CN110097976B

CN110097976B - 中药复方制剂的生物成分分析方法

Info

Publication number: CN110097976B
Application number: CN201910334789.7A
Authority: CN
Inventors: 宁康; 白虹; 姚奇; 朱雪
Original assignee: Huazhong University of Science and Technology; Ezhou Institute of Industrial Technology Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Huazhong University of Science and Technology; Ezhou Institute of Industrial Technology Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2019-04-24
Filing date: 2019-04-24
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2039-04-24
Also published as: CN110097976A

Abstract

本发明提供了一种中药复方制剂的生物成分分析方法，包括：样品采集并提取基因组DNA；以提取的DNA作为模板，PCR扩增其ITS2序列和trnL序列；将扩增得到的ITS2序列片段和trnL序列片段纯化并进行高通量测序；测序结果总体分析以及使用MOTHUR软件对测序原始数据进行拼接、质控和分组，得到分组后的测序数据；进行多线程化，利用多核CPU的并行处理能力，将数据按照序列ID分成多个片段，并分配多个线程并行化运行，通过blast序列比对从NCBI数据库获取中药复方制剂样品的物种信息；统计样品物种信息，并对样品物种信息进行多维分析，通过所述多维分析结果对中药复方制剂进行质量评价；效率高，精度高。

Description

中药复方制剂的生物成分分析方法

技术领域

本发明涉及中药制剂的成分分析技术领域，属于生物信息领域。

背景技术

中药是我国从古至今都在使用的药材，是千百年来通过无数的治病经历的结晶。中药在我国五千年历史中帮助了无数的人，也代表着文化的传承，是中国文化的组成部分。

中药是中医防病治病的物质基础，所以中药的品质好坏直接影响到中药在临床用药中的安全性和有效性。不断的提高中药的质量评价标准与相关研究是中药产业化、现代化、国际化的重要组成部分。近年来，随着现代生命科学、药物化学、分析化学等学科技术的不断进步，对中药的研发和建立质量标准方面都有了一定的收获。中药质量评价的水准是制约中药实现现代化与产业化的一个挑战，中药评价的标准化是实现目标的一大前提。

传统的中药质量控制，大多都是从药材产地，药材的种植、采收，药材的加工方法等方面来规范药材的质量。随着西方一些方法的引入，利用显微鉴别或利用化学方法对药材化学成分进行研究，根据药材化学成分的含量对药材进行质量评价这一方法被采用。然而人们认为如果只根据一种或几种有效成分的含量来对中药进行质量评价是不够的，应该结合定性和定量评价方式，由单项指标到多项指标实现更好的中药质量控制。

质量评价大致分为两个层次，首先是药材真伪鉴别，目前主要是通过药材形状颜色和显微观察进行鉴别。对于已经确认的正品药材，则面临质量优劣评估。由于中药不仅化学成分复杂，而且其中某一味药材也许不止一种功效，另外不同成分的功效间还相互影响。因此，药材质量优劣判断的技术难度远远高于前者。

对中药的质量进行评价时，大多数情况下，都会使用一种或几种方法同时进行，使结果更为可信。一般用的发法有高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱、气相色谱、显微鉴别等，这些方法都是经过验证且可行的。

近年来，超高效液相色谱(UPLC)与指纹图谱结合的UPLC指纹图谱技术在中药质量评价中有独特的优势。有研究表明，通过对土茯苓药材的HPLC和UPLC指纹图谱的比较，发现UPLC分析所需的时间大大超出HPLC，具有极高的效率，可用于分析中药材和中药饮片，还可用于注射剂、胶囊剂和颗粒剂的质量评价。

主成分分析法是通过与现代分析技术的结合，对样品信息进行统计处理，最大限度的保留样本的原始信息且对样品整体做出评价，常用于样本数据的综合性评价。一测多评法即利用中药中有效成分的关系，只测定其中一种成分，同时获得多个成分的结果。一测多评法一般用在中药原料和其制剂方面的质量评价，其在色谱峰定位以及相对校正因子的计算上存在一定的局限性，尤其在不同类成分的适用性上，导致这种方法的应用程度一般。由于同种生物在不同的生长期的DNA序列信息是相同的，样品部分受损也不会影响识别的结果。因此，DNA条形码技术也被用于中药质量控制。

目前，有很多研究使用DNA条码技术分析中药成分，如基于DNA条码技术的六味地黄丸的成分分析(Xinwei Cheng,et al.,2014)。但对于生物成分比六味地黄丸高的中药复方制剂(例如复方活络丸)，在测序数据量上难以大幅提高，其效率较低，且精确性、分辨率需要进一步提升。

发明内容

本发明的目的在于提供了中药复方制剂的生物成分分析方法，效率高，将从0.1的匹配精度提高到0.01的匹配精度；而且，经过多线程化计算我们将原来的属和种水平的鉴定，推进到种和菌株水平的鉴定，在分辨率上提高了一个水平；且从样本的可靠性、特异性与灵敏性、重复性和稳定性、各个厂家、各个批次之间的各个物种的聚集情况多个角度对中药复方制剂进行全面的质量评价。

为实现上述目的，本发明是这样实现的：

在本发明的目的在于提供了一种中药复方制剂的生物成分分析方法，所述方法包括如下步骤：

步骤1、样品采集并提取基因组DNA

步骤2、以提取的DNA作为模板，PCR扩增其ITS2序列和trnL序列；

步骤3、将扩增得到的ITS2序列片段和trnL序列片段纯化并进行高通量测序；

步骤4、测序结果总体分析：使用MOTHUR软件对测序原始数据进行拼接、质控和分组，得到分组后的测序数据；

步骤5、对得到的分组后的测序数据进行并行化搜索计算，利用多核CPU的并行处理能力，将数据按照序列ID分成多个片段，并分配多个线程并行化运行，通过blast序列比对从NCBI数据库获取中药复方制剂样品的物种信息；

步骤6、统计样品物种信息，并对样品物种信息进行多维分析，所述多维分析包括测序深度分析、物种成分分析、主成分分析和聚类分析，通过所述多维分析结果对中药复方制剂进行质量评价。

本发明具备的有益效果是：

1、本发明提供的一种中药复方制剂的生物成分分析方法，较现有技术的方法，其优势在与：我们充分利用了多核CPU的并行处理能力，把原有的单线程数据搜索分割为多个数据段并分配到不同的线程并行计算，高效精准地实现了高数量级、高复杂度的核酸序列在更大的数据库中的搜索计算，灵敏性高，将从0.1的匹配精度提高到0.01的匹配精度；而且，经过多线程化计算我们将原来的属和种水平的鉴定，推进到种和菌株水平的鉴定，在分辨率上提高了一个水平。

2、本发明提供的一种中药复方制剂的生物成分分析方法，blast序列比对前先经过测序结果总体分析后再经过多线程化搜索计算，测序结果总体分析时将原始数据进行了质控，从而提高了数据分析的可性度。

3、本发明提供的一种中药复方制剂的生物成分分析方法，进行了深度分析、物种成分分析、主成分分析和聚类分析的多维分析可以对中药复方制剂进行全面的质量评价，包括判断样本的可靠性、特异性与灵敏性、重复性和稳定性、各个厂家、各个批次之间的各个物种的聚集情况；其中，

深度分析对样品ITS2和trnL数据进行稀疏曲线分析。随着样本序列条数目增加，物种数目也增加直至曲线趋向平坦时，说明取样的测序深度足够合理，因此来判断样本的可靠性；

物种成分分析用于得到中药制剂所含的处方物种、非处方物种和杂质物种以及各个物种的相对含量，具体为：统计通过blast获得的物种，并获得物种在样本中的相对丰度，根据检测到的物种与第一部《中国药典》2015版记载的中成药的成分比对，来计算检测的特异性与灵敏性；

主成分分析用于评价各个厂家、各个批次之间的主成分的聚集情况和一致性，从而评价重复性和稳定性；

聚类分析用于评价样品的各个厂家、各个批次之间的各个物种的聚集情况。

附图说明

图1为实施例中大活络丸的生物成分分析流程图；

图2为DNA琼脂糖凝胶电泳图；

图3为PCR扩增电泳图，其中(a)为扩增ITS片段结果，(b)为扩增trnL片段结果；

图4为实施例中大活络丸不同厂家样品检测到的不同物种数目，其中(a)为基于ITS2的两个厂家的物种组成分析，(b)为基于trnL的两个厂家的物种组成分析；

图5为大活络丸样品的稀疏曲线，其中(a)为基于ITS2的稀疏曲线，(b)为基于trnL的稀疏曲线；

图6为实施例中大活络丸样品生物成分分析图，(a)为样品DHWB.II.2基于ITS2的处方物种和非处方物种的属水平鉴定结果，(b)为样品DHWB.III.3基于trnL的处方物种和非处方物种的属水平鉴定结果；

图7为实施例中大活络丸样品主成分分析图，其中(a)为基于ITS2的PCA结果，(b)为基于trnL的PCA结果；

图8为实施中大活络丸样品网络聚类分析图，其中(a)为基于ITS2的分析结果，(b)为基于trnL的分析结果。

具体实施方式

本实施例针对复方大活络丸进行生物成分分析，具体包括如下步骤：

一、样品采集及基因组的提取

1、取武汉中联药业股份有限公司和北京同仁堂股份有限公司的复方大活络丸，每个厂家3个批次，如表1所示，每个样品进行3个生物重复，共18个分析样品。所使用的仪器规格、厂家及其型号如表2所示。

表1-样品信息

表2-仪器信息

2、用洁净的刀片将刚拆封或者保存良好的大活络丸切下适量，精密称取1g大小的大活络丸。按每克加入两毫升溶解液(1M Tris-HCl(pH 8.0)10mL和0.5M EDTA(pH 8.0)4mL定容)计算，使溶液呈现为泥状且没有大块的药丸；

3、取0.5mL液体，然后向每个EP管中加入一毫升的裂解液(在10％CTAB20mL中加1MTris-HCl(pH 8.0)10mL和0.5M EDTA(pH 8.0)4mL，再加入5M NaCL 28mL溶液定容)、0.1mL10％SDS溶液、0.1mL巯基乙醇(通风橱内操作)和十微升的蛋白酶K，涡旋震荡混匀；

4、65℃金属浴裂解至少两个小时，期间混匀数次，开始使用涡旋震荡器混匀，之后轻轻混匀，避免破坏DNA结构；裂解结束后按照一万二千五百转每分钟的转速离心5分钟，取离心后的上清液到两毫升的EP管中；

5、加入等体积的苯酚、氯仿和异戊醇(25:24:1)混合溶液，加入时混合液与之前的上清分层；轻轻颠倒混匀，按照一万二千五百转每分钟的转速离心10分钟；取上清至新两毫升EP管，再执行一次第四步；

6、加入等体积的氯仿与异戊醇(24:1)混合溶液，轻轻混匀之后，按照一万二千五百转每分钟的转速离心十分钟，取上清到新一点五毫升EP管；

7、加入零点六倍体积的异丙醇后(四摄氏度存放，方便使用)，放入冰箱中负二十摄氏度情况下沉淀至少三十分钟，有时沉淀过夜(时间长时效果较好)；

8、将经过至少三十分钟沉淀后的溶液按照一万二千五百转每分钟的转速离心两分钟；倒掉上清，用百分之七十五的乙醇溶液洗涤，按照一万二千五百转每分钟的转速离心一分钟；重复洗涤两次，倒掉上清后，将EP管放置在通风橱中直到乙醇挥发干(可见的固体物质不再贴壁)，加入三十微升TE溶解；

9、取3μL上述步骤得到的溶液用于1％的琼脂糖凝胶电泳检测(120V，30min；型号：DYCP-31DN，北京六一仪器)，紫外光下查看结果并拍照记录(图2)，说明复方大活络丸中含有生物成分的DNA。

二、PCR扩增

1、使用50μL体系，包括30.5μL双蒸水；10.0μL的5×buffer；正向引物(10μm)各1.0μL；4.0μLdNTPS(4*2.5μm)；0.5μL EasyTaq(5U/μL)；2μL DMSO；模板1.0μL(100ng/μL左右)。

2、ITS2扩增:使用正向引物S2F(5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3')和反向引物S4R(3'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-5')，前端加上7bp大小的不同的标签。刚开始是95℃预变性5分钟；然后95℃变性30秒，62℃退火30秒，72℃延伸30秒，循环8次，此阶段每次将退火温度降低0.5℃；接着95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，循环30次；接着72℃延伸10分钟。

3、trnL扩增：正向引物trnL-c(5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3')和反向引物trnL-h(3'-CCATTGAGTCTCTGCACCTATC-5')，前端加上7bp大小的不同的标签。刚开始是95℃预变性5分钟；然后95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，循环8次，此阶段每次将退火温度降低0.5℃；接着95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，循环30次；接着72℃延伸10分钟。

4、待温度降至25℃后，取扩增后的PCR产物取5μL用于2％琼脂糖电泳检测(120V，40min)，紫外光照射下查看结果并拍照(图3)，说明中药制剂中可提取出来自于生物成分的DNA。

5、胶回收纯化及Illumina MiSeq平台测序。

三、将扩增后的产物使用北京全式金生物公司的胶回收试剂盒进行回收纯化，之后在Illumina MiSeq平台进行测序。

四、测序结果总体分析

使用FastQC软件包对测序后的数据进行总体的质量评估，并MOTHUR软件中的make.contings软件包对将原始数据拼接、trim.seqs命令去除少于150的ITS2标记的序列和小于75的trnL标记的序列，最后按照DNA条码拆分得到36个样品。

对得到的数据进行统计之后，结果表明所有样品的序列数之和高达2,500,000条序列，包含ITS2序列数1,471,415，trnL序列数1,030,563。其中9个武汉中联样品共有820,044条ITS2序列和443,831条trnL序列，9个同仁堂样品共有651,371条ITS2序列和586,732条trnL序列。

五、数据并行化搜索计算

将大活络丸的18个样本(9个ITS2标记的样本和9个trnL标记的样本)按照序列分成多个片段，并分配16个线程同时处理，并将NCBI的核酸序列数据库作为检索数据库，进行序列比对，将匹配到的多个目标序列的ID后，按照打分从高到低排列，并按照样本中原始序列ID，将获得的序列信息(blast获得的物种的ID,名称，得分)追加到原始数据中，实现高数量级、高复杂度的大活络丸样品的物种信息的匹配。

为了降低数据库对ITS2和trnL分析结果的影响，将trnL数据统计结果中相对丰度小于0.001的非处方物种数据和丰度小于0.002的ITS2标记的非处方物种数据去掉，保留所有的处方物种的数据。

两种条形码分析结果有较大的差异，其中对ITS2数据分析得到的处方物种数目较多，trnL数据得到的处方物种数目较少，表明此次试验，ITS2序列能得到的处方物种信息更多。通过对ITS2和trnL数据的分析，共得到18种处方物种的信息，具体见表3和表4。

六、统计样品物种信息及多维分析：

1、测序深度的分析：对复方大活络丸的ITS2和trnL数据进行稀疏曲线分析，如图4，其中x轴表示样本序列数量，y轴表示检测都得物种数量。采用R语言(3.5.2)的“vegan”软件包中rarefaction函数绘制稀释曲线。

稀疏曲线表明，随着序列数的增加，检测到的物种数目趋于稳定。说明本实验的样本覆盖率足够，测序的深度是可以满足后续分析的。其中ITS2的稀疏曲线中可以看出DHWB.I的三个样品的序列数相对较低，序列数差异较大是因为这三个样品的测序时间不同的结果。trnL中DHWB.I三个样品的序列数远大于其他样品，这是因为这三个样品的测序时间不同的结果。

2、物种成分分析：

(1)统计处方物种成分：大活络丸基于ITS2条码技术检测到的处方物种成分如表3所示；基于trnL条码技术检测到大活络丸的处方物种成分如表4所示。

表3-大活络丸基于ITS2条码技术检测到的处方物种成分

表4-基于trnL条码技术检测到大活络丸的处方物种成分

(2)统计处方物种样本数：

①基于ITS2条码技术两个厂家检测到大活络丸的处方物种出现的样本数如表5所示；

表5-基于ITS2条码技术两个厂家检测到大活络丸的处方物种出现的样本数

由表5可知，根据ITS2检测到的16个处方物种当中，厂家A(武汉中联)中黄连、细辛、当归、麻黄、葛根、广藿香、赤芍、乌药和甘草在9个样品中都被检测到；厂家B(同仁堂)中黄连和赤芍在9个样品中都被检测到。从对应两个厂家的18个样品来说，大部分处方物种的被检率(检测到某一物种的样品数目/18个样品)均大于60％。

②基于trnL条码技术两个厂家检测到大活络丸的处方物出现的样本数如表6所示。

表6-基于trnL条码技术两个厂家检测到大活络丸的处方物种出现的样本数

由表6可知，根据trnL检测到的6个处方物种中，属于武汉中联的样品中的处方物种里的豆蔻、黄连、大黄、黄芩和赤芍的被检率为100％，属于同仁堂中的样品中的处方物种豆蔻、黄连、大黄、黄芩和赤芍的情况也是如此。从两个厂家对应的18个样品来说，大部分处方物种的被检率均为100％。黄连在36个样品中均检测到，说明黄连基因组比较容易提取，其余的基因组提取成功率相对较低。

由于中药制剂是被限制过的，找到的应该有的处方物种不多，潜在可能有掺杂使假。非处方物种和替代物种较多，说明污染程度较高，同时证明了本分析方法能够应用于质量控制。

(3)统计处方物种、替代物种、非处方物种以及物种的相对含量：

①基于ITS2数据分析，每个样品平均得到13.45个处方物种(药典中该中药制剂处方收载的物种)，4.34个替代物种(与处方物种同属不同种)，27.5个非处方物种(处方物种和替代物种以外的物种)(图5a)。从大活络丸样品中检测到16个处方物种，但这16个处方物种的占相应样品总序列数的比例均较低。超过各样品总序列数的10％的有当归(Angelicasinensis)、赤芍(Paeonia lactiflora)、和广藿香(Pogostemon cablin)三种，细辛(Asarum heterotropoides、Asarum sieboldii)、甘草(Glycyrrhiza inflata、Glycyrrhiza uralensis)的含量超过各样品总序列数的5％，只有葛根(Pueraria lobata)和黄连(Coptis chinensis)的含量超过各样品总序列数的1％。

18个样品的处方物种中，赤芍和广藿香的相对含量(占该样品处方物种序列总数的比例)高，两者的相对含量之和在45％到95％之间；此外其中有九个样品，分别是DHWA.I.1，DHWA.I.3，DHWA.II.1以及DHWB.II和DHWB.III各三个样品，这其中处方物种当归的相对含量在10％到25％之间；样品DHWB.II.2中细辛占该样品处方物种序列总数的10％左右；样品DHWA.II.1样品DHWB.III.3中甘草占该样品处方物种序列总数的比例分别为24％和13％。

②基于trnL数据分析，每个样品平均得到6.00个处方物种，6.56个替代物种，28.17个杂质物种(图5b)。在9个trnL样本中共检测到6个处方物种，且处方物种占样品总序列数的比例较小。只有黄芩(Scutellaria baicalensis)的含量超过各样品总序列数5％，黄连、赤芍、熟地黄(Rheum palmatum)和的含量超过各样品总序列数的1％。而6个样品的处方物种中，18个样品中都含有黄芩，其相对含量从25％到91％不等，相对含量为的平均值63％；有十一个样品的黄连相对含量大于10％，其中三个样品(DHWB.I.1，DHWB.I.2，DHWB.I.3)的相对含量均大于30％；有六个样品的熟地黄的相对含量大于10％，其中两个样品(DHWA.III.1和DHWA.III.3)的相对含量在60％左右；两个样品(DHWB.II.2和DHWB.II.3)的处方物种豆蔻相对含量超过10％。

③各个样品鉴定到的物种成分不同，例如其中两个样品的鉴定结果(图6)

大活络丸样品DHWA.III.3号样品基于ITS2鉴定到12个种处方物种和7个非处方物种的属。

大活络丸样品DHWA.II.1号样品基于trnL检测到6个处方物种和8个非处方物种的属。

大活络丸样品DHWB.II.2号样品基于ITS2的处方物种和非处方物种的种水平鉴定结果：Paeonia lactiflora,Paeonia veitchii Panax ginseng,Pogostemon cablin,Rheum officinale,Amomum compactum Anemone raddeana,Asarum sieboldii,Atractylodes macrocephala,Glycyrrhiza uralensis,Saposhnikovia divaricata为处方物种，其中Pogostemon cablin丰度最高。

大活络丸样品DHWB.III.3号样品基于trnL的处方物种和非处方物种的属水平鉴定结果：Glycyrrhiza uralensis,Panax ginseng,Pogostemon为处方物种，丰度较高。

综上表明，以ITS2和trnL作为条形码鉴定大活络丸中的生物成分是可行的。各个样品根据ITS2和trnL鉴定到的处方物种情况(表3，4)。

④根据ITS2数据表示，共检测到127个属的非处方物种，其中在除DHWB.I三个样品外的15个样品中的非处方物种中旋花科菟丝子属量很高(最高达该样品总序列数的80％)，在DHWBI三个样品非处方物种中豆科花生属含量很高(占该样品总序列数的90％以上)。而根据trnL数据表示，共检测到103个属的非处方物种，其中除DHWB.I.2和DHWB.I.3之外的16个样品中茄科马尿泡属属占样品总序列数的比例在20％-60％之间，DHWB.I.2中毛茛科白头翁属占样品总序列数的35％，DHWB.I.3中毛茛科白头翁属和樟科樟属占样品总序列数的的比例均大于20％。造成这些结果差异的原因除了测序批次不同外，最主要的原因可能是实验中混入了杂质。

3、主成分分析

将大活络丸的18个样本作为列，检测到的所有物种作为行，得到样本矩阵X，并对矩阵X进行归一化，使得样本的均值为0；其次，计算大活络丸18样本矩阵X的斜方差矩阵并将按照从小到大顺序排列，取出前行特征值得到特征向量矩阵P，进而根据Y＝PX获得样本间的相关系数矩阵；然后计算各成分的贡献率(对样本的贡献占比，即为pc1/(pc1+pc2+…+pc18)，取贡献率最大的两个成分，最后将厂家作为分组的标准，在R中采用“ade4”可视化(如图7)。图7可知厂家A的样本均聚集在一起，而厂家B的较为分散，说明了厂家A的大活络丸质量更为稳定，具体地：

通过将大活络丸样品分成按两个厂家来分组分析发现，基于ITS2标记的武汉中联的九个样品聚在一起(图7a)，说明本次实验中武汉中联的样品生成及保存过程中重复性和稳定性相对较好；而同仁堂的样品就呈现为分散形式，其不同之处主要是因为旋花科、豆科的非处方物种含量引起。而根据trnL数据(图7b)表示，武汉中联的九个样品聚在一起，说明本次实验中武汉中联的样品的生物成分相近，同仁堂中有5个样品聚在一起，而有4个则不同，是由茄科、毛茛科和樟科引起。综合来看，属于武汉中联的样品一致性比同仁堂样品的好。

4、网络聚类分析

以“1”来表示物种存在，以“0”来表示物种不存在，获得0-1矩阵，计算18个样本之间的欧氏距离，并以样本作为网络的节点，样本间的距离作为边，在Cytoscape软件中可视化(图8)。

按ITS2结果来看，同仁堂的样品非常分散，武汉中联的样品中大多都聚在一起；按trnL结果来看，同仁堂的样品非常分散，武汉中联的样品中大多都聚在一起。由于非处方物种的关系，不同厂家生产的同一种药剂也存在明显的差异。可见针对重要制剂生物成分分析的很有必要的。

六、对中药复方制剂进行质量评价

综上表明，ITS2条码技术检测中药复方的生物成分的效果要明显优于trnL条码技术，而且不同厂家不同批次间的中药复方制剂均存在差异性。武汉中联的样品的质量较同仁堂的样品的质量更优。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种中药复方制剂的生物成分分析方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤1、样品采集并提取基因组DNA；

步骤2、以提取的DNA作为模板，PCR扩增其ITS2序列和trnL序列；

步骤4、测序结果总体分析以及使用MOTHUR软件对测序原始数据进行拼接、质控和分组，得到分组后的测序数据；

步骤5、对得到的分组后的测序数据进行多线程化搜索计算，利用多核CPU的并行处理能力，将数据按照序列ID分成多个片段，并分配多个线程并行化运行，通过blast序列比对从NCBI数据库获取中药复方制剂样品的物种信息；

步骤6、统计样品物种信息，并对样品物种信息进行多维分析，所述多维分析包括测序深度分析、物种成分分析、主成分分析和聚类分析，通过所述多维分析结果对中药复方制剂进行质量评价；

所述主成分分析的具体实施方法为：

S1、将测序原始数据按样本为行m，物种为列n，组成矩阵X，并进行数据标准化，即分别求行和列的平均值，再将行和列的数值减去行和列的平均值，得到标准化矩阵X为DataAdjust(m×n)；

S2、求矩阵X的协方差矩阵，协方差矩阵是n×n；

S3、求协方差的特征值和特征向量；

S4、第将特征值按照从大到小的顺序排序，选择其中最大的k个，然后将其对应的k个特征向量分别作为列向量组成特征向量矩阵，选取的k个特征向量组成的矩阵P为EigenVectors(n×k)；

S5、将样本点投影到选取的特征向量上：投影后的数据为Y = PX将矩阵X降维到矩阵Y；

S6、计算取各成分的贡献率，并取贡献率最大的两个成分；

S7、将不同厂家作为样本的分组，绘制PCA图。

2.如权利要求1所述的中药复方制剂的生物成分分析方法，其特征在于，所述步骤2中ITS2扩增引物为：

正向引物S2F ：5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'；

反向引物S4R：3'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-5'；

trnL扩增引物为：

正向引物trnL-c ：5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3'；

反向引物trnL-h ：3'-CCATTGAGTCTCTGCACCTATC-5'。

3.如权利要求1所述的中药复方制剂的生物成分分析方法，其特征在于，所述步骤4中具体为用MOTHUR软件中的make.contings对将原始数据拼接，然后用trim.seqs命令进行质控，最后按照DNA条码拆分得到多个样品分组后的测序数据。

4.如权利要求3所述的中药复方制剂的生物成分分析方法，其特征在于，所述用trim.seqs命令进行质控具体为：rim.seqs命令去除相对丰度小于0.001的ITS2标记的序列和相对丰度小于0.002的trnL标记的序列。

5.如权利要求1所述的中药复方制剂的生物成分分析方法，其特征在于，所述步骤5中将样本按照序列分成多个片段的个数根据多核CPU的使用率来确定。

6.如权利要求1所述的中药复方制剂的生物成分分析方法，其特征在于，所述步骤6中测序深度分析具体为对中药复方制剂的ITS2或trnL数据进行稀疏曲线分析，所述稀疏曲线分析为以ITS2或trnL的序列数为横坐标，以检测到的物种数量为纵坐标进行的数据分析。

7.如权利要求1所述的中药复方制剂的生物成分分析方法，其特征在于，所述步骤6中物种成分分析为基于ITS2和trnL鉴定到的处方物种、非处方物种和替代物种。

8.如权利要求1所述的中药复方制剂的生物成分分析方法，其特征在于，所述步骤6中主成分分析为一种利用降维思维，将多个指标按照一定的计算方法计算，得到一个或几个有代表性的综合性指标的方法。

9.如权利要求1所述的中药复方制剂的生物成分分析方法，其特征在于，所述步骤6中的聚类分析具体为：以“1”来表示物种存在，以“0”来表示物种不存在，获得0-1矩阵，计算18个样本之间的欧氏距离，并以样本作为网络的节点，样本间的距离作为边，在Cytoscape软件中可视化。