差异；本发明对上述差异序列区间设计特异性引物对，利用该引物对对待测石斛样品进行PCR扩增，根据扩增产物可以特异性区分翅萼石斛和黑毛石斛，可以在不是花期的时候或DNA未降解的中药干品状态下准确鉴定翅萼石斛和黑毛石斛。
附图说明
图1为翅萼石斛和黑毛石斛标准品扩增产物的电泳图；
图2为对比例1设计的6对引物扩增产物的电泳图；
其中CE为翅萼石斛，HM为黑毛石斛，primer1为引物1-F和1-R的扩增结果，primer2为引物2-F和2-R的扩增结果，primer3为引物3-F和3-R的扩增结果，primer4为引物4-F和4-R的扩增结果，primer5为引物5-F和5-R的扩增结果，primer6为引物6-F和6-R的扩增结果。
具体实施方式
本发明提供了一种特异性区分翅萼石斛和黑毛石斛的引物对，所述引物对包括上游引物F和下游引物R；所述上游引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：CTTCCCTTGAATCAAGATTA，所述下游引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：CATATCATATATCCTGCCAT。本发明提供的引物对可以对待测石斛样品进行PCR扩增，根据扩增产物可以特异性区分翅萼石斛和黑毛石斛，可以在不是花期的时候或DNA未降解的中药干品状态准确鉴定翅萼石斛和黑毛石斛。
本发明还提供了一种特异性区分翅萼石斛和黑毛石斛的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物对。本发明提供的试剂盒可以特异性区分翅萼石斛和黑毛石斛。具体原理同上，在此不再赘述。
本发明还提供了上述引物对或上述试剂盒在区分翅萼石斛和黑毛石斛中的应用。本发明提供的引物对或试剂盒可以特异性区分翅萼石斛和黑毛石斛。具体原理同上，在此不再赘述。
本发明还提供了一种区分翅萼石斛和黑毛石斛的方法，包括以下步骤：
以待测样品基因组DNA为模板，利用上述引物对或上述试剂盒配制PCR反应体系，进行PCR扩增；
若扩增产物的长度为900～1000bp，则待测样品为翅萼石斛；
若扩增产物的长度为400～500bp，则待测样品为黑毛石斛。
在本发明中，所述待测样品优选包括新鲜组织和/或DNA未降解的干品组织；所述新鲜组织或干品组织分别优选包括根、茎、叶和花中的一种或多种。
在本发明中，所述PCR扩增的反应程序优选包括：95℃预变性5min；95℃变性30s；56℃退火30s，72℃延伸50s，30个循环；72℃延伸10min。
在本发明中，所述PCR扩增的反应体系以20μL计，优选包括模板0.5μL、上游引物1μL、下游引物1μL、10×TaqBuffer2.0μl、Taq酶0.2μl、dNTPMix 1.6μl和剩余ddH2O；所述上游引物和下游引物的浓度均优选为10μmol/L；所述模板的浓度优选为50～200ng/μl，更优选为100ng/μl；所述Taq酶的酶活优选为5U、所述dNTP Mix的浓度优选为2.5mmol/L。本发明对所述PCR扩增反应体系的各个试剂来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。本发明及实施例所使用的Taq酶优选购自北京全式金生物技术股份有限公司生产的货号为AS221-01的2×TransStartFastPfuPCR SuperMix(-dye)。
在本发明中，所述扩增产物的鉴定方法优选包括电泳或测序。本发明对所述电泳或测序的方法没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的方法即可。在本发明及实施例中优选采用Sanger双向测序的方法对扩增产物进行测序。
在本发明中，当鉴定方法为测序时，若扩增产物的序列与CE序列一致的支持率大于99％，则待测样品为翅萼石斛；所述CE序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：AAAAAAGATTTTAAAAAAGATTGAAATTCTTCATTTTCAAATGGAAGTATAGCACTAGCTTCAGTTATTTTTCTTTGTAGCGAATAAGCATTTAGTTCATTATAATGAAAAAAACAAAACTAAGAAGATGGTGTTTTCTTTGGGTACATCAGTTATAAGTGTAGTAAGAGTCAAAAGTTTTGGATAATGACTTTTTGCCCCGGATCCTTTTTTTATTCTACCTCTCTTCCTGATTAGGAATAAGCATCCCTCTATCGACAAGATAAAAAAGGATTTCTTTCTCCTTCCGAGAAATCCGGGAAATAAAAAGAAAATATGAAATAAAAAGAAAGAAGAAATCTCAAATCAAATAAAGAAAATAGAAATCTTCAAATAACAAATAAGAAGAATATAGAAGTTCTTTCTATTTAGCGAGAACCCCCGTTTTTCACTAGGAATCCCTTTTTGTTGAATAAGATTGGTTAAAGTCGGGAACTCCTAAGAAACTCTTTTCTATCTTTCCTTTCAAAACACCTTTTTGTTTTGAAAGGAAAGATAGAAAGACGATGAAGATAAGGATGGGAGAAGAAGAATCCAATTTCTGAAAGCGGATTCTCATACATATTCGTGTAGAAAGAGGAATAGGTACACTTCATTTAGTTCTACATTCGTTATTTATTCTGAAATACTTCATATTAAGATTATCTTAATATTCTATCTAATAGATAGACTTATCATAAGATATCTTTATAATTATAATTTAGAATTATAATAGGTACAAATATGAAATCGAGGTACCCATTCTATGATAGATTTGAACTTTCCCTCTATTTTTGTTCCTTTAGTGGGCCTAGTCTTTCCGGCAATCGCAATGGCTTCTTTATCTCTTTATGTCCAAAGAAATAAGATTGTTTAAATACGATGGAACCAAATCTCATCAATTTATTTCAACACTGGATCATCATACAGATACTCTTTTAATGG；
若扩增产物的序列与HM序列一致的支持率大于99％，则待测样品为黑毛石斛；所述HM序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：ATCAAGATTAAAAAAAGATTTTAAAAAAGATTGAAATTCTTCATTTTCAAAAGGATGGGAGAAGAAGAATCCAATTTCTGAAAGCGGATTCTCATACATATTCGTGTAGAAAGAGGAATAGGTACACTTCATTTAGTTCTACATTCGTTATTTATTCTGAAATACTTCATATTAAGATTATCTTAATATTCTTTCTAATAGATAGACTTATCATAAGATATCTTTATAATTATAATTTAGAATTATAATAGGTACAAATATGAAATCGAGGTACCCATTCTATGATAGATTTGAACTTTCCCTCTATTTTTGTTCCTTTAGTGGGCCTAGTCTTTCCGGCAATCGCAATGGCTTCTTTATCTCTTTATGTCCAAAGAAATAAGATTGTTTAAATACGATGGAACCAAATCTCATCAATTTATTTCAACACTGGATCATCATACAGATACT。
本发明利用上述引物对对未知的石斛样品的总DNA进行PCR扩增，根据扩增产物的电泳结果可判断未知样品是翅萼石斛还是黑毛石斛；另外，本发明通过对扩增产物进行测序，将扩增到的未知样品的序列与翅萼石斛和黑毛石斛标准样品的叶绿体基因accD基因3'末端到pafII基因5'端(包括accD基因与psaI基因的间隔区、psaI基因、psaI基因和pafII基因间隔区)序列比对，根据比对的序列一致性结果即可进一步准备判断未知样品是翅萼石斛还是黑毛石斛。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种特异性区分翅萼石斛和黑毛石斛的引物对、试剂盒及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种特异性区分翅萼石斛和黑毛石斛的引物对，所述引物对由上游引物F和下游引物R组成；所述上游引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：CTTCCCTTGAATCAAGATTA，所述下游引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：CATATCATATATCCTGCCAT。
实施例2
一种区分翅萼石斛和黑毛石斛的方法，由以下步骤组成：
1、对待鉴定的样品进行总DNA提取
(1)称取2g新鲜的样品叶片，用灭菌的蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分；
(2)用灭菌的剪刀将叶片叶脉去掉，剪碎置于研钵中，加入液氮快速研磨成粉末状，转入2mL离心管，加入65℃预热的CTAB提取液900μL充分混匀，65℃保温40min，在此期间轻轻颠倒离心管几次；
(3)水浴完后，冷却至室温，加入等体积的混合液(混合液为氯仿和异戊醇的混合物，其中氯仿和异戊醇的体积比为24:1)轻轻摇动，使之充分混合，形成乳状液，12000r/min离心10min；
(4)离心管中出现3层，用移液器小心地将上层清液吸入另一干净的离心管中，弃去中间层的细胞碎片和变性蛋白以及下层的氯仿；加入等体积的混合液(混合液为氯仿和异戊醇的混合物，其中氯仿和异戊醇的体积比为24:1)轻轻摇动，使之充分混合，形成乳状液，12000r/min离心10min；
(5)小心吸出上清液于另一2mL离心管中，加入0.6倍上清液体积的异丙醇(异丙醇用前需预冷)，缓慢混匀，于-20℃冰箱中沉淀DNA；
(6)12000r/min离心10min，去上清液，加入70％(V/V)的乙醇溶液洗涤2～3次获得纯化的DNA样品；
(7)12000r/min离心3min去掉乙醇，倒置离心管在干净的吸水纸上，静置至自然干燥或者直接使用真空干燥；
(8)使用50μLTE缓冲液溶解DNA，加入3～5μl RNA酶除去RNA；
(9)DNA溶液在分光光度计上测定浓度和纯度，最终浓度保持在100ng/μl。
2、PCR扩增
以步骤1提取的总DNA为模板，利用实施例1设计的引物对配制PCR反应体系，进行PCR扩增；扩增体系为20μl：10×Taq Buffer 2.0μl、Taq酶(5U)0.2μl、dNTP Mix(2.5mmol/L)1.6μl、上/下游引物各1μl(10μmol/L)、DNA模板0.5μl、ddH2O 13.7μl；所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s；56℃退火30s，72℃延伸50s，30个循环；72℃延伸10min。
3、扩增产物判断
将步骤2中得到的PCR扩增产物进行凝胶电泳检测，判断结果如下：
若扩增产物的电泳条带为900～1000bp，则待测样品为翅萼石斛；
若扩增产物的电泳条带为400～500bp，则待测样品为黑毛石斛。
利用翅萼石斛(CE)和黑毛石斛(HM)标准品进行上述检测，检测结果见图1。
由图1可知，本发明提供的方法可以准确地区分翅萼石斛和黑毛石斛。
实施例3
一种与实施例2相似的方法，唯一区别在于，将步骤3中的电泳检测方法替换为测序对比，具体如下所示：
将步骤2中得到的PCR扩增产物在ABI3700测序仪上Sanger双向测序，测序引物为实施例1设计的引物对；
将测序所得序列与CE序列和HM序列进行比对，其中所述CE序列如SEQ ID NO.3所示，所述HM序列如SEQ ID NO.4所示；
若扩增产物的序列与CE序列一致的支持率大于99％，则待测样品为翅萼石斛；
若扩增产物的序列与HM序列一致的支持率大于99％，则待测样品为黑毛石斛。
对比例1
为了获得区分度较好的特异性引物，本发明将翅萼石斛(CE)和黑毛石斛(HM)标准品的全长叶绿体基因组进行了全局比对，使用的软件是VectorNTI中的Align模块。根据两个样本的差异情况，人工选择候选区域，有针对性地设计了6对引物，引物具体的信息如表1和表2所示；
表1 6对引物具体序列
引物 序列信息(5’-3’) SEQ ID
1-F GCGTATGCTGTATGTAGTATA NO.5
1-R TTCCAAAGTCAAAAGAGTG NO.6
2-F CAACCCAAATCTGATATTGA NO.7
2-R TTGAACCCTCACGATTTAA NO.8
3-F CTTCCCTTGAATCAAGATTA NO.1
3-R CATATCATATATCCTGCCAT NO.2
4-F AAGAAATCTCAGATAGAATCGACG NO.9
4-R CGCAAAAATGGGATATGCAT NO.10
5-F ATGGAAACGTAACAATGGTT NO.11
5-R TCTATACCCGATAAGTACCAAT NO.12
6-F GTCTGATACAAAATCCCTTT NO.13
6-R AGTTGGAACTTTAGGTGGTT NO.14
表2 6对引物具体序列、位置及扩增产物大小
说明：引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
采用与实施例2相似的方法(唯一区别在于：PCR扩增的反应程序中退火温度为52℃)对翅萼石斛(CE)和黑毛石斛(HM)标准品进行鉴定，鉴定结果见图2。
由图2可知，primer3引物对(引物3-F和3-R，即实施例1设计的引物对)可以很直观清楚的区分翅萼石斛和黑毛石斛。
应用例1
新购买一株样品，商家称该样品为翅萼石斛，但未在花期，无法判定是翅萼石斛还是黑毛石斛，利用实施例3提供的方法进行检测，结果表明该未知样品测序所得序列与黑毛石斛标准样HM序列一致的支持率为99.1％，样品开花后，经形态鉴定，为黑毛石斛。因此，本发明提供的方法可以准确地鉴定未知石斛样品为黑毛石斛。
应用例2
有两种样品A和B，商家称一种为翅萼石斛，一种为黑毛石斛，但是具体哪个样品是哪个种，已混淆，又无法从外观判定。利用实施例3提供的方法进行检测，结果表明：A样品测序所得序列与标准样品翅萼石斛CE序列一致的支持率为99.2％，A样品为翅萼石斛；B样品测序所得序列与黑毛石斛标准样HM序列一致的支持率为99.5％，B样品为黑毛石斛；样品开花后，经形态鉴定，A样品为翅萼石斛，B样品为黑毛石斛，形态鉴定结果和本发明提供的方法鉴定结果一致，因此本发明提供的方法可以准确地区分翅萼石斛和黑毛石斛。
综上所述，本发明提供的引物对可以特异性区分翅萼石斛和黑毛石斛，可以在不是花期的时候也能准确鉴定翅萼石斛和黑毛石斛。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 贵州省林业科学研究院
<120> 一种特异性区分翅萼石斛和黑毛石斛的引物对、试剂盒及其应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cttcccttga atcaagatta 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
catatcatat atcctgccat 20
<210> 3
<211> 963
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaaaaagatt ttaaaaaaga ttgaaattct tcattttcaa atggaagtat agcactagct 60
tcagttattt ttctttgtag cgaataagca tttagttcat tataatgaaa aaaacaaaac 120
taagaagatg gtgttttctt tgggtacatc agttataagt gtagtaagag tcaaaagttt 180
tggataatga ctttttgccc cggatccttt ttttattcta cctctcttcc tgattaggaa 240
taagcatccc tctatcgaca agataaaaaa ggatttcttt ctccttccga gaaatccggg 300
aaataaaaag aaaatatgaa ataaaaagaa agaagaaatc tcaaatcaaa taaagaaaat 360
agaaatcttc aaataacaaa taagaagaat atagaagttc tttctattta gcgagaaccc 420
ccgtttttca ctaggaatcc ctttttgttg aataagattg gttaaagtcg ggaactccta 480
agaaactctt ttctatcttt cctttcaaaa cacctttttg ttttgaaagg aaagatagaa 540
agacgatgaa gataaggatg ggagaagaag aatccaattt ctgaaagcgg attctcatac 600
atattcgtgt agaaagagga ataggtacac ttcatttagt tctacattcg ttatttattc 660
tgaaatactt catattaaga ttatcttaat attctatcta atagatagac ttatcataag 720
atatctttat aattataatt tagaattata ataggtacaa atatgaaatc gaggtaccca 780
ttctatgata gatttgaact ttccctctat ttttgttcct ttagtgggcc tagtctttcc 840
ggcaatcgca atggcttctt tatctcttta tgtccaaaga aataagattg tttaaatacg 900
atggaaccaa atctcatcaa tttatttcaa cactggatca tcatacagat actcttttaa 960
tgg 963
<210> 4
<211> 450
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atcaagatta aaaaaagatt ttaaaaaaga ttgaaattct tcattttcaa aaggatggga 60
gaagaagaat ccaatttctg aaagcggatt ctcatacata ttcgtgtaga aagaggaata 120
ggtacacttc atttagttct acattcgtta tttattctga aatacttcat attaagatta 180
tcttaatatt ctttctaata gatagactta tcataagata tctttataat tataatttag 240
aattataata ggtacaaata tgaaatcgag gtacccattc tatgatagat ttgaactttc 300
cctctatttt tgttccttta gtgggcctag tctttccggc aatcgcaatg gcttctttat 360
ctctttatgt ccaaagaaat aagattgttt aaatacgatg gaaccaaatc tcatcaattt 420
atttcaacac tggatcatca tacagatact 450
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcgtatgctg tatgtagtat a 21
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttccaaagtc aaaagagtg 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caacccaaat ctgatattga 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttgaaccctc acgatttaa 19
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aagaaatctc agatagaatc gacg 24
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgcaaaaatg ggatatgcat 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atggaaacgt aacaatggtt 20
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tctatacccg ataagtacca at 22
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gtctgataca aaatcccttt 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
agttggaact ttaggtggtt 20

Claims (10)

1.一种特异性区分翅萼石斛和黑毛石斛的引物对，其特征在于，所述引物对包括上游引物F和下游引物R；所述上游引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种特异性区分翅萼石斛和黑毛石斛的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对。
3.权利要求1所述引物对或权利要求2所述试剂盒在区分翅萼石斛和黑毛石斛中的应用。
4.一种区分翅萼石斛和黑毛石斛的方法，其特征在于，包括以下步骤：
以待测样品基因组DNA为模板，利用权利要求1所述引物对或权利要求2所述试剂盒配制PCR反应体系，进行PCR扩增；
若扩增产物的长度为900～1000bp，则待测样品为翅萼石斛；
若扩增产物的长度为400～500bp，则待测样品为黑毛石斛。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序包括：95℃预变性5min；95℃变性30s；56℃退火30s，72℃延伸50s，30个循环；72℃延伸10min。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系以20μL计，包括模板0.5μL、上游引物1μL、下游引物1μL、10×TaqBuffer2.0μl、Taq酶0.2μl、dNTPMix 1.6μl和剩余ddH2O。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述上游引物和下游引物的浓度均为10μmol/L；所述模板的浓度为50～200ng/μl。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述Taq酶的酶活为5U、所述dNTPMix的浓度为2.5mmol/L。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述扩增产物的鉴定方法包括电泳或测序；
当鉴定方法为测序时，若扩增产物的序列与CE序列一致的支持率大于99％，则待测样品为翅萼石斛；所述CE序列如SEQ ID NO.3所示；
若扩增产物的序列与HM序列一致的支持率大于99％，则待测样品为黑毛石斛；所述HM序列如SEQ ID NO.4所示。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述待测样品包括新鲜组织和/或DNA未降解的干品组织。
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CN1372005A (zh) * 2001-08-03 2002-10-02 中国药科大学 中国石斛属植物及其药材的dna分子鉴别方法
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Title
Molecular Identification of Dendrobium Species (Orchidaceae) Based on the DNA Barcode ITS2 Region and Its Application for Phylogenetic Study;Shangguo Feng等;Int. J. Mol. Sci.;第16卷;21975-21988 *

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