KR20180057214A - 마약성 양귀비류의 동시 판별용 멀티플렉스 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

마약성 양귀비류의 동시 판별용 멀티플렉스 프라이머 세트 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 양귀비류의 판별 방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 마약성 양귀비류의 동시 판별용 멀티플렉스 프라이머 세트 및 이를 이용한 마약성 양귀비의 판별 방법에 관한 것이다. 본 발명에 일실시예에 따른 마약성 양귀비의 판별 방법은 PCR 산물의 길이 차이만으로 마약성 양귀비류와 비마약성 양귀비류를 쉽게 구분할 수 있어 기존 식물 유전자 마커보다 수월성이 월등히 높고 상업적 활용성도 매우 높다.

Description

마약성 양귀비류의 동시 판별용 멀티플렉스 프라이머 세트 및 이의 용도{Multiplex Primer Set for Simultaneous Identifying Narcotic Poppy Species and Uses Thereof}
본 발명은 마약성 양귀비류의 동시 판별용 멀티플렉스 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
마약류는 인간의 정신과 육체를 지배하는 물질로서 중독성이나 탐닉성을 가지고 있어 신체와 정신을 파괴하는 약물로 개인에 한정되어 있지 않고 범죄와 연관되어 사회적으로 많은 해악을 끼치므로 대부분의 국가에서 생산, 소비 및 소지를 법으로 금지하고 있다. 국내에서도 마약성 양귀비류 재배는 법으로 금지되고 있지만 여전히 근절되지 않고 법망을 피해 암암리에 재배되고 있는 것이 현실이다. 마약류는 크게 생물체 특히, 식물에서 유래하는 천연마약과 화학적 합성으로 만들어지는 합성마약으로 구분되는데, 양귀비류는 천연마약으로 모르핀(morphine), 나르코틴 (narcotine), 코데인(codein), 티베인(thebaine), 파파베린(papaverine), 나르세인(narceine) 등 다양한 알칼로이드를 함유하는데, 마약성분인 모르핀은 마약성 양귀비류(Papaver somniferum)에서만 검출되는 것으로 알려져 있다.
양귀비류는 꽃이 아름다워 다양한 종이 원예종으로 재배되고 있으며, 또한 식품으로도 널리 이용되어 왔는데, 마약성분이 거의 없는 종임에도 불구하고 형태적으로는 마약성이 강한 종과 매우 유사하여 쉽게 구분되지 않는 것으로 알려져 있다.
양귀비류가 속하는 Papaver 속(genus)에는 110여종이 알려져 있으며(Hosokawa et al., Forensic Science International, 139:195-199, 2004) 국내에도 10여종이 서식하는 것으로 확인되고 있다. 이 중 마약성 양귀비류는 분류학적으로 Papaver somniferum 한 종이지만, 여러 아종(subspecies) 또는 품종을 포함하고 있어(예: Papaver somniferum subsp. somniferum , Papaver somniferum subsp. setigerum, Papaver somniferum subsp. paeoniflorum , Papaver somniferum subsp. laciniatum, Papaver somniferum subsp. neuga) 여러 종으로 인식되기도 한다.
따라서, 형태에 의존한 전통적인 방법만으로는 비마약성 양귀비류와 법으로 규제되는 마약성 양귀비류를 판별하는 데는 한계가 있다. 또한, 마약 단속에서 획득되는 재료는 식물체 전체가 아닌 씨앗이나 일부 조직 또는 추출된 가공품인 경우가 많은데 이 경우에는 형태만으로는 종판별이 불가능하다.
한편, 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction : PCR)은 아주 적은 양의 DNA만을 갖고서도 특정 부위의 DNA 서열을 기하급수적으로 증폭할 수 있는 간단하고 편리한 방법으로, 증폭하고자 하는 DNA에 특이적으로 결합하는 서로 반대 방향의 두 종류의 프라이머와, 고온에서도 기능적으로 안정한 Taq DNA 중합효소(polymerase)를 사용하여 서로 다른 세 가지 온도의 순환과정인 변성 (Denaturation step), 결합(Annealing step), 연장(Extension step)을 반복적으로 실행함으로써 특정 DNA를 증폭하게 된다. 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용한 병원성 미생물의 검출방법은, 검출하고자 하는 목적 대상의 특이 유전자를 인식하는 프라이머를 이용하여 PCR 반응으로 이를 증폭 및 확인하게 되는데, 검출효율이 높아 검체 중에 미량으로 존재하는 목적 대상도 검출할 수 있다.
현재, 우리나라에서는 Papaver setigerum과 Papaver somniferum은 재배가 금지되어 있으며, 육안으로 구분하기 어려울 뿐만 아니라, 이들을 모두 동시에 진단하는 멀티플렉스 PCR 방법은 개발되지 않은 실정이다.
이러한 상황 하에서, 본 발명자들은 법으로 규제되는 마약성 양귀비류를 보다 신속하고 정확하게 동시 판별할 수 있는 방법을 개발하고자 예의노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 5 종의 마커를 동시에 증폭 가능한 단일튜브-멀티플렉스 PCR을 수행하기 위한 멀티플렉스 PCR용 프라이머 및 이의 최적 조건을 개발하였고, 보다 간편하고 정확하게 목적 양귀비류의 특이 유전자의 검출을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 일 목적은 마약성 양귀비 동시 판별용 단일튜브(single tube) 멀티플렉스(multiplex) PCR 용 프라이머 세트를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 마약성 양귀비 동시 판별용 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 마약성 양귀비 동시 판별용 키트를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 마약성 양귀비 동시 판별 방법을 제공하는 데 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 및 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트;를 포함하는 마약성 양귀비 동시 판별용 단일튜브(single tube) 멀티플렉스(multiplex) PCR 용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명자들은 양귀비의 마약성분인 코데인(codeine)과 모르핀(morphine)의 생합성 과정에 관여하는 생합성 효소들에 해당되는 유전자를 타겟으로 이용하여 보다 확정적으로 마약성 양귀비류를 동시 검출할 수 있다는 점에 착안하여 상기 유전자의 염기서열로부터 상응되는 프라이머를 제작하였다.
선정된 타겟 유전자들은 TYDC, NCS, BBE 및 SAT2이며, rbcL은 모든 식물 종에서 증폭되므로 양성 대조군으로 이용하였다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다.
또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "프라이머 세트"는 목적하는 유전자를 중합효소 연쇄반응을 통하여 증폭시키기 위하여 사용되는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 구성된 세트를 의미하며, 용어 "프라이머 쌍"과 호환된다.
본 발명의 프라이머들은 마약성 양귀비류의 검출에 사용될 수 있도록 하기 위한 본 발명의 목적상 상기 프라이머 세트 중, rbcL에 대한 검출용 프라이머 세트는 바람직하게는 rbcL 유전자(NCBI accession number: DQ912894)를 증폭시킬 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머로 구성될 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 rbcL 유전자의 5' 말단으로부터 1번째에서 23번째까지의 정방향 프라이머 및 동일한 유전자에서 425번째에서 446번째까지의 역방향 프라이머로 구성될 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성될 수 있다.
또한, BBE에 대한 검출용 프라이머 세트는 바람직하게는 BBE 유전자(NCBI accession number: AF025430)를 증폭시킬 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머로 구성될 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 BBE 유전자의 5' 말단으로부터 2579번째에서 2597번째까지의 정방향 프라이머 및 동일한 유전자에서 3077번째에서 3094번째까지의 역방향 프라이머로 구성될 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성될 수 있다.
또한, SAT2에 대한 검출용 프라이머 세트는 바람직하게는 SAT2 유전자(NCBI accession number: AF339913)를 증폭시킬 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머로 구성될 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 SAT2 유전자의 5' 말단으로부터 166번째에서 186번째까지의 정방향 프라이머 및 동일한 유전자에서 731번째에서 753번째까지의 역방향 프라이머로 구성될 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성될 수 있다.
또한, NCS에 대한 검출용 프라이머 세트는 바람직하게는 NCS 유전자(NCBI accession number: FJ200359)를 증폭시킬 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머로 구성될 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 NCS 유전자의 5' 말단으로부터 1번째에서 20번째까지의 정방향 프라이머 및 동일한 유전자에서 837번째에서 856번째까지의 역방향 프라이머로 구성될 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성될 수 있다.
또한, TYDC에 대한 검출용 프라이머 세트는 바람직하게는 TYDC 유전자(NCBI accession number: AF025431)를 증폭시킬 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머로 구성될 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 TYDC 유전자의 5' 말단으로부터 181번째에서 198번째까지의 정방향 프라이머 및 동일한 유전자에서 1544번째에서 1562번째까지의 역방향 프라이머로 구성될 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성될 수 있다.
본 발명의 상기 각 특이 프라이머들은 구성염기 서열의 일부가 변경될 수 있다. 이와 같은 변경은 구성염기 서열의 일부결실, 부가, 치환, 또는 이들의 복합적인 것으로 구현될 수 있으나, 이러한 구성염기 서열의 일부 변경은 특이 프라이머들의 주형(cDNA 또는 PCR 증폭산물들)과의 특이적 결합을 훼손할 수 있기 때문에 적용에 있어 상당한 주의를 요한다. 이때에는 반드시 특이성을 훼손하지 않는 범위 내에서 실험적으로 조사되어 변경되어야 한다. 이는 당업자에게는 일반적인 사항이므로 이에 대한 상세한 설명은 생략한다. 본 발명에서 제시된 프라이머들의 서열을 유지하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 프라이머 세트는 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하기 위한 프라이머 세트이며, 가장 바람직하게는 멀티플렉스 PCR을 실시하기 위한 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 프라이머 세트는 파파베르 세티게룸(Papaver setigerum), 파파베르 솜니페룸(Papaver somniferum), 파파베르 파에오니플로룸(Papaver paeoniflorum), 파파베르 라시니아툼(Papaver laciniatum) 및 파파베르 뉴가(Papaver neuga)로 이루어진 군으로부터 선택된 2 종 이상의 마약성 양귀비를 동시에 검출할 수 있으며, 가장 바람직하게는 Papaver setigerum 및 Papaver somniferum이다.
본 발명의 명세서에 있어서, 용어 '멀티플렉스 PCR(multiplex PCR)'은 복수의 프라이머 쌍을 동시에 사용하여, 복수의 표적 유전자를 같은 반응액 중에서 증폭하는 방법이다.
상기 프라이머 설계시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3 회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg2+의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.
또한, 본 발명에서와 같이 2 종 이상의 프라이머 쌍을 혼합하여 동시에 PCR을 수행함으로써 대상 시료 내 2 종이상의 마약성 양귀비 판별 여부를 1회에 확인하는 멀티플렉스 PCR 반응에서는, 프라이머 설계시 단독 PCR의 경우와 같은 조건이 더욱 엄격하게 요구되며, 또한 반응완료 후 겔 상에서 증폭되는 유전자 산물의 구별을 위해서는 유전자 산물의 크기가 각각 구별이 되어야 하는 크기의 제약까지 따른다. 반응조건의 설정에 있어서도 한번에 PCR 하고자 하는 프라이머 모두에 대한 공통의 반응조건이 설정되어야 하므로, 단독 PCR에 비해서 매우 어려운 조건 설정 과정이 요구된다.
본 발명에서 제공하는, 상기 프라이머 세트는 이러한 멀티플렉스 PCR에 적합하도록 개발된 것으로서, 상기 5 종의 프라이머 쌍들은 특정 마약성 양귀비의 종류를 알아내는데 사용될 수 있다.
또한, 상기 5 종의 프라이머 세트들은 공통의 완충액의 농도 및 중합효소의 농도 조건을 가지므로, 동일 PCR 튜브에서 1회의 PCR로 마약성 양귀비인 Papaver setigerum 및 Papaver somniferum 2 종을 동시에 검출하는 단순 검출 및 동시 판별 에도 활용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 프라이머 세트를 포함하는 마약성 양귀비 동시 판별용 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 마약성 양귀비 동시 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 마약성 양귀비 검출 및 이의 특정 종류를 동시감별검출 키트로서, 상술한 특이 프라이머 세트가 하나의 튜브 방식에 적용되어 사용자는 하나의 키트를 사용하여 한 번의 반응을 통하여 마약성 양귀비 자체의 검출과 특정 종류의 마약성 양귀비류의 동시감별검출을 수행할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 멀티플렉스 PCR 반응 조건을 어닐링 온도 및 프라이머 비율의 측면에서 최적화하였다.
상기 멀티플렉스 PCR의 프라이머 어닐링 온도는 40℃~60℃일 수 있으며, 바람직하게는 45℃~55℃일 수 있고, 가장 바람직하게는 50℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 키트 내 상기 프라이머 세트의 혼합 비율은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트:서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트:서열번호 5의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트:서열번호 7의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트:서열번호 9의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트=1:20:20:25:40의 몰비(mole ratio)이다.
또한, 본 발명의 조성물 및 키트는, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 조성물 및 키트는 역전사 반응 및 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물 및 키트는, 검출 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 RNA로부터 상보적인 cDNA를 합성하기 위한 역전사 효소, 상보적인 DNA를 증폭하기 위한 DNA 중합효소, 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Hot start Taq-폴리머라아제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 각 튜브에 포함되는 성분들로는 이에 국한되지 않지만, 역전사 효소, DNA 중합효소, Tris-HCl, MgCl2, KCl, dATP, dTTP, dGTP, dCTP, RNase Inhibitor, DTT, 8-MOP 등을 제시할 수 있다. 이들은 적절한 농도 범위에서 포함되어야 하는데, 0.1-10 unit의 역전사 효소, 1-10 unit의 DNA 중합효소, 10-300 mM의 Tris-HCl, 1-50 mM의 MgCl2, 1-100 mM의 KCl, 1-5 mM의 dATP, 1-5 mM의 dTTP, 1-5 mM의 dGTP, 1-5 mM의 dCTP, 1-10 unit의 RNase Inhibitor, 0.001-0.1 M의 DTT, 0.5-5 ㎍의 8-MOP을 포함하는 것이 바람직하다.
한편, 각 튜브에 첨가된 성분들은 액상 형태로 제조할 수도 있고, 포함 성분들의 자유도를 낮추어 제품의 안정성(stability)을 제고하기 위해 건조된 형태로 제조할 수도 있다. 이러한 건조된 형태로의 제조를 위해서는 건조 단계의 적용이 필요하고, 이에 가온건조, 자연건조, 감압건조, 동결건조 또는, 이들의 복합 공정도 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 키트는 상술한 본 프라이머 세트를 이용하므로, 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 마약성 양귀비 동시 판별 방법을 제공한다:
(a) 시료에서 DNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR)을 실시하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 PCR은 멀티플렉스 방식으로 실시할 수 있으며, 어닐링 온도 및 프라이머 비율의 측면에서 최적화된 멀티플렉스 PCR 반응 조건을 이용한다.
상기 멀티플렉스 PCR의 프라이머 어닐링 온도는 40℃~60℃일 수 있으며, 바람직하게는 45℃~55℃일 수 있고, 가장 바람직하게는 50℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 프라이머 세트의 혼합 비율은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트:서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트:서열번호 5의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트: 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트:서열번호 9의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트=1:20:20:25:40의 몰비(mole ratio)이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 실시될 수 있다.
본 발명에 따르면, 당업계에 공지의 방법에 따라 시료로부터 DNA를 추출한 후, 추출된 DNA를 함유한 추출액에 본 발명의 프라이머 세트, 본 발명의 프라이머 세트가 포함된 조성물 또는 본 발명의 프라이머 세트가 포함된 키트를 이용하여 단일튜브 멀티플렉스 PCR을 실시한다. 단일튜브 멀티플렉스 PCR을 실시한 후에 얻어진 산물(반응액)에 대하여 통상적인 방법으로 아가로즈 젤 전기영동 분석을 실시하여 증폭산물의 생성 여부 및 그 크기에 근거하여 마약성 양귀비 2 종을 동시 검출하여 판정한다.
본 발명에서는 타겟 유전자 마커에 특이적으로 결합하는 신규한 프라이머 세트를 설계하고, 상기 프라이머 세트가 특정 마약성 양귀비 2 종에 대해 선택적으로 결합함을 확인함으로써, 상기 프라이머 세트를 이용하여 마약성 양귀비 2 종을 동시에 선택적으로 판별할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 방법은 상술한 본 프라이머 세트를 이용하므로, 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명에 따르면, 마약성 양귀비류를 쉽고 정확하게 구분할 수 있는 기술을 개발을 가능케 하며, 이를 통해 마약성 양귀비류의 밀수, 밀거래, 밀경의 유통 경로를 보다 정확하게 파악할 수 있고, 이를 통해서 범죄자 검거, 증거확보의 용이성이 높아질 수 있을 것이며, 천연마약의 확산을 차단하는데도 큰 역할을 할 수 있을 것이다.
도 1은 양귀비의 마약성분인 코데인(codeine)과 모르핀(morphine)의 생합성 과정에 관여하는 생합성 효소들을 보여준다.
도 2는 본 멀티플렉스 PCR 용 프라이머 비율 변화에 따른 검출 결과를 보여준다.
도 3은 본 멀티플렉스 PCR 용 프라이머로 양귀비과 7 종의 식물(Eschscholzia californica, E. mexicana, P. bracteatum, P. nudicaule, P. orientale, Paeo black, Paeo flemish)에 대해 멀티플렉스 PCR을 실시한 검출한 결과를 보여준다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 시료 확보 및 멀티플렉스- PCR 용 프라이머 제작
본 발명자들은 Papaver setigerum 및 Papaver somniferum의 동시 판별을 위하여, 시료 확보 및 목적의 멀티플렉스-PCR에 적합한 특이 프라이머를 제작하였고, 프라이머 세트의 서열을 하기 표 1에 나타내었다.
먼저, 도 1에 나타낸 바와 같이, 양귀비의 마약성분인 코데인(codeine)과 모르핀(morphine)의 생합성 과정에 관여하는 생합성 효소들(TYDC, NCS, CYP80B1, BBE, SAT2, COR) 중 일부를 타겟 유전자로 선정하였다.
상기 타겟 유전자들은 TYDC, NCS, BBE 및 SAT2이며, rbcL은 모든 식물 종에서 증폭되므로 양성 대조군으로 이용하였다.
rbcL에 대한 프라이머 세트는 rbcL 유전자(NCBI accession number: DQ912894)의 5' 말단으로부터 번째에서 번째까지의 정방향 프라이머(서열번호 1) 및 동일한 유전자에서 1번째에서 23번째까지의 역방향 프라이머(서열번호 2)를 포함하도록 하였다.
BBE에 대한 프라이머 세트는 BBE 유전자(NCBI accession number: AF025430)의 5' 말단으로부터 2579번째에서 2597번째까지의 정방향 프라이머(서열번호 3) 및 동일한 유전자에서 3077번째에서 3094번째까지의 역방향 프라이머(서열번호 4)를 포함하도록 하였다.
SAT2에 대한 프라이머 세트는 SAT2 유전자(NCBI accession number: AF339913)의 5' 말단으로부터 166번째에서 186번째까지의 정방향 프라이머(서열번호 5) 및 동일한 유전자에서 731번째에서 753번째까지의 역방향 프라이머(서열번호 6)를 포함하도록 하였다.
NCS에 대한 프라이머 세트는 NCS 유전자(NCBI accession number: FJ200359)의 5' 말단으로부터 1번째에서 20번째까지의 정방향 프라이머(서열번호 7) 및 동일한 유전자에서 837번째에서 856번째까지의 역방향 프라이머(서열번호 8)를 포함하도록 하였다.
TYDC에 대한 프라이머 세트는 TYDC 유전자(NCBI accession number: AF025431)의 5' 말단으로부터 181번째에서 198번째까지의 정방향 프라이머(서열번호 9) 및 동일한 유전자에서 1544번째에서 1562번째까지의 역방향 프라이머(서열번호 10)를 포함하도록 하였다.
마커 크기(bp) 프라이머 서열
rbcL 446 F
R		 5'-AATTCATGAGTTGTAGGGAGGGA-3'(서열번호 1)
5'-AATTCGCAGATCCTCCAGACGT-3'(서열번호 2)
BBE
(berberine bridge enzyme)		 516 F
R		 5'-CCTGCGGGTTATTAAAACC-3'(서열번호 3)
5'-TGTTGCCCCAGATTCAAC-3'(서열번호 4)
SAT2
((7S)-salutaridinol-7-O-acetyltrasferase)		 588 F
R
 5'-ATGGCAACAATGTATAGTGC-3'(서열번호 5)
5'-ATCTGTAACGGCAGCAGTTGAAC-3'(서열번호 6)
NCS
((S)-norcoclaurine synthase)		 856 F
R		 5'-ATGTCTAAGTTGATCACGAC-3'(서열번호 7)
5'-TTAGAGTGGAACACCAGCAA-3'(서열번호 8)
TYDC
(tyrosine/dopa decarboxylase)		 1371 F
R		 5'-CCGTCTCAACCAGATCAA-3'(서열번호 9)
5'-TTCACCGCATACCTTTACG-3'(서열번호 10)
실시예 2: 멀티플렉스- PCR 최적 조건의 확립
본 발명자들은 본 발명의 멀티플렉스 PCR 반응 조건을 프라이머 비율의 측면에서 최적화하였다.
구체적으로, 본 프라이머 세트를 동시에 하나의 시험관내에 혼합한 멀티플렉스 형태의 싱글-튜브 멀티플렉스 PCR을 실시하였다.
총 5 쌍의 각 프라이머 세트(각 5 ㎕, 10pmole/㎕)가 모두 포함되어 있는 튜브에 상업용 GOLD 10X PCR 버퍼 5 ㎕, Taq 중합효소 0.5 ㎕, Papaver somniferum으로부터 추출한 DNA 주형 10-100 ng을 포함하는 총 부피 50 ㎕가 되도록 조정한 후 멀티플렉스 PCR을 실시하였다. 이때, FAM 또는 6-FAM 염료(dye)를 태깅하여 검출하였다.
먼저, 95℃에서 11 분간 전변성시켰다. 이어서 95℃에서 1 분, 50℃에서 1 분, 72℃에서 1 분 간의 증폭반응을 30회 반복한 후 72℃에서 7분간 반응시켜 유지시켜 PCR을 종료하였다. 모든 반응에는 음성대조군으로 증류수를 사용하였다.
또한, 본 멀티플렉스 PCR 조건을 최적화하기 위하여, 프라이머 세트의 혼합 비율을 변화시켜 동일한 반응 조건에서 실시하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 각 프라이머에 대한 비율(rbcL:BBE:SAT2:NCS:TYDC)을 1:1:1:1:1의 몰비(mole ratio)(10 pmole/㎕를 각 상기 몰비로 혼합하여 10 ㎕를 사용하여 증폭)로 실시했을 때보다 1:20:20:25:40의 몰비(mole ratio)로 실시했을 때 각 유전자에 특이적인 산물들이 각각 증폭되었음을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 프라이머 세트는 상기 조건 하에서 각 유전자에 대하여 현저한 특이도를 나타낸다는 것을 알 수 있다.
실시예 3: 본 프라이머에 의한 Papaver setigerum 및 Papaver somniferum 의 동시 판별
본 발명자들은 확보된 시료(Papaver somniferum)에 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 실시예 2에서 확립된 조건으로 멀티플렉스 PCR을 실시하여, 마약성 양귀비류인 Papaver setigerum 및 Papaver somniferum의 동시 판별 가능성 여부를 확인하였다.
그 결과, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 프라이머 세트를 사용할 경우 마약성 양귀비류인 Papaver setigerum 및 Papaver somniferum는 종에 상관없이 상기 프라이머가 타겟하는 유전자에 대하여 증폭된 PCR 단편을 보여 주었다.
반면, 비마약성 양귀비인 Papaver rhoeas는 마약성 양귀비류인 Papaver setigerum 및 Papaver somniferum과 달리 TYDC, BBE, SAT2는 증폭되지 않았다.
따라서, 이러한 마커의 검출 차이에 의해 Papaver setigerum 및 Papaver somniferum는 동시 검출될 수 있을 뿐만 아니라 다른 양귀비류와 뚜렷이 구분될 수 있다.
TYDC NCS BBE SAT2 18S rRNA
P. setigerum + ++ ++ + +++
P. somniferum ++ ++ +++ + +++
P. rhoeas - ++ - - +++
또한, 추가적으로 양귀비과 7 종의 식물(Eschscholzia californica, E. mexicana, P. bracteatum, P. nudicaule, P. orientale, Paeo black, Paeo flemish)에 대해 분석한 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 특정 마커만 증폭되었다.
따라서, 본 발명의 프라이머 세트는 Papaver setigerum 및 Papaver somniferum를 동시 판별할 수 있을 뿐만 아니라, 다른 양귀비류와 명확하게 구별하는데 유용하게 사용될 수 있다.
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Claims (8)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 및 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트;를 포함하는 마약성 양귀비 동시 판별용 단일튜브(single tube) 멀티플렉스(multiplex) PCR 용 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 마약성 양귀비는 파파베르 세티게룸(Papaver setigerum), 파파베르 솜니페룸(Papaver somniferum), 파파베르 파에오니플로룸(Papaver paeoniflorum), 파파베르 라시니아툼(Papaver laciniatum) 및 파파베르 뉴가(Papaver neuga)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
  3. 제1항 또는 제2항의 프라이머 세트를 포함하는 마약성 양귀비 동시 판별용 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항의 프라이머 세트를 포함하는 마약성 양귀비 동시 판별용 키트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 키트는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트:서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트:서열번호 5의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트: 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트:서열번호 9의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트를 1:20:20:25:40의 몰비(mole ratio)로 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
  6. 다음 단계를 포함하는 마약성 양귀비 동시 판별 방법:
    (a) 시료에서 DNA를 분리하는 단계;
    (b) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR)을 실시하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계.
  7. 제6항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 프라이머 세트의 혼합 비율은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트:서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트:서열번호 5의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트: 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트:서열번호 9의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트=1:20:20:25:40의 몰비(mole ratio)인 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 멀티플렉스 PCR의 프라이머 어닐링 온도(annealing temperature)는 45℃ 내지 55℃인 것을 특징으로 하는, 방법.

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