CN114107543B - 杭白菊pcr鉴定试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种杭白菊PCR鉴定试剂盒及应用，所述试剂盒中的特异性引物为HBJ893‑1和HBJ893‑2。HBJ893‑1：5’‑ACTACACGAAG AATGAGTAGGCAGC‑3’,HBJ893‑2:5’‑GAACTAC GAAACTAACCCGACACG‑3’。本发明提供了一种快速、准确鉴定杭白菊的方法，可以广泛应用于杭白菊中药选种育种、种植、采收储存、销售、临床应用各环节的品种鉴定，在鉴别中药真伪，打击伪品，加强中药质量监管，促进中药现代化发展方面具有重大意义。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种DNA分子鉴定方法，特别涉及中药杭白菊PCR鉴定试剂盒、特异性引物、模板及鉴定方法。
(二)背景技术
菊花为菊科菊属植物菊(Chrysanthemum morifolium Ramat.)的干燥头状花序，道地产地为浙江桐乡、河南焦作、安徽滁州、安徽亳州、安徽歙县等。药菊的品种包括杭白菊、怀菊、滁菊、亳菊、贡菊。菊花含挥发油、菊甙、腺嘌呤、胆碱、氨基酸、黄酮类、酚酸类及刺槐素等活性成分，具有抗菌、抗病毒、抗炎、降血压、散风清热、平肝明目等功效，可用于治疗风热感冒，头痛眩晕，目赤肿痛，眼目昏花等病症。不同的药菊品种，其有效成分和药效差别较大。由于药菊品种较多，来源多样，外观形态类似，单靠外形和传统中药检测方法较难区别，需建立一种新型的鉴定方法。
本发明提供的PCR检测法是一种杭白菊的DNA分子鉴定方法，能够准确鉴定杭白菊。利用PCR检测法对杭白菊进行鉴定尚未见报道。该方法的建立对实现中药现代化，规范管理药菊的种植，采摘和销售，具有重要意义。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种能够准确鉴定中药杭白菊的PCR鉴定试剂盒和检测方法，包括PCR检测法关键试剂PCR引物、模板和PCR检测法的检测步骤，解决了中药杭白菊较难区别的问题。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种杭白菊PCR鉴定试剂盒，所述试剂盒中的特异性引物为HBJ893-1和HBJ893-2：
HBJ893-1:5’-ACTACACGAAGAATGAGTAGGCAGC-3’(SEQ ID NO.2)；
HBJ893-2:5’-GAACTACGAAACTAACCCGACACG-3’(SEQ ID NO.3)。
进一步，所述的杭白菊PCR鉴定试剂盒的组成为：
本发明还涉及一种所述杭白菊PCR鉴定试剂盒在杭白菊鉴定中的应用，所述应用的方法为：
(1)模板DNA的提取和质量鉴定：采用常规提取法提取样品DNA作为PCR模板；以电泳法检测模板DNA的质量(检测方法同步骤(3))，条带清晰无弥散的，即为符合PCR反应的模板DNA；
(2)PCR鉴定：利用杭白菊PCR鉴定试剂盒中的特异性引物HBJ893-1和HBJ893-2进行PCR扩增：
PCR反应溶液：
将PCR反应溶液放入PCR扩增仪中进行PCR扩增反应，反应程序设置为：93℃预变性3min，93℃变性1min，58～62℃复性1min，72℃延伸2min，40个循环，最后72℃延伸10min；
(3)PCR产物进行电泳检测：取出PCR扩增产物(即扩增反应后的反应液)10μL与加样缓冲液1μL混合，用1.2％琼脂糖凝胶电泳(含0.5％溴化乙锭)检测扩增结果，在893bp处出现扩增条带为杭白菊，在893bp处不出现扩增条带不是杭白菊。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：(1)本发明根据凝胶电泳在893bp处有无扩增条带作为鉴定杭白菊的依据，可以检测单个或者混合杭白菊DNA样品，检测准确、灵敏度高、操作简单、耗时短、重复性好；(2)利用杭白菊PCR鉴定试剂盒中引物HBJ893-1和HBJ893-2以及PCR反应溶液配方可以制造杭白菊鉴定试剂盒；(3)本发明提供了一种快速、准确鉴定杭白菊的方法，可以广泛应用于杭白菊中药选种育种、种植、采收储存、销售、临床应用各环节的品种鉴定，在鉴别中药真伪，打击伪品，加强中药质量监管，促进中药现代化发展方面具有重大意义。
(四)附图说明
图1为12种供试品经PCR检测法鉴定后的电泳图，M-DNA分子量Marker；1-杭白菊(浙江桐乡)；2-怀菊(河南焦作)；3-滁菊(安徽滁州)；4-亳菊(安徽亳州)；5-野菊；6-蒲公英；7-浙白术；8-安白术；9-浙白芍；10-安白芍；11-山白芍；12-川白芍。
图2为不同浓度的杭白菊经PCR检测法鉴定后的电泳图，泳道M为Marker，泳道1的杭白菊浓度为40ng/μL，泳道2的杭白菊浓度为24ng/μL，泳道3的杭白菊浓度为8ng/μL，泳道4的杭白菊浓度为4ng/μL，泳道5的杭白菊浓度为0.8ng/μL，泳道6的杭白菊浓度为0.4ng/μL。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明所用原料均按照《中国药典》2015版采集制备。
实施例1
1、杭白菊PCR检测法关键试剂PCR引物的获得
应用植物DNA快速提取试剂盒(上海生工生物有限公司)从杭白菊(浙江桐乡)、怀菊(河南焦作)、滁菊(安徽滁州)和亳菊(安徽亳州)中分别提取基因组DNA。使用5000条随机引物，利用RAPD扩增法对四种药菊进行RAPD分析，筛选获得一条杭白菊特异性扩增条带，这条特异性扩增条带只出现在杭白菊品种中，在其他药菊品种中没有，此条带中的DNA分子即是杭白菊特异性DNA分子标记。将杭白菊特异性DNA分子标记从琼脂糖凝胶中回收、克隆、测序，测序结果见SEQ ID NO.1所示，命名为HBJ893。
根据HBJ893序列，设计一对特异性引物HBJ893-1和HBJ893-2，引物序列为：
HBJ893-1:5’-ACTACACGAAGAATGAGTAGGCAGC-3’；
HBJ893-2:5’-GAACTACGAAACTAACCCGACACG-3’。
上下游引物选取的位点分别对应于HBJ893序列位点上的1-25bp和870-893bp处。
SEQ ID NO.1为：
ACTACACGAAGAATGAGTAGGCAGCAGGCTGCACTGGAAAGAATGATGGCCTCACCATAGGTCAATTCTGTTATGATAATTAGCTAGACAATGTTTCATCTAGTTTATTTCCTATGTATAAGTTATGTACTATAAAAACATATGACTGTGTCTAACTGTAATTCTCATGCTTCAAAAAGTATGCAATTTTATGCATTTGGAATTATATCCATTTGCATTAATTATGGAACCATATCATGTTTGTGTATTTTTACAGATTGACTAAGCTTGATGTACGAATAATTTGCATCAAAAGTAACCAAAGCTAAACAAAACCTCATAAGAATGTTGACAATTAAAAGTCAAACCTAAACAAATTGTTATCCATCTGCTTACCCATAAGGCATTGAAAGTAAAAAACAAACCAAACTGAATAATTCATAACAATGTTGACAATTAAAAGTCAACTTTAATCTTAACCATGTGCATAAAGCCATAAACATACGGTAAACCGATCATAATAACAAAATTCATAACCTTCTGGAACACAACGTTACTACAATTCAAGATAATGAACATTAACCATCTTGCCTCATTACATAAAAGCTAAAAAGTTATCCCAATGCATAAATAATCAAGAACAATATCCAACTAAGGACCAGGTAAATCTTCCACTTCCACACATCACCTTGAGCAGCTTCTAATCTTGCCTCAAGCTCATTTCTCCCTCTCAAAAGGCCTGGTATGATCATTCTTGAACGAGCACAGATTTCAGATCATACCATCGTATCCACCGACAAGAAGACCCCTATTCATGATTAGGGCAAGTGATTAAACAACACCCATTGTTACAATGTAGTTTGCTACTTGCGAAAATTTACAAGGGTTTTCGTGTCGGGTTAGTTTCGTAGTTC。
2、杭白菊的PCR检测法
(1)采用常规提取法提取样品DNA作为PCR的模板；以电泳法(同步骤(3))检测模板DNA的质量，条带清晰无弥散的，即为符合PCR反应的模板DNA；
(2)按照HBJ893-1和HBJ893-2的序列用体外合成仪合成引物HBJ893-1和HBJ893-2，以HBJ893-1和HBJ893-2为引物进行PCR扩增。
按照下述配方配置PCR反应溶液：
ddH2O加至20μL。
将PCR反应溶液放入PCR扩增仪中进行PCR扩增反应，反应程序设置为：93℃预变性3min，93℃变性1min，58～62℃复性1min，72℃延伸2min，40个循环，最后72℃延伸10min；
(3)PCR产物进行电泳检测：取出PCR扩增后的反应液10μL与上样缓冲液1μL混合，用1.2％琼脂糖凝胶电泳(含0.5％溴化乙锭)检测扩增结果，在893bp处出现扩增条带的样品为杭白菊，在893bp处不出现条带的样品不是杭白菊。
实施例2：
1、杭白菊PCR检测法的准确性研究
从杭白菊(浙江桐乡)、怀菊(河南焦作)、滁菊(安徽滁州)、亳菊(安徽亳州)、野菊、蒲公英、浙白术、安白术、浙白芍、安白芍、山白芍、川白芍植物中提取基因组DNA。以上述12份材料基因组DNA为模板，利用特异性引物“HBJ893-1/HBJ893-2”进行PCR扩增，PCR反应液、扩增程序、检测方法同实施例1，只是更换DNA模板，以验证杭白菊PCR检测法的准确性和可靠性，结果见图1所示，泳道1～12分别为杭白菊(浙江桐乡)、怀菊(河南焦作)、滁菊(安徽滁州)、亳菊(安徽亳州)、野菊、蒲公英、浙白术、安白术、浙白芍、安白芍、山白芍、川白芍，泳道M为marker。
图1表明，杭白菊在893bp处具有特异性的扩增条带，而其他品种没有。本发明的杭白菊PCR检测法经实验证明可以用于杭白菊的鉴定，方法准确性高，简单、效率高、重复性好。
2、杭白菊PCR检测法的灵敏度研究
将杭白菊模板DNA浓度(40ng/μL)经六个梯度进行稀释，配置六份不同浓度的杭白菊基因组DNA溶液：一份浓度为40ng/μL；一份浓度稀释为24ng/μL；一份浓度稀释为8ng/μL；一份浓度稀释为4ng/μL；一份浓度稀释为0.8ng/μL；一份浓度稀释为0.4ng/μL。
分别以这六种不同浓度的杭白菊基因组DNA作为模板(1.0μL)，以“HBJ893-1/HBJ893-2”为引物进行PCR扩增，PCR反应液、扩增程序、检测方法同实施例1，以验证杭白菊PCR检测法的灵敏度，结果见图2所示，泳道M为Marker，泳道1为40ng/μL，泳道2为24ng/μL，泳道3为8ng/μL，泳道4为4ng/μL，泳道5为0.8ng/μL，泳道6为0.4ng/μL
结果显示当杭白菊基因组DNA浓度为标准浓度的10％，即含量为4ng/μL，在893bp处依然出现杭白菊的特异性条带，经过多次重复验证，结果保持稳定，证明本发明提供的杭白菊PCR检测法灵敏度很高，含量较微弱的杭白菊也能够鉴定出来。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 杭白菊PCR鉴定试剂盒及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 893
<212> DNA
<213> 菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat)
<400> 1
actacacgaa gaatgagtag gcagcaggct gcactggaaa gaatgatggc ctcaccatag 60
gtcaattctg ttatgataat tagctagaca atgtttcatc tagtttattt cctatgtata 120
agttatgtac tataaaaaca tatgactgtg tctaactgta attctcatgc ttcaaaaagt 180
atgcaatttt atgcatttgg aattatatcc atttgcatta attatggaac catatcatgt 240
ttgtgtattt ttacagattg actaagcttg atgtacgaat aatttgcatc aaaagtaacc 300
aaagctaaac aaaacctcat aagaatgttg acaattaaaa gtcaaaccta aacaaattgt 360
tatccatctg cttacccata aggcattgaa agtaaaaaac aaaccaaact gaataattca 420
taacaatgtt gacaattaaa agtcaacttt aatcttaacc atgtgcataa agccataaac 480
atacggtaaa ccgatcataa taacaaaatt cataaccttc tggaacacaa cgttactaca 540
attcaagata atgaacatta accatcttgc ctcattacat aaaagctaaa aagttatccc 600
aatgcataaa taatcaagaa caatatccaa ctaaggacca ggtaaatctt ccacttccac 660
acatcacctt gagcagcttc taatcttgcc tcaagctcat ttctccctct caaaaggcct 720
ggtatgatca ttcttgaacg agcacagatt tcagatcata ccatcgtatc caccgacaag 780
aagaccccta ttcatgatta gggcaagtga ttaaacaaca cccattgtta caatgtagtt 840
tgctacttgc gaaaatttac aagggttttc gtgtcgggtt agtttcgtag ttc 893
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
actacacgaa gaatgagtag gcagc 25
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
gaactacgaa actaacccga cacg 24
Claims (4)
1.一种杭白菊PCR鉴定试剂盒，其特征在于所述试剂盒中的特异性引物为HBJ893-1和HBJ893-2：
HBJ893-1:5’-ACTACACGAAGAATGAGTAGGCAGC-3’；
HBJ893-2:5’-GAACTACGAAACTAACCCGACACG-3’。
2.如权利要求1所述杭白菊PCR鉴定试剂盒，其特征在于所述的杭白菊PCR鉴定试剂盒的组成为：
3.一种利用权利要求1所述杭白菊PCR鉴定试剂盒在杭白菊鉴定中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：
(1)模板DNA的提取：提取样品DNA作为PCR模板；
(2)PCR鉴定：利用杭白菊PCR鉴定试剂盒中的特异性引物HBJ893-1和HBJ893-2，进行PCR扩增：
PCR反应溶液：
将PCR反应溶液放入PCR扩增仪中进行PCR扩增反应，反应程序设置为：93℃预变性3min，93℃变性1min，58～62℃复性1min，72℃延伸2min，40个循环，最后72℃延伸10min；
(3)PCR产物电泳检测：取出PCR扩增产物10μL与上样缓冲液1μL混合，用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，在893bp处出现扩增条带的为杭白菊。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 陈绍宁 ; 顾小川 ; 姜鹏辉 ; 李晴妍 ; .基于高分辨率熔解曲线分析技术鉴别杭白菊和黄山贡菊的初步研究.浙江理工大学学报(自然科学版).2018,(03),全文. * |
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