CN117625834B - 基于麻叶千里光its2序列的snp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物技术领域，具体涉及基于麻叶千里光ITS2序列的SNP分子标记及其应用。本发明提供了基于麻叶千里光ITS2序列的SNP分子标记及其应用，麻叶千里光ITS2序列具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，麻叶千里光ITS2序列的第297、394、400和403位碱基作为SNP分子标记能够准确鉴定麻叶千里光及其混伪品，从而更好的规范麻叶千里光的正品来源。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，具体涉及基于麻叶千里光ITS2序列的SNP分子标记及其应用。
背景技术
麻叶千里光（Senecio cannabifolius Less.）为菊科千里光属植物千里光的干燥地上部分，性苦、寒，归肺、肝经。麻叶千里光主要从成分有黄酮类、有机酸类、生物碱类、挥发油类等，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗滴虫、保肝等药理活性。因其独特疗效麻叶千里光常被用作单方或复方制剂的主要成分或原料药，如肺宁颗粒、千柏鼻炎片、千里光眼药水、千喜片等，临床上广泛应用于风热感冒、上呼吸道感染、急性扁桃体炎、咽喉肿痛、肺炎等疾病的治疗。由于麻叶千里光和伪品紫菀、旋复花药材干品相似，市场上常常出现紫菀和旋复花作为肺宁颗粒的伪品进行销售。紫菀（Aster tataricus）是以菊科紫菀属多年生植物的根及根茎为药用部位的中药，别名青菀、还魂草。其根和花均可以入药，药材主产于安徽省亳州市及河北省安国市。菊科植物旋覆花（Inula japonica）以干燥头状花序入药，药材主产于东北、华北、华东、华中及广西等地。为了确保药材的质量，更好的规范麻叶千里光的正品来源，从DNA条形码技术方面对麻叶千里光正品来源以及其各地混伪品进行鉴别研究。
传统中药鉴别主要是靠从基原、性状、理化等方面鉴别来判断中药的品质和种类，对鉴别人员的经验要求较高，并且还具有一定的局限性。DNA条形码的概念由加拿大动物学家Hebert首次提出，可以应用在生物分类的识别上面，通过DNA条形码的识别来识别每一个生物的特征，通过提前储备一定的DNA条形码信息，进行准确而快速的鉴定。DNA条形码技术简单方便快捷，不会受到研究者的经验水平以及样品的形状特征限制，可以运用到动植物的鉴定，以及食品监督管理上面。
随着分子生物学以及生物信息学的快速发展，DNA条形码是近些年来生物分类和鉴定研究的热点方向，迄今为止，已有多位学者从植物性状、理化成分对麻叶千里光作了详细鉴别。此外，单核苷酸多态性(SNP)对分析植物物种遗传变异具有重要价值，特别是对于同属物种。目前，基于SNP的分子标记已经应用于一些药用植物中，如人参、续断等，本实验首次基于SNP分子标记技术建立鉴定麻叶千里光及其混伪品（紫菀、旋覆花）的方法。事实上，麻叶千里光、紫菀和旋覆花在植株形态上非常相似，而对于全草类药材，极易鉴定错误，市场上紫菀和旋覆花常常与麻叶千里光夹杂入药，存在严重的用药安全隐患。因此，基于ITS2确定SNP分子标记鉴定麻叶千里光非常有必要，对麻叶千里光种质资源保护和保证原料药来源安全具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供基于麻叶千里光ITS2序列的SNP分子标记及其应用，使用本发明提供的特异的麻叶千里光ITS2序列以及基于麻叶千里光ITS2序列的SNP分子标记能够准确鉴定麻叶千里光及其混伪品，更好的规范麻叶千里光的正品来源。
本发明提供了麻叶千里光ITS2序列，其具有如下所示的序列中任意一种：
（1）、如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
（2）、如（1）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（1）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
（3）、与（1）或（2）所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。
本发明提供了基于麻叶千里光ITS2序列的SNP分子标记，所述SNP位点位于SEQ IDNO:1所示核苷酸序列的第297、394、400和403位碱基。
在一些实施例中，所述SNP位点中，第297和403位碱基为T或C，第394位碱基为A或G，第400位碱基为T或A。
对麻叶千里光及其混伪品的ITS2序列进行比对后，获得了大量的SNP标记，对这些SNP标记进行了进一步的筛选，获得了能够准确鉴定麻叶千里光及其混伪品的SNP分子标记。
本发明提供了所述的SNP分子标记在鉴定麻叶千里光及其混伪品中的应用。
在一些实施例中，所述混伪品包括紫菀和/或旋覆花。
在一些具体实施例中，所述SNP位点中：
所述第297、400和403位碱基为T，第394位碱基为A，则检测样本为麻叶千里光；
所述第400位碱基为A，第297和403位碱基为C，第394位碱基为G，则检测样本为紫菀或旋覆花。
本发明提供了鉴定麻叶千里光及其混伪品的试剂盒，包括检测所述的SNP分子标记的检测试剂。
在一些实施例中，所述检测试剂包括检测引物和PCR扩增试剂。
在一些具体实施例中，所述检测引物包括：
扩增所述麻叶千里光ITS2序列的引物对，其正向引物具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列，其反向引物具有如SEQ ID NO:3所述核苷酸序列；和/或扩增所述的SNP分子标记的引物对，其正向引物具有如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列，其反向引物具有如SEQ ID NO:5所述核苷酸序列。
本发明提供了鉴定麻叶千里光及其混伪品的方法，包括：采用所述的试剂盒对样本进行PCR扩增并检测。
在一些实施例中，所述检测的方法包括基于凝胶电泳的SNP检测法和/或DNA测序法。
在一些具体实施例中，所述方法包括：
所述PCR扩增采用扩增所述麻叶千里光ITS2序列的引物对，并对扩增产物进行测序，所述扩增产物的第297、400和403位碱基为T，第394位碱基为A，检测样本为麻叶千里光，所述扩增产物的第297和403位碱基为C，第394位碱基为G，第400位碱基为A，则检测样本为紫菀或旋覆花；和/或所述PCR扩增采用扩增所述的SNP分子标记的引物对，并对扩增产物进行凝胶电泳检测，扩增产物出现条带，则检测样本为麻叶千里光，扩增产物未出现条带，则检测样本为紫菀或旋覆花。
在一些实施例中，所述PCR扩增的反应体系为：10 X PCR Buffer 9.5 µL、10 mMdNTP 1.5 µL、5 U/μL Taq Plus DNA Polymeras 1.5 µL，10 µM引物F 1µL，10 µM引物R 1µL，样品DNA 1µL，ddH2O 9.5 µL。
在一些具体实施例中，所述PCR扩增的反应条件为：
95℃预变性5 min；95℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸90 s，延伸30个循环，72℃延伸10 min；或95℃预变性5 min，94℃变性30 s，63℃退火30 s，退火温度每循环降0.5℃，72℃延伸30 s，进行10个循环，95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，进行30个循环，72℃延伸10 min。
本发明提供了基于麻叶千里光ITS2序列的SNP分子标记及其应用，麻叶千里光ITS2序列具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，麻叶千里光ITS2序列的第297、394、400和403位碱基作为SNP分子标记能够准确鉴定麻叶千里光及其混伪品，从而更好的规范麻叶千里光的正品来源。
附图说明
图1示麻叶千里光及其混伪品的ITS2序列凝胶电泳图，其中（a）图为Marker大小，（b）图为麻叶千里光及其混伪品的ITS2序列凝胶电泳图，图中A为麻叶千里光，B为紫菀，C为旋覆花，M为100-3000 bp Ladder-K (Marker)；
图2示麻叶千里光种内ITS序列（第81位~160位碱基）比对结果；
图3示麻叶千里光种内ITS序列（第281位~400位碱基）比对结果；
图4示麻叶千里光种内ITS序列（第401位~520位碱基）比对结果；
图5示麻叶千里光种内ITS序列（第521位~680位碱基）比对结果；
图6示麻叶千里光与其伪品ITS2序列比对结果；
图7示基于ITS2序列构建的麻叶千里光及其混伪品（neighbor joining）NJ树结果；
图8示麻叶千里光及其混伪品ITS2的二级结构结果；
图9示麻叶千里光及其伪品的SNP位点比对结果，其中，A为麻叶千里光，B为紫菀，C为旋覆花；
图10示麻叶千里光SNP位点PCR扩增验证结果，其中，（a）图为SNP位点突变片段扩增电泳图，图中M为Marker (B500347,3k），泳道1为麻叶千里光，泳道2为紫菀，泳道3为旋覆花，（b）图为Marker大小。
具体实施方式
本发明提供了基于麻叶千里光ITS2序列的SNP分子标记及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
麻叶千里光因其具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗滴虫、保肝等药理活性，常被用作复方制剂的主要成分或原料药，如千柏鼻炎片、千里光眼药水、千喜片等，临床上广泛应用于风热感冒、上呼吸道感染、急性扁桃体炎、咽喉肿痛、肺炎等疾病的治疗，同时，由于麻叶千里光为原料的新药（如颗粒及注射剂等）疗效显著，近几年许多药企对于麻叶千里光的需求供不应求。然而，在市场上由于其混伪品的渗入，常常将麻叶千里光与其混伪品混用，而这些混伪品在药理药效上与麻叶千里光存在差异，增加了用药风险，严重的可能引起药物中毒。因此，准确鉴定麻叶千里光及其混伪品，这对保证麻叶千里光临床用药的安全有效尤为重要。
传统的中药材鉴定主要根据药材的性状、理化等特性鉴别，此类鉴定方法容易受到鉴别人员的经验、操作及主观判断的影响，加之传统鉴定专业技术人员紧缺，传统的鉴定方法难以满足市场的需求。因此，采用现代分子生物学技术开展麻叶千里光及其混伪品的鉴定具有重要意义。中药材及其混伪品的DNA分子鉴定主要基于DNA条形码技术，即利用DNA短序列识别生物标本，最早由Hebert等人提出。近年来，随着药用植物分子生物学的发展，基于ITS2序列的药用植物DNA分子鉴定技术在中药鉴定领域发挥了重要作用，陈士林等认为基于ITS2序列的药用植物分子鉴定技术作为中药鉴定领域的新方法，不仅要保证其具有结果准确、可重复性强等特点，还要保证其在中药鉴定领域具有较强的实用性和通用性。
本发明分析了麻叶千里光及其混伪品旋覆花、紫菀样品的ITS2序列，所有实验样本的PCR扩增及测序成功率均为100%，序列获得率亦为100%，序列长度均在700 bp左右，这说明ITS2在麻叶千里光的鉴定中是有效的DNA片段，所用的ITS2序列引物及其扩增程序具有较好的稳定性，这也进一步补充了基于ITS2序列DNA条形码鉴定在多种药用植物中实用性与通用性。麻叶千里光的种内最大K2P距离均远远小于其与混伪品旋覆花、紫菀的种间最小K2P距离，这可能与同属物种和不同属物种间各自的亲缘性有关。在对麻叶千里光及其混伪品植物旋覆花、紫菀的ITS序列分析中发现麻叶千里光的种内ITS序列多为单个碱基变异位点，这可能是与在龙葵、雷公藤、黄精等药用植物的研究一样，不同地区、不同环境药用植物的ITS2序列的碱基位点发生了不同程度的变异，这些变异可能与药用植物分布的纬度有一定的关系。此外，遗传漂变可导致种群间明显的遗传分化，不同地域的种群，在进化中固定了不同的等位基因，导致较大比例的遗传多样性存在于不同的种群间，如在多花黄精ITS2序列突变位点研究中，安徽青阳样品的“C”-“T”碱基互换，贵州剑河和花溪样品的“G”-“C”碱基互换，浙江遂昌样品的“T”-“C”碱基互换，在我们的结果中也发现麻叶千里光种内ITS2序列中存在“C”-“T”、“G”-“C”、“T”-“C”碱基的互换，这些可能与麻叶千里光的地域分布有一定关系，并且生境可能影响麻叶千里光的遗传变异，但这需要进一步的实验去验证。
在基于NJ法构建的进化树中，麻叶千里光属、旋覆花属、紫菀属各自单独聚为一支，呈现出良好的单系性，同时，ITS2二级结构所揭示的分子形态学特征也直观显示出麻叶千里光与其混伪品的明显差异，并且麻叶千里光与旋覆花，麻叶千里光与紫菀均存在多个变异位点，也说明麻叶千里光与其伪品之间变异差异较为明显。通过SNP位点比对后发现4个SNP位点可以准确鉴定麻叶千里光，分别为297 bp处T-C、394bp处A-G、400bp处T-A、和403bp处T-C(如图9及表6所示)。即5’端起第297、400和403位为T，394位为A，则鉴定为麻叶千里光，如果自5’端起第297和403位为C，394位为G，400位为A则待鉴定样品不是麻叶千里光。因此，基于ITS2的SNP分子标记可准确、简便地鉴定麻叶千里光及其混伪品，这为准确鉴定麻叶千里光药材，保证临床用药安全提供了技术支撑。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例
1.材料
供试麻叶千里光种子样品采集于吉林柳河，并于4月下旬至5月上旬将麻叶千里光种子播种于特产所左家所区试验基地和长春所区试验基地2个试验区，采用随机区组设计进行3次重复实验，供试材料信息见表1。从GenBank数据库中下载了麻叶千里光及其混伪品药用植物ITS2序列共18条，样品信息见表2。
表1 实验材料信息
表2 GenBank下载麻叶千里光及其混伪品ITS2序列
2 方法
主要仪器与试剂如下表3及表4所示。
表3 主要仪器
表4 主要试剂
2.3 DNA提取、PCR扩增及测序
将所收集的植物样品快速运输到实验室，在实验室除去泥沙，清洗干净，每份样品取约30 mg，采用植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA，PCR扩增依照中药材DNA条形码分子鉴定指导原则，正向引物ITS2F：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’（SEQ ID NO:6）；反向引物ITS2R：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’（SEQ ID NO:7）。PCR反应体积25.0 μL，包括10 X PCRBuffer 9.5 µL、10 mM dNTP 1.5 µL、5 U/μL Taq Plus DNA Polymeras 1.5 µL，10 µM引物F 1µL，10 µM引物R 1µL，样品DNA 1µL，ddH2O 9.5 µL。扩增程序：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸90 s（进行30个循环），72℃延伸10 min。SNP的PCR扩增引物：麻叶千里光正向引物FF：5’-CTGCGGAAGGATCATTGTCG-3’（SEQ ID NO:2），反向引物FR：5’-GATATGCTTAAACTCAGCGGGTAGT-3’（SEQ ID NO:3）；紫菀正向引物ZF：5’-GAACGACCCGTGAACATGTTATAAC-3’（SEQ ID NO:8），反向引物ZR：5’-ATATGCTTAAACTCAGCGGGTAGTC-3’（SEQ ID NO:9）；旋覆花正向引物XF：5’-GCGGAAGGATCATTGTCGAAG-3’（SEQ ID NO:10），反向引物XR：5’-AACACGGCGCGTTAGGGTA-3’（SEQ ID NO:11）。
PCR反应体积25.0 μL，包括10 X PCR Buffer 9.5 µL、10 mM dNTP 1.5 µL、5 U/μL Taq Plus DNA Polymeras 1.5 µL，10 µM引物F 1µL，10 µM引物R 1µL，样品DNA 1µL，ddH2O 9.5 µL。扩增程序：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，63°C(每循环降0.5℃)退火30s，72℃延伸30 s（进行10个循环），95℃变性30 s，58°C退火30 s，72℃延伸30 s（进行30个循环），72℃延伸10 min。本实验涉及的样品DNA 提取、扩增和上机测序技术委托上海生工生物工程有限公司（生工）完成，每个样本重复3次测序。
2.4 数据处理与分析
测序后所得峰图采用Codon Code AlignerV5.1.3（Codon Code有限公司，美国）校对拼接，去除低质量序列及引物区，使用基于隐马尔可夫模型的HMM注释方法，去除拼接得到的一致序列的两端5.8S和28S区段，获得标准ITS2间隔区序列。研究采用MEGA7.0软件比对所有序列，计算种内序列变异和种间序列变异，构建neighbor joining（NJ）系统进化树评估各物种之间的亲缘性。根据Koetschan等建立的ITS2数据库及其网站预测ITS2二级结构。
3.结果及分析
3.1 麻叶千里光及其混伪品PCR扩增效率及测序成功率
对麻叶千里光、紫菀、旋覆花三个样品的ITS序列分析发现，所有实验样本的PCR扩增及测序成功率均为100%，序列获得率亦为100%，经1.7%琼脂糖凝胶电泳得到PCR扩增电泳图如图1所示，扩增效果较好，条带较亮，没有拖尾现象，序列长度均在700bp左右。其中：
麻叶千里光ITS2的核苷酸序列如下所示：
CTGCGGAAGGATCATTGTCGAAACCTGCACAGCAGAACGACCCGTGAACATGTAACTATATTTGGGTGTCCTTAGTATTGGGCATTTGTTTGATTCTTTGGATGCCATGTTGATGTGTCTTTGGTAAGCCTTTTTGGTCTAAACGATGACACATTGACAAAACAACAACCACCGGCACGGAATGTGCCAAGGAAAATTAAACATACAAAGGGTTTGTGCCGTGCATCATCGTTTGCGGTGATTGCAAGGTATCTTGCTTCTTTATAATCACAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTTGGCTCACGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTTTTTGAACGCAAGTTGCGCCCAAAGCCTTTTGGCTGAGGGCACGTCTGCTTGGGCGTCACACATCGCGTCACCTCCCAACACACCTTTTGATGAGGATGTTGTTTTGGGGGCGGAGATTGGTCTCCCGTTCCTTATGTTCGGTTGGCTTAAATAAGAGTCCCCTTCAACGGACGCACGATTGGTGGTGGTTGACAATATCCTCTTATCGAGTCGTGTGTTCAAAGGAGCAAGGAAGATCTCTTTGAGACCCTAATGTGTCGTCTTGTACGATGCTTCGACCGCGACCCCAGGTCAGGCGGGACTACCCGCTGAGTTTAAGCATATC（SEQ ID NO:1）
紫菀ITS2的核苷酸序列如下所示：
GAACGACCCGTGAACATGTTATAACAACCATGCCATAATGGGTTGAGCGGCAGTTCGATCCTTGTGGCACACCGTCGATGTGCATCCTTGATGACCCATTCGGGCCTCCTGGTTGTTGCTTCGACGTAACAAAACCCCGGCACGGGATGTGCCAAGGAAATTTAAAGTGAAGAATGGCTCGTTCCATGATGTCCCGTTCGCGGTGCGTTCATGGAGCATGGCTTCTTTGTAATCACAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCACGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTTTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCATTCGGCTGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCACGCATCGCGTCGCTCCCACCATTCCTTCCTTCGGGATGCTTGGTTGGGGGCGGATAATGGCCTCCCGTTCCTCACCGAGCGGTTGCCAAAATAAAAGTCCCCTTTGATGGATGCACGACTAGTGGTGGTTGACAAAACCCGGTATTGTGTCGTGTGTCATGTCGAAAGGGTGCATCTTAGTAGACCCAACGCGTTGTCACGAAGCAACGCATCGACCGCGACCCCAGGTCAGGCGGGACTACCCGCTGAGTTTAAGCATAT（SEQ ID NO:12）
旋覆花ITS2的核苷酸序列如下所示：
GCGGAAGGATCATTGTCGAAGCCTATAAGCGAACGACCCGTGAACGTGTAACAACATCAGAGCATCATAGGTCTCGGGCTTTTGCTCGTGACGTATGGCGCCTCGTCGATTTGCATCCATGGTCGCCTCTTCGGAGCCTCCATGATGTCAGAAAGGCGTTAACCAACCCCGGCACGGCATGTGCCAAGGAAGAATAAACTTTAAGACGGCCTCGTTCATGTCGCCCCGTTCGCGGTGTGTGCATGTGACGCGGCTTCTTTGTAAACCATAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCACGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTTTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCACTCGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCACGCATCGCGTCGCTCCTCACCGTGCCTCCATAAAGGGGTGTGCGAGGTAGGAGCGGATACTGGTCTCCCGTGCCAACGGTGCGGTTGGCCAAAATAGGAGTCTCCTTTGATGGATACACGGCAAGTGGTGGTTGACAAAACCTTAGTCTCGTGTCGTGTGTCCTTACTTGTAAGCGAAGACCTCGTAAAGTACCCTAACGCGCCGTGTTATGACGGCGCATCGACCGCGACCCCAGGTCAGGCGGGACTACCCGCTGAGTTTAAGCATAT（SEQ ID NO:13）
3.2 ITS2序列差异研究
麻叶千里光及其混伪品的ITS2序列共21条，利用MEGA 6. 0计算ITS2序列的种间K2P遗传距离，结果显示，麻叶千里光的种内K2P遗传距离是0.006～0.023，麻叶千里光与旋覆花和紫菀的种间遗传距离分别是0.607~0.749，0.609~0.727，均远大于麻叶千里光的种内K2P遗传距离，所以用ITS2序列能很好地鉴别麻叶千里光及其混伪品，K2P遗传距离如表5所示。
表5 麻叶千里光及其混伪品的K2P遗传距离
3.3 ITS2序列变异位点分析
通过对麻叶千里光及其混伪品植物紫菀、旋覆花的ITS序列分析，发现麻叶千里光的种内ITS序列多为单个碱基变异位点（如图2~图5所示），而麻叶千里光与旋覆花，麻叶千里光与紫菀均存在多个变异位点（如图6所示），说明麻叶千里光与其伪品之间变异差异较为明显，可以加以区分。
3.4 NJ树分析
基于相似性搜索法和最近距离法结果构建了NJ系统聚类树，Bootstrap 1000次重复，枝上数值仅显示自展支持率≥50%，如图7所示。结果表明，麻叶千里光（Senecio cannabifolius Less.）与Jacobaea paludosa subsp. Lanata、Senecio cannabifoliusLess. var. Integrifolia、Jacobaea paludosa subsp. paludosa聚为一支，Jacobaeacarniolica单独聚为一支，旋覆花单独聚为一支，紫菀单独聚为一支。麻叶千里光与各混伪品均能明显分开，因此，ITS2序列作为DNA条形码可以很好地将麻叶千里光及其混伪品区分开。
3.5 ITS2序列二级结构预测
基于Koetschan等建立的ITS2数据库及其网站预测麻叶千里光及其混伪品的ITS2二级结构（如图8所示）。结果显示，所有物种的二级结构均由一个中心环（主环）及4个螺旋区（helix）构成，每个螺旋上又有大小和数量不一的的茎环（loop）结构。通过比较麻叶千里光与其混伪品旋覆花、紫菀的ITS2二级结构发现，各物种在4个螺旋区的茎环数目、大小、位置以及螺旋发出时的角度均有明显差异，因此，据ITS2二级结构，可以直观地将麻叶千里光与其混伪品区分。
3.6 麻叶千里光SNP位点确定
通过SNP位点比对后发现4个SNP位点可以准确鉴定麻叶千里光，分别为297 bp处T-C、394bp处A-G、400bp处T-A、和403bp处T-C(如图9及表6所示)。即5’端起第297、400和403位为T，394位为A，则鉴定为麻叶千里光，如果自5’端起第297和403位C，394位为G，400位为A则待鉴定样品不是麻叶千里光。
表6 SNP分子标记位点
3.7 麻叶千里光SNP位点PCR扩增验证
进一步的，基于麻叶千里光的4个SNP位点突变，设计特异性引物F：5' -TTTTTGGTCTAAACGATGACACATT-3'（SEQ ID NO:4），R：5'-CTCAAAGAGATCTTCCTTGCTCCT-3'（SEQ ID NO:5），在麻叶千里光、紫菀和旋覆花中扩增SNP目的片段，如图10所示，仅在麻叶千里光中可以扩增出目的片段，而在紫菀和旋覆花中不能扩增出，说明所设计引物具有特异性，能很好的鉴别麻叶千里光及其伪品。其特点在于引物的特异性。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.鉴定麻叶千里光及其混伪品的方法，其特征在于，包括：采用引物对对样本ITS2序列进行PCR扩增并检测，再进行PCR扩增验证；
扩增所述麻叶千里光ITS2序列的引物对：
其正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，
其反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
和扩增验证的引物对：
其正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，
其反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
所述方法包括：
所述PCR扩增采用扩增所述麻叶千里光ITS2序列的引物对，并对扩增产物进行测序，所述扩增产物的第297、400和403位碱基为T，第394位碱基为A，检测样本为麻叶千里光，所述扩增产物的第297和403位碱基为C，第394位碱基为G，第400位碱基为A，则检测样本为紫菀或旋覆花；
所述PCR扩增采用扩增验证的引物对，并对扩增产物进行凝胶电泳检测，扩增产物出现条带，则检测样本为麻叶千里光，扩增产物未出现条带，则检测样本为紫菀或旋覆花。
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