CN108396070A - 一种使用叶绿体dna条形码对罂粟的鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基于植物叶绿体基因DNA条形码对罂粟科罂粟属罂粟(鸦片)的鉴定方法。该方法通过广泛调查罂粟属植物的分布区，采集到多个地点的样品，构建该属植物的叶绿体序列的数据库，通过比对发现了罂粟特有的信息位点：在总长2645bP的序列中，第105bp为A,第121bp为A,第333bp为A,第748bp为T,第1539bp为G,第1751bp为A,第2392bp为G,第2604bp为A。利用上述位点与其他物种的差异即可快速准确地鉴定出罂粟。

Description

一种使用叶绿体DNA条形码对罂粟的鉴定方法
技术领域
本发明属于分子鉴定技术领域，具体涉及一种叶绿体DNA分子条形码的鉴定方法，对罂粟(Papaver somniferum)进行DNA条形码测序及分子鉴定。
背景技术
罂粟(Papaver somniferum L.)，又名鸦片、大烟，与大麻、古柯并称为世界三大毒品植物，一直是禁忌，被严格控制栽培和使用。其原产于南欧，为罂粟科(Papaveraceae)罂粟属(Papaver L.)植物。罂粟科约有700多个种，而罂粟属约有100个种。主要分布于欧洲至亚洲温带，少数种产于美洲、大洋洲和非洲。我国有7个种，分别为：罂粟(Papaversomniferum)、虞美人(P.rhoeas)、黑环罂粟(P.pavoninum)、长荚罂粟(P.dubium)、野罂粟(P.nudicaule)、灰毛罂粟(P.canescens)和长白山罂粟(P.radicatum)，主要分布于东北、西北、宁夏和内蒙古等地。该属植物花型优美，花色艳丽，多数为庭园栽培供观赏。如常见的种为虞美人，开花期长，花大，色彩鲜艳，其植株外形，花型与罂粟较为相似，二者无明显的可区别的形态特征。常被混淆，视为同种。但虞美人以及该属的其他种植物并未发现其具有成瘾的作用。这给公安机关缉毒、鉴定、取证等工作带来很大的干扰，造成了国家不必要的损失。
DNA条形码技术(DNA Barcoding)是一种快速鉴定物种的技术，其主要的手段是通过物种的DNA分子序列的几种片段测序，准确的区分几种相似的物种。近十年来，DNA条形码被大量使用在生物鉴定工作中，并被证明是行之有效的方法，其极大的解决了传统鉴定工作中的出现的较为相识物种无法辨认的漏洞，也对鉴定工作中鉴定人员出现的对数量性状的认知常常因人而异的现状，做出了更为客观、准确、公正、快速的补充。由于matK、psbA-trnH、rbcL和trnL-trnF四个片段在高等植物叶绿体基因组中具有较高的进化速率，遗传变异大，在大多数的植物内群中，常用于植物科、属水平的鉴定研究。
目前，在对罂粟(鸦片)的鉴定工作，除了请专业的研究人员来鉴定区别。还没有使用分子的手段来进行鉴定的报道。现有鉴定方法存在着大量时间的花费，人力、物力资源的浪费的问题，也存在着可靠性差，准确率低，甚至不安全的情况。
发明内容
有鉴于此，为了克服现有技术存在的上述缺点，本发明的目的在于提供一种较为明确、快速、可靠的基于罂粟属植物DNA条形码，并利用该DNA条形码鉴定罂粟(鸦片)的方法，来提高鉴定结果的可靠性、安全性和准确性。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
基于植物叶绿体基因DNA条形码对罂粟科罂粟属罂粟的鉴定方法，使用罂粟属植物的叶绿体基因来检测罂粟，并找到罂粟的特有碱基作为它与罂粟属植物的序列差异的信息位点，由这些特征信息位点来区分罂粟属中与罂粟相似的植物。
根据所述的基于植物叶绿体基因DNA对罂粟科罂粟属罂粟的鉴定方法，其中所述的罂粟的叶绿体DNA条形码基因总长为2645bP的序列，第105bp为A,第121bp为A,第333bp为A,第748bp为T,第1539bp为G,第1751bp为A,第2392bp为G,第2604bp为A。根据所述的基于植物叶绿体基因DNA对罂粟科罂粟属罂粟的鉴定方法，其中所述DNA条形码的序列如matK、psbA-trnH、rbcL和trnL-trnF四个片段所示。
本发明同时提供了一种基于植物叶绿体基因DNA条形码对罂粟科罂粟属罂粟的鉴定方法，该方法主要包括下述步骤：
(1)提取待测样本DNA；
(2)利用DNA条形码引物进行PCR扩增，得到扩增产物，所述的DNA条形码引物序列为matK、psbA-trnH、rbcL和trnL-trnF四个片段；
(3)对所述扩增产物进行测序，按照下列特异性位点进行罂粟植物的物种鉴定，罂粟的特征位点为：总长2645bP的序列中，第105bp为A,第121bp为A,第333bp为A,第748bp为T,第1539bp为G,第1751bp为A,第2392bp为G,第2604bp为A；
(4)对待测的疑似罂粟物种的扩增产物进行测序，如果符合上述(3)所列条件，则该待测样本为罂粟；如果不符合上述(3)的条件，则该待测样本不是罂粟。
根据所述的基于植物叶绿体基因DNA条形码对罂粟科罂粟属罂粟的鉴定方法，其中所述PCR的扩增体系为25μL，体系包含Mg Cl 2 2.0μL，d NTP 2.0μL，PCR缓冲液2.5μL，引物各1.0μL，ex Taq酶1.25U，总DNA 2.5μL；所述PCR的扩增条件为：94℃变性5min，1个循环；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸45s，进行30个循环；72℃延伸10min。
根据所述的基于植物叶绿体基因DNA条形码对罂粟科罂粟属罂粟的鉴定方法，其中所述测序为双向测序，所述的测序引物为matK、psbA-trnH、rbcL和trnL-trnF四个片段所示；所述测序的反应体系为5μL：其中ddH2O 3μL，10μmol/L测序引物0.5μL，测序反应混合物0.5μL，PCR纯化产物1μL；所述测序的反应条件为：94℃预变性10s；94℃变性30s，50℃退火5s，60℃延伸4min,进行30个循环。
本发明同时还提供了一种基于大数据的罂粟DNA条形码，所述的罂粟DNA条形码为由引物序列matK、psbA-trnH、rbcL和trnL-trnF四个片段，得到的总长为2645bP的序列，第105bp为A,第121bp为A,第333bp为A,第748bp为T,第1539bp为G,第1751bp为A,第2392bp为G,第2604bp为A。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明通过对中国分布的罂粟属植物进行采样，并采用了多个个体，构建了中国分布的罂粟属植物叶绿体DNA条形码大数据库，然后通过比较发现罂粟属植物叶绿体DNA条形码序列特有信息位点，进一步获得其特有的DNA条形码。
本发明首次使用分子DNA条形码的方法来鉴定中国分布的罂粟属植物中罂粟特有的信息位点，通过对matK、psbA-trnH、rbcL和trnL-trnF四个片段进行PCR扩增和测序，直接获得鉴定结果，检测过程快速，结果准确性高，该方法大大有利于缉毒工作的快速、有效鉴定鸦片(罂粟)。
附图说明
图1为罂粟属部分植物样品的PCR扩增产物图谱，其中，右“1”为GeneRuler 100bpPlus DNA Ladder；
图2-1至2-4为罂粟属植物的部分样品比对序列结果，其中图2-1为部分罂粟属植物的trnH序列；图2-2为部分罂粟属植物的matK序列；图2-3为部分罂粟属植物的rbcL序列；图2-4为部分罂粟属植物的trnL序列。
具体实施方式
下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
实施例1
本发明通过对中国分布的罂粟属植物广泛取样，尽可能增加个体数，构建该属植物的叶绿体DNA条形码数据库，通过比较发现罂粟(鸦片)的DNA条形码特有信息位点，进一步获得其特有的DNA条形码。
本发明的罂粟DNA条形码是由matK、psbA-trnH、rbcL和trnL-trnF四个片段扩增得到的总长为2645bp。在该序列中，特异性识别位点分别为：第105bp为A,第121bp为A,第333bp为A,第748bp为T,第1539bp为G,第1751bp为A,第2392bp为G,第2604bp为A。本发明的扩增引物采用的是普通的DNA条形码通用引物，扩增得到的2645bp的序列中有8个特异性识别位点，根据上述特异性位点的碱基种类即可鉴定罂粟(鸦片)。
本发明的罂粟DNA条形码是基于该属在中国分布的所有种的DNA分子序列测序得到的，考虑到同一个属中的不同种存在个体间变异较小的情况，是一种基于大数据的罂粟DNA条形码。采用本发明的上述罂粟DNA条形码能够快速、准确的对罂粟进行鉴定，克服传统分类鉴定中出现的可靠性差的缺陷。
本发明通过对待测样本的DNA进行提取，通过对扩增产物进行测序，将扩增产物的序列与本发明罂粟DNA条形码中的特异性识别位点进行比较，直接获得鉴定结果。该检测过程快速，准确性高，可用于罂粟(鸦片)的快速鉴定。
本发明中，待测样本的DNA提取方法采用本领域中技术人员所熟知的方法。在本发明具体实施时，采用了改良2×CTAB法提取待测样本的总DNA。本发明对待测样本中DNA来源没有特殊要求，可以用待测样本的叶子、根、茎。
本发明中的PCR扩增及扩增引物进行测序时所用的序列均为通用序列,具体为：
trnH:5’-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3’
bsbA:5’-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3’
matK(F):5’-CGATCTATTCATTCAATATTTC-3’
matK(R):5’-TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT-3’
rbcL(F):5’-ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC-3’
rbcL(R):5’-GTYAAATCAAGTCCACCYCG-3’
trnF:5’-ATT TGA ACT GGT GAC ACG AG-3’
trnL:5’-CGA AAT CGG TAG ACG CTA CG-3’
本发明中，PCR扩增方法及对扩增产物进行测序的方法采用本领域技术人员所熟知的方法即可。
本发明优选采用25μL的PCR扩增体系,体系配比如下：25mmol/L 10×PCR buffer2.5μL,2.5mM Mgcl2 2.0μL,2.5mM dNTPs 2.0μL,5unit/μL Taq DNA聚合酶0.25μL,10μmol/L的两端引物各1.0μL,50～100ng/L模板DNA 1.0μL，ddH2O 14.75μL。本发明对扩增体系中的试剂来源没有特殊的限定，扩增体系中所用的试剂均可采用本领域技术人员所熟知的商用试剂。
PCR的扩增条件为：94℃预变性2min，1个循环；94℃变性30s，49℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。上述扩增体系及扩增条件下所有的备选样品DNA均能扩增出使用引物的序列。本领域技术人员可以在上述技术方案的基础上对扩增体系条件进行适当合理的调整。如改变扩增体系的体积、体系组成成分的浓度、调整扩增的温度及时间等条件，均属于本发明的保护范围。本发明优选对扩增产物进行纯化。采用本领域技术人员所熟知的纯化方法进行即可。若psbA-trnH引物扩增得到383bp、matK得到849bp、rbcL得到551bp和trnL-trnF得到862bp的产物，则待测样本通过测序比对特异性识别位点可确定是否为罂粟(鸦片)。
本发明对测序的方式没有特殊的限定，采用本领域技术人员所熟知的测序方法，使用单向测序或双向测序均可。本发明在具体的实施过程中，以严谨的态度，采取了双向测序的方法。
本发明中优选采用PCR的扩增体系为用5μL的测序反应体系：ddH2O 3μL，10μmol/L测序引物0.5μL，测序反应混合物0.5μL，PCR纯化产物1μL。实验过程中所使用的试剂均可采用本领域中所熟知的商用试剂。测序的反应条件优选为：96℃预变性10s，50℃退火5s，60℃延伸4min，33个循环。本领域技术人员可以在上述技术方案的基础上对测序反应体系条件进行适当合理的调整，如改变反应体系的体积、组分的浓度、测序的时间和温度等条件，均属于本发明的保护范围。反应完成后，将产物进行沉降、纯化、热变性后，上机进行测序。本发明对沉降、纯化、热变性及测序过程没有特殊限定，采用本技术领域人员所熟知的方法。
将测序结果与本发明的罂粟DNA条形码进行比对，若满足下列条件则待测样本为罂粟(鸦片)：第105bp为A,第121bp为A,第333bp为A,第748bp为T,第1539bp为G,第1751bp为A,第2392bp为G,第2604bp为A。
本发明采用通用引物及本领域技术人员均能操作的PCR扩增和测序方法即可对其进行快速鉴定，鉴定的过程省时、快速、准确性较高。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例子对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为本发明保护范围的限定。
实施例2：
1.罂粟属植物的标本采集和保护：
查阅文献和国内的标本馆的馆藏信息，根据DNA条形码的采样要求制定采样的方案，每个物种尽可能的采集其分布区内不同来源的个体，所有个体的叶片用硅胶干燥保存。罂粟属植物7个种，总的个体数为25个(含变种)个体的叶片材料，部分样品的序列信息从NCBI基因库下载(总165条序列)。其中，罂粟(鸦片)的样品来自新疆伊犁野外野生零星生长于树林边，每个地点各采集3份叶片样品。材料清单和样品来源见表1、2。
表1罂粟属植物标本及来源
表2罂粟属植物的引物和Genebank号
2.总DNA提取
利用改良的2×CTAB法提取上述罂粟属植物叶片的总DNA，具体步骤如下：
(1)使用干净的研钵、杵子高压灭菌、烘干、冷却；
(2)取用干净的叶片放入研钵中，用液氮冷却材料，待材料僵硬变脆后，用力研磨材料使之细如粉末，然后将研磨好的材料转移到预冷的2ml的离心管中；
(3)在2ml的离心管中加入1ml预热的2×CTAB提取液和2μLβ-巯基乙醇(2％V/V)，将材料完全放入提取液中，并充分混匀。放入65℃水浴锅中温浴约1.5小时，期间摇匀4-6次；
(4)将温浴材料取出后，加入等体积的氯仿异戊醇(体积比24：1)溶液，摇匀5-10分钟，然后以10000-12000转/分钟离心5分钟；
(5)将上清液(约700～800μL)转移到一新的离心管中(注意在吸取过程中避开杂质)；
(6)重复步骤(4)、(5)两次；
(7)将上清液(约450～600μL)转移到新的离心管中加入70％体积的异戊醇，沉降DNA，轻轻颠倒2～3次，可见白色絮状沉淀，4℃冰箱中静置30分钟以上，然后12000转离心5～10分钟，弃上清；
(8)用200μL的76％的乙醇和无水乙醇各洗2次，然后12000转离心5～10分钟，弃上清液。将离心管放入37℃烘箱中(或室温下)干燥，待乙醇挥发后，加入30～50μL TE溶液和1～2μL RNase A,并放入37℃的烘箱中用核糖核酸酶(RNase A)消化2～3小时，最后放入-20℃的冰箱中备用。
3.PCR扩增反应
DNA浓度用紫外分光光度计(UV-VIS spectrophotometer(TU-1800))检测，最后稀释到50～100ng/μL备用。
采用下列引物扩增核糖体DNA序列：
trnH:5’-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3’
bsbA:5’-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3’
matK(F):5’-CGATCTATTCATTCAATATTTC-3’
matK(R):5’-TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT-3’
rbcL(F):5’-ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC-3’
rbcL(R):5’-GTYAAATCAAGTCCACCYCG-3’
trnF:5’-ATT TGA ACT GGT GAC ACG AG-3’
trnL:5’-CGA AAT CGG TAG ACG CTA CG-3’
PCR反应扩增体系,体系配比如下：25mmol/L 10×PCR buffer 2.5μL,2.5mMMgcl22.0μL,2.5mM dNTPs 2.0μL,5unit/μLTaqDNA聚合酶0.25μL,10μmol/L的两端引物各1.0μL,50～100ng/L模板DNA1.0μL，ddH2O 14.75μL。
在以下扩增条件下所有备筛选的引物均能成功扩增：94℃预变性2min，1个循环；94℃变性30s，49℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
对扩增产物进行纯化，方法按试剂盒(上海生工Sangon)说明操作。使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果证明，本发明扩增条件下所有备筛选的罂粟属样本引物均能成功扩增。部分样品电泳图谱参见图1。
4.扩增产物测序
测序反应试剂使用ABI公司的PRISM Dye Terminator CycleSequencingReaction Kit，双向测序。
测序反应体系为5μL：其中ddH2O 3μL,测序引物0.5μL(10μmol/L)，测序反应混合物(mix,Big Dye v3.1)0.5μL,PCR纯化产物1μL。
测序引物的序列使用步骤3中扩增引物序列，即matK、psbA-trnH、rbcL和trnL-trnF。
测序反应条件为：96℃预变性10s，50℃退火5s，60℃延伸4min，33个循
环；结束后加20μL沉降剂(无水乙醇：3M醋酸钠＝20：1)，4℃沉降过夜。
沉降产物经70％酒精纯化后加20μL ddH2O在95℃条件下变性2分钟后上样，在ABI3730自动测序仪上测序。
5.数据分析
运用Sequencher4.1.4和BioEdit(ver 7.0.0)对测序结果分别进行拼接和比对，矩阵中的插入缺失用“-”代替(本发明没有使用插入、缺失的变异)。构建罂粟属植物的叶绿体DNA条形码的矩阵，获得DNA条形码数据库。
6.序列比对及罂粟的序列特征
序列比对的结果为：整个矩阵总长为2645bp，由265条序列构成。其中，从NCBI下载165条，本发明获得100条，序列分属罂粟属7个种(含变种)25个个体。在矩阵中的罂粟所有样品的叶绿体DNA条形码信息识别位点为：在psbA-trnH引物中在105bp位置为A、在121位置为A、在333位置为A；matK引物中在605位置为G、在817位置为A；rbcL引物中在365位置为T；trnL-trnF引物中在609位置为G、在821位置为A。
如果只看单个物种的序列，所有不同来源的罂粟扩增序列一致，用引物matK、psbA-trnH、rbcL和trnL-trnF扩增得到的序列产物信息位点完全一致。
根据本发明所获得罂粟的特异信息位点可以作为罂粟的DNA条形码用于罂粟的鉴定。本发明的鉴定方法仅利用一般的通用性引物，通过PCR扩增和测序方法，通过上述8个特异性识别位点即可对罂粟进行快速鉴定。
实施例3
以药材种植区和野外所采集的无花无果的罂粟和其他罂粟属植株叶片为材料，采用实施例1的方法进行DNA提取，PCR扩增和测序，鉴定结果显示，在已知的罂粟植物所获得DNA条形码序列的第105bp为A,第121bp为A,第333bp为A,第748bp为T,第1539bp为G,第1751bp为A,第2392bp为G,第2604bp为A。而其他未知的罂粟属植物未见上述特异性位点，由此可以鉴定出罂粟样品。
本发明的序列表为本发明一条罂粟(Papaver somnferium)个体的trnH、matK、rbcL、trnL序列，其中与其它种的比较有7个碱基的缺失。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
本发明实施例中分析罂粟属植物共使用了25个个体。其中罂粟(Papaversomnferium)个体有5个，因这5个个体的序列基本一致，本发明仅在下面序列表中放入其中的一个个体的序列，该序列将trnH、matK、rbcL、trnL四个片段拼接在一起。罂粟的5个个体的序列与其它20个种的比较有13个碱基的缺失。
序列表
<110> 中国科学院昆明植物研究所
<120> 一种使用叶绿体DNA条形码对罂粟的鉴定方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2641
<212> DNA
<213> 罂粟（Papaver somnferium L.）(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 1
aavrsmnrmg gattcacaat ccactgcctt gatccacttg gctacatccg ccccctaata 60
tttaaatttt atatcactca aggttagata tttgagtagt tatctattaa ctttattaat 120
acttaaataa gtataagtat gttgtacaaa aaaagtaaat cctttcaata aaaggtacac 180
ttttttatgg aaataaaaca atactaaaac taaatgaagg agcaataccg accctcttga 240
tagaataaga gggtcggtat tgctccttca acttcaacgc ttcatataca ctaagacgga 300
agtcttatcc gtttgtggat ggagcttcaa cagcagctag gtctagaggg aagttgtgag 360
cattacgttc atgcataact tatttgatac aaactctttt tttttgaaga tccgctgtaa 420
taacgagaaa gatttctgca tatacgccca aatctatcga gaatatcaga atctgataaa 480
tcggcccaag ccggcttact aatgggatgc cctgaaacgt tacaaaattt cgttttagcc 540
aacgacccaa ccaaagaaat aattgggact ttggtatcaa acttcttaat acaaatatcc 600
attataaatg tactttctat catttgactc cttaccaccg aagggttaag tcgtacactt 660
gcaagatagc tcaaaagctc gagggaatga ttggataatt tatttatctt aattctatct 720
ggttgagacc acaaggaaaa attacattgc cataaattta caagattcca tttccattta 780
ttcatcaaaa gagtacttcc ctttgaagcc agaattgatt ttccttgata tctgacataa 840
tgcataaaag gatccttgaa caaccatagg aaggtctgaa aatcattact aaacactact 900
acaggatgct ccatttttcc atagaaattt attcgctcaa gaaggattct aaaagatgtt 960
gatcgtaaac gaaaagattg tttgcggaga aaaactaata tggattcgca ttcatataca 1020
tgagaattat ataggaagaa gaaaaagcgt tgattctcct ttgaaaaaaa ggaaattgct 1080
ttattttgag taataagact atagcaatta cgatactcat ggagaaagaa tcgcaataaa 1140
tgcaaagagg gaacatcttg tatccaagag cgtaggattt gaaccaagat ttccaaatgg 1200
acagggtagg gtattagtat atctgacagt gttggattca aagctggtgt taaagattac 1260
aaattgactt attatactcc tgactatgaa accaaggata ctgatatctt ggcagcattc 1320
cgagttactc ctcaacctgg agttccacct gaggaagcag gggccgcggt agctgccgaa 1380
tcttctactg gtacatggac aactgtgtgg accgatggac ttaccagcct tgatcgttac 1440
aaaggaagat gctacgacat cgagcccgtt gctggagaag acaatcaata tatttgttat 1500
gtagcttatc ctttagacct ttttgaagaa ggttctgtta ctaacatgtt tacttccatc 1560
gtgggtaatg tatttgggtt caaagcgctt cgtgctctac gtctggagga tctgcgaatt 1620
cctgttgctt atgttaaaac tttccaagga ccacctcacg gtatccaagt tgaaagagat 1680
aaattgaata agtatggtcg tcccctattg ggatgtacta ttaaaccaaa attggggtta 1740
tctgctaaga actacggtag ggcggtttat gaatgtctat actttatttg atacaaactc 1800
tttttttttg aagatccgct gtaataacga gaaagatttc tgcatatacg cccaaatcta 1860
tcgagaatat cagaatctga taaatcggcc caagccggct tactaatggg atgccctgaa 1920
acgttacaaa atttcgtttt agccaacgac ccaaccaaag aaataattgg gactttggta 1980
tcaaacttct taatacaaat atccattata aatgtacttt ctatcatttg actccttacc 2040
accgaagggt taagtcgtac acttgcaaga tagctcaaaa gctcgaggga atgattggat 2100
aatttattta tcttaattct atctggttga gaccacaagg aaaaattaca ttgccataaa 2160
tttacaagat tccatttcca tttattcatc aaaagagtac ttccctttga agccagaatt 2220
gattttcctt gatatctgac ataatgcata aaaggatcct tgaacaacca taggaaggtc 2280
tgaaaatcat tactaaacac tactacagga tgctccattt ttccatagaa atttattcgc 2340
tcaagaagga ttctaaaaga tgttgatcgt aaacgaaaag attgtttgcg gagaaaaact 2400
aatatggatt cgcattcata tacatgagaa ttatatagga agaagaaaaa gcgttgattc 2460
tcctttgaaa aaaaggaaat tgctttattt tgagtaataa gactatagca attacgatac 2520
tcatggagaa agaatcgcaa taaatgcaaa gagggaacat cttgtatcca agagcgtagg 2580
atttgaacca agatttccaa atggacaggg tagggtatta gtatatctga cacatgagtt 2640
g 2641

Claims (7)

1.基于植物叶绿体基因DNA对罂粟科罂粟属罂粟的鉴定方法，使用罂粟属植物的叶绿体基因来检测罂粟(鸦片)，并找到罂粟的特有碱基作为它与罂粟属植物的序列差异的信息位点，由这些特征信息位点来区分罂粟属中与罂粟相似的植物。
2.根据权利要求1所述的基于植物叶绿体基因DNA对罂粟科罂粟属罂粟的鉴定方法，其特征在于所述的罂粟的叶绿体DNA条形码基因总长为2645bP的序列，其中第105bp为A,第121bp为A,第333bp为A,第748bp为T,第1539bp为G,第1751bp为A,第2392bp为G,第2604bp为A。
3.根据权利要求1所述的基于植物叶绿体基因DNA条形码对罂粟科罂粟属罂粟的鉴定方法，其特征在于，所述DNA条形码的序列如matK、psbA-trnH、rbcL和trnL-trnF四个片段所示。
4.基于植物叶绿体基因DNA条形码对罂粟科罂粟属罂粟的鉴定方法，其特征在于该方法主要包括下述步骤：
(1)提取待测样本DNA；
(2)利用DNA条形码引物进行PCR扩增，得到扩增产物，所述的DNA条形码引物序列为matK、psbA-trnH、rbcL和trnL-trnF四个片段；
(3)对所述扩增产物进行测序，按照下列特异性位点进行罂粟植物的物种鉴定，罂粟的特征位点为：总长2645bP的序列中，第105bp为A,第121bp为A,第333bp为A,第748bp为T,第1539bp为G,第1751bp为A,第2392bp为G,第2604bp为A；
(4)对待测的疑似罂粟(鸦片)物种的扩增产物进行测序，如果符合上述(3)所列条件，则该待测样本为罂粟(鸦片)；如果不符合上述(3)的条件，则该待测样本不是罂粟。
5.根据权利要求4所述的基于植物叶绿体基因DNA条形码对罂粟科罂粟属罂粟的鉴定方法，其特征在于所述PCR的扩增体系为25μL，体系包含Mg Cl22.0μL，d NTP 2.0μL，PCR缓冲液2.5μL，引物各1.0μL，ex Taq酶1.25U，总DNA 2.5μL；所述PCR的扩增条件为：94℃变性5min，1个循环；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸45s，进行30个循环；72℃延伸10min。
6.根据权利要求4所述的基于植物叶绿体基因DNA条形码对罂粟科罂粟属罂粟的鉴定方法，其特征在于，所述测序为双向测序，所述的测序引物为matK、psbA-trnH、rbcL和trnL-trnF四个片段所示；所述测序的反应体系为5μL：其中ddH2O 3μL，10μmol/L测序引物0.5μL，测序反应混合物0.5μL，PCR纯化产物1μL；所述测序的反应条件为：94℃预变性10s；94℃变性30s，50℃退火5s，60℃延伸4min,进行30个循环。
7.一种基于大数据的罂粟DNA条形码，其特征在于所述的罂粟DNA条形码为由引物序列matK、psbA-trnH、rbcL和trnL-trnF四个片段，得到的总长为2645bP的序列，第105bp为A,第121bp为A,第333bp为A,第748bp为T,第1539bp为G,第1751bp为A,第2392bp为G,第2604bp为A。
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