CN107058605A - 一种同时鉴别南、北柴胡的荧光pcr检测引物组、探针组合物、试剂盒及检测方法与应用 - Google Patents

一种同时鉴别南、北柴胡的荧光pcr检测引物组、探针组合物、试剂盒及检测方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时鉴别南、北柴胡的引物组、探针组合物、试剂盒及检测方法和应用。本发明以南、北柴胡的特异性引物对待测样本DNA提取物进行PCR扩增，并设计柴胡通用引物作为质控，为正品南、北柴胡的检测和鉴定提供准确的靶标位点，快速准确进行鉴定。本发明的检测方法简便，快捷，有效，能够快速准确的鉴定出正品南、北柴胡成分。

Description

一种同时鉴别南、北柴胡的荧光PCR检测引物组、探针组合物、 试剂盒及检测方法与应用
技术领域
本发明涉及一种检测方法，具体涉及一种同时鉴别南、北柴胡的荧光PCR检测引物组、探针组合物、试剂盒及检测方法与应用。属于分子生物学检测技术领域。
背景技术
柴胡，是伞形科(Umbelliferae)柴胡属(Bupleurum L.)植物的干燥根，始载于《神农本草经》，原名茈胡，列为上品。至《本草图经》始易其名为柴胡。具有解表和里、疏肝解郁、升举阳气之功效，为中医治疗少阳证的首选要药。2015年版《中国药典》规定北柴胡(BupleurumchinenseDC.)和狭叶柴胡(Bupleurum scorzonerifolium Willd.，即南柴胡)为正品。全世界已报道的柴胡属植物约有200种，中国分布42种、17变种、7变型。中国药用柴胡主要是来自25种、8个变种、3个变型的伞形科(belliferae)芹亚科(Apioideae)柴胡属(Bupleurum)的植物。柴胡属植物众多，分布广泛，在产地均作柴胡药用，造成柴胡药材的品种混杂问题十分严重，药材质量极不稳定。常见的混伪品有一些柴胡属植物，如黑柴胡(Bupleurum smitti Wolff.)、银州柴胡(Bupleurum yinchwensen Shan et Y Li)、柴首(Bulpeurum chaishoui Shan et Sheh)、大叶柴胡(Bupleurum longiradiatum Turcz.)、秦岭柴胡(Bupleurum longicaule Wall wx DC.Var.Giraldii Wolff.)。尤其大叶柴胡(Bupleurum longiradiatum Turcz.)是有毒，服用后出现恶心、呕吐等中毒症状，不可当柴胡用药。
然而仅用性状鉴别、显微鉴别及理化鉴别方法较难清楚的区分市场上的柴胡品种，因此，建立更加可靠柴胡鉴别方法对于保证柴胡药材的质量及用药安全具有重要意义。
目前，柴胡的鉴定主要依靠形态学特征或其中的化学成分柴胡皂苷a、d的检查，然而，由于柴胡属植物多数形态、组织较为接近，且受产地、生态环境、采收时间、加工方法等因素的影响，同一种柴胡在各方面的生药鉴别特征也会有所变化，这就更增加了柴胡药材鉴别的难度。随着分子生物学技术的发展，一些基于DNA的生物学鉴定手段逐渐丰富起来，DNA分子法主要是利用显示生物特征的各种生物物种所具有的不同DNA序列信息进行鉴别，它可以突破依据感官检测的局限性，与传统分析方法相比，更加具有客观性和准确性。目前国内外研究柴胡鉴别的分子手段主要是DNA条形码技术，通过DNA测序手段比较柴胡的ITS序列进行鉴别操作复杂，仪器配套成本高，局限性大。近年来实时荧光PCR技术的飞速发展大大提高了检测的灵敏度、特异性和准确性，并使得成分含量的定量溯源成为可能，因此，利用实时荧光PCR技术进行南、北柴胡真伪鉴别的方法更加可信、灵敏。
发明内容
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种同时鉴别南、北柴胡的荧光PCR检测引物组、探针组合物、试剂盒及检测方法与应用。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种同时鉴别南、北柴胡的荧光PCR检测引物组，包括：
(1)南柴胡源性荧光PCR检测引物，其核苷酸序列如下：
南柴胡正向引物BSF：5'-CAGAATCCCGTGAACCATCG-3'，如SEQ ID NO.1所示；
南柴胡反向引物BSR：5'-TAAACCAGCCGCACGACG-3'，如SEQ ID NO.2所示；
(2)北柴胡源性荧光PCR检测引物，其核苷酸序列如下：
北柴胡正向引物BCF：5'-CGTCGTGCGGCTGGTTTA-3'，如SEQ ID NO.3所示；
北柴胡反向引物BCR：5-TTGCTCACAGAGTAAACGGGCT-3'，如SEQ ID NO.4所示；
(3)柴胡源性荧光PCR检测通用引物，其核苷酸序列如下：
柴胡通用正向引物BUF：5'-AAACGACTCTCGGCAACG-3'，如SEQ ID NO.5所示；
柴胡通用反向引物BUR：5'-CGTGCCCTCAGCCTAATG-3'，如SEQ ID NO.6所示；
一种同时鉴别南、北柴胡的荧光PCR探针组合物，包括：
(1)南柴胡特异性探针，其核苷酸序列如下：
南柴胡特异性探针BSP：5'-CCTCCGCAGCTCGCTCGAAG-3'，如SEQ ID NO.7所示；
(2)北柴胡特异性探针，其核苷酸序列如下：
北柴胡特异性探针BCP：5'-AAGAGAGTCACCGGAGATCGGAAAAC-3'，如SEQ ID NO.8所示；
(3)柴胡通用探针，其核苷酸序列如下：
柴胡通用探针BUP：5'-CGTAGCGAAATGCGATACTTGGTG-3'，如SEQ ID NO.9所示。
作为优选的技术方案之一，基于DNA条形码技术原理选择ITS2基因为目标靶基因，在Genbank搜索并下载南、北柴胡及常见伪品ITS2基因序列，通过Mega5分析软件设计引物和TaqMan荧光探针。
作为优选的技术方案之一，探针序列的5’端修饰有报告基团，3’端修饰有淬灭基团，其中所述报告基团为FAM、HEX、TAMRA、ROX、CY5中的任一种，所述淬灭基团为Dabcyl、BHQ1，BHQ2中的任一种。
一种同时鉴别南、北柴胡的荧光PCR检测试剂盒，包括上述荧光PCR检测引物组和探针组合物，以及南、北柴胡DNA提取液和多重实时荧光PCR反应扩增体系。
作为优选的技术方案之一，所述PCR检测试剂盒还包括南、北柴胡阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。
作为优选的技术方案之一，所述多重实时荧光PCR反应扩增体系采用20μL反应体系，包括：2×TaqMan Master Mix(pH值为8.9，镁离子浓度为2.5mM，4种dNTP的终浓度各为250μM，Taq酶的用量为1U/反应)，引物组终浓度0.1～0.5μM，探针组合物终浓度0.05～0.25μM，DNA用量1～100ng，如表1所示。
表1.PCR反应扩增体系
试剂名称 工作浓度 用量(μL) 终浓度
TaqMan Master Mix 2× 10 1×
引物组 2～10μM 1 0.1～0.5μM
探针组合物 1～5μM 1 0.05～0.25μM
DNA模板 0.5～50ng/μL 2 1～100ng
双蒸水 6
总体积 20
上述引物组、探针组合物或试剂盒在同时鉴别南、北柴胡中的应用。
一种用于同时鉴别南、北柴胡的检测方法，具体步骤如下：
(1)从待测样品中提取DNA为模板，选择靶基因；
(2)利用上述的引物组作为PCR扩增引物，并使用上述试剂盒进行PCR扩增；
(3)设立阳性对照、阴性对照及空白对照，分析实验结果，给出第n个循环时的荧光增加值ΔRn与扩增曲线Ct值，根据不同探针荧光信号及扩增曲线Ct值来判定是否含有南柴胡和北柴胡成分。
作为优选的技术方案之一，步骤(1)中DNA的提取使用植物基因组试剂盒，并按其说明书进行提取。
作为优选的技术方案之一，步骤(1)中靶基因选自内转录间隔区ITS2基因，相比于植物其他基因在核糖体rDNA整体结构功能上的特殊，既具有一定的保守性，又具有较高的可变性，其序列在不同种类、或同种的不同个体中都可能存在较大差异，故利用ITS2序列作为北柴胡鉴定靶基因具有既简明又可靠的特性。
作为优选的技术方案之一，步骤(2)进行PCR扩增时，需在4通道或4通道以上的任何型号的荧光定量PCR仪上进行，扩增程序：95℃10min，预变性；95℃10s，60～63℃35s(在此收集荧光信号)，45个循环，根据不同型号的PCR仪的不同要求可以对标记荧光号进行相应的调整。
本发明的有益效果：
本发明靶基因选自内转录间隔区ITS2基因，相比于植物其他基因在核糖体rDNA整体结构功能上的特殊，既具有一定的保守性，又具有较高的可变性，种间差异显著，故利用ITS2序列作为柴胡鉴定靶基因具有特性强，准确性高。
本发明设计南、北柴胡特异性引物、特异性探针双重特异性大大提高了南、北柴胡鉴别的准确性和可靠性。同时设计柴胡的通用引物及通用探针，可有效避免假阴性出现，多重实时荧光定量PCR是在同一管内检测，无需开盖，不易污染，具有准确稳定、操作简单，灵敏度高，特异性强，通量大等有益效果，能快速准确的鉴定南北柴胡药材、粉末制剂，或种苗等样本材料。总之，本发明可用于南、北柴胡真伪的快速同时鉴别，为中草药柴胡市场的健康稳定发展具有重要的意义。
附图说明
图1.当FAM、ROX荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本检出北柴胡成分
图2.JOE、ROX荧光修饰探针有扩增曲线，且满足Ct≤35说明待检样本检出南柴胡成分。
图3.只有ROX荧光修饰探针有扩增曲线，且满足Ct≤35说明待检样本为伪品柴胡。
图4.南柴胡特异性扩增曲线图，其他伪品柴胡只有ROX荧光修饰探针有扩增曲线。
图5.北柴胡特异性扩增曲线图，其他伪品柴胡只有ROX荧光修饰探针有扩增曲线。
图6.北柴胡模板分别为10ng、2ng、0.4ng、0.08ng、0.016ng时的灵敏度扩增曲线图。
图7.南柴胡模板分别为10ng、2ng、0.4ng、0.08ng、0.016ng时的灵敏度扩增曲线图。
图8.FAM、JOE、ROX荧光修饰探针信号同时扩增，且满足Ct≤35说明待检样本检出南、北柴胡。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
本发明中所用实验材料、试剂与仪器如下：
实验材料：
北柴胡、南柴胡、银州柴胡、小叶黑柴胡、锥叶柴胡、竹叶柴胡、膜缘柴胡、藏柴胡、窄竹叶柴胡、白术、人参、党参、生地、石斛、山药、鸡血藤、川贝、枸杞等植物。
所用试剂：
植物DNA提取试剂盒，DNA分子量MakerDL2000、电泳上样缓冲液等PCR反应试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。引物与探针由生工生物工程(上海)有限公司负责合成。2×TaqMan Master Mix为DBI Bioscience品牌。DNA测序由山东省农业科学院生物技术中心测序中心完成。
所用仪器：ABI 7500荧光定量PCR仪为ABI公司产品，Takara PCR仪为宝生物工程(大连)有限公司产品。5424D型高速离心机为Eppendorf公司产品。
实施例1
1、柴胡及伪品样本DAN提取：
采用植物DAN提取试剂盒提取，具体操作步骤见试剂盒说明书。提取的基因组DNA经紫外分光光度计测定其纯度和浓度。测定OD260/OD280值均为1.8～1.9左右，浓度在10ng/μL以上，说明DNA纯度较高，浓度适中，符合PCR扩增要求。
2、靶基因的选择和引物的设计：
ITS2序列是介于5.8S和28S rRNA基因之间的非编码序列，因其在核糖体rDNA整体结构功能上的特殊，既具有一定的保守性，又具有较高的可变性，其序列在不同种类、或同种的不同个体中都可能存在较大差异，因此，利用ITS2序列作为北柴胡鉴定靶基因具有既简明又可靠的特性。
各核苷酸序列见表1。
表1.引物和探针序列
3、南、北柴胡的荧光检测：
选用20μL的实时荧光PCR扩增体系，反应体系见表3。
表3.PCR反应扩增体系
试剂名称 浓度 用量(μL)
TaqMan Master Mix 2× 10
引物组 10μM 1
探针组合物 1～5μM 1
DNA模板 20ng/μL 2
双蒸水 6
总体积 20
4、PCR扩增条件为：95℃2min；95℃10s，62℃，35s，在此收集荧光信号，45个循环。
5、结果分析：每次试验设立阳性对照、阴性对照及空白对照，试验结束后打开分析软件，分析实验结果，给出ΔRn(第n个循环时的荧光增加值)与扩增曲线Ct值，根据相应的探针荧光信号及扩增曲线Ct值来判定待测样品是否为南、北柴胡。结果见图1，当FAM、ROX荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本检出北柴胡成分；图2显示JOE、ROX荧光修饰探针有扩增曲线，且满足Ct≤35说明待检样本检出南柴胡成分；图3显示只有ROX荧光修饰探针有扩增曲线，且满足Ct≤35说明待检样本为伪品柴胡。
实施例2特异性验证
利用本发明设计的引物和探针，分别以北柴胡、南柴胡、银州柴胡、小叶黑柴胡、锥叶柴胡、竹叶柴胡、膜缘柴胡、藏柴胡、窄竹叶柴胡、白术、人参、党参、生地、石斛、山药、鸡血藤、川贝、枸杞等植物总基因组DNA为模板，进行实时荧光PCR检测，验证其引物和探针的特异性。其结果见表4及图4和图5，结果表明本研究所设计的探针及引物具有很强的特异性。
表4.特异性验证试验
实施例3灵敏度实验
将南、北柴胡的基因组DNA定量到50ng，按5×梯度稀释，每个梯度均取2.0μL为模板量，(即：10ng、2ng、0.4ng、0.08ng、0.016ng)进行实时荧光定量PCR检测，评估本发明的检测限。见图6和图7结果表明本方法检测限为0.08ng，说明本发明所提供的方法具有很高的灵敏度。
实施例4实际样本测试
取柴胡干根、新鲜苗、种子、柴胡粉剂等69份样本来自全国安徽亳州，河北安国等中药材市场，以及山东章丘、山西闻喜县、河北涉县、甘肃、内蒙赤峰等柴胡种植基地，标准样来自山东省食品药品检验研究院。使用本发明提供的试剂盒及检测方法对上述样本检测，并与测序结果，形态学鉴定及液相色谱检测方法进行验证，结果显示本方法与测序结果完全一致，相比形态学及液相方法更加准确可靠，灵敏快速，适用于柴胡幼苗、种子根茎等各种组织形态的样本鉴别。统计见表5，混合样本见图8。
表5.实际样本测试
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省农业科学院生物技术研究中心
<120> 一种同时鉴别南、北柴胡的荧光PCR检测引物组、探针组合物、试剂盒及检
测方法与应用
<130> 2017
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 南柴胡正向引物BSF
<400> 1
cagaatcccg tgaaccatcg 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 南柴胡反向引物BSR
<400> 2
taaaccagcc gcacgacg 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 北柴胡正向引物BCF
<400> 3
cgtcgtgcgg ctggttta 18
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 北柴胡反向引物BCR
<400> 4
ttgctcacag agtaaacggg ct 22
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 柴胡通用正向引物BUF
<400> 5
aaacgactct cggcaacg 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 柴胡通用反向引物BUR
<400> 6
cgtgccctca gcctaatg 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 南柴胡特异性探针BSP
<400> 7
cctccgcagc tcgctcgaag 20
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 北柴胡特异性探针BCP
<400> 8
aagagagtca ccggagatcg gaaaac 26
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 柴胡通用探针BUP
<400> 9
cgtagcgaaa tgcgatactt ggtg 24

Claims (10)

1.一种同时鉴别南、北柴胡的荧光PCR检测引物组，其特征在于，包括：
(1)南柴胡源性荧光PCR检测引物，其核苷酸序列如下：
南柴胡正向引物BSF：5'-CAGAATCCCGTGAACCATCG-3'，如SEQ ID NO.1所示；
南柴胡反向引物BSR：5'-TAAACCAGCCGCACGACG-3'，如SEQ ID NO.2所示；
(2)北柴胡源性荧光PCR检测引物，其核苷酸序列如下：
北柴胡正向引物BCF：5'-CGTCGTGCGGCTGGTTTA-3'，如SEQ ID NO.3所示；
北柴胡反向引物BCR：5-TTGCTCACAGAGTAAACGGGCT-3'，如SEQ ID NO.4所示；
(3)柴胡源性荧光PCR检测通用引物，其核苷酸序列如下：
柴胡通用正向引物BUF：5'-AAACGACTCTCGGCAACG-3'，如SEQ ID NO.5所示；
柴胡通用反向引物BUR：5'-CGTGCCCTCAGCCTAATG-3'，如SEQ ID NO.6所示。
2.一种同时鉴别南、北柴胡的荧光PCR探针组合物，其特征在于，包括：
(1)南柴胡特异性探针，其核苷酸序列如下：
南柴胡特异性探针BSP：5'-CCTCCGCAGCTCGCTCGAAG-3'，如SEQ ID NO.7所示；
(2)北柴胡特异性探针，其核苷酸序列如下：
北柴胡特异性探针BCP：5'-AAGAGAGTCACCGGAGATCGGAAAAC-3'，如SEQ ID NO.8所示；
(3)柴胡通用探针，其核苷酸序列如下：
柴胡通用探针BUP：5'-CGTAGCGAAATGCGATACTTGGTG-3'，如SEQ ID NO.9所示。
3.根据权利要求2所述的探针组合物，其特征在于，探针序列的5’端修饰有报告基团，3’端修饰有淬灭基团，其中所述报告基团为FAM、HEX、TAMRA、ROX、CY5中的任一种，所述淬灭基团为Dabcyl、BHQ1，BHQ2中的任一种。
4.一种同时鉴别南、北柴胡的荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的荧光PCR检测引物组和权利要求2所述的探针组合物，以及南、北柴胡DNA提取液和多重实时荧光PCR反应扩增体系。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR检测试剂盒还包括南、北柴胡阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述多重实时荧光PCR反应扩增体系采用20μL反应体系，包括：2×TaqMan Master Mix，引物组终浓度0.1～0.5μM，探针组合物终浓度0.05～0.25μM，DNA用量1～100ng。
7.权利要求1所述的引物组、权利要求2所述的探针组合物或权利要求4所述的试剂盒在同时鉴别南、北柴胡中的应用。
8.一种用于同时鉴别南、北柴胡的检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)从待测样品中提取DNA为模板，选择靶基因；
(2)利用上述的引物组作为PCR扩增引物，并使用上述试剂盒进行PCR扩增；
(3)设立阳性对照、阴性对照及空白对照，分析实验结果，给出第n个循环时的荧光增加值ΔRn与扩增曲线Ct值，根据不同探针荧光信号及扩增曲线Ct值来判定是否含有南柴胡和北柴胡成分。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中DNA的提取使用植物基因组试剂盒，并按其说明书进行提取。
10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)进行PCR扩增时，需在4通道或4通道以上的任何型号的荧光定量PCR仪上进行，扩增程序：95℃10min，预变性；95℃10s，60～63℃35s，45个循环。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108977571A (zh) * 2018-09-04 2018-12-11 山东省农业科学院生物技术研究中心 鉴别四种天南星科药用植物的荧光pcr检测试剂盒及应用
CN108998554A (zh) * 2018-08-14 2018-12-14 山东省农业科学院生物技术研究中心 鉴别药典中3种药用石斛的荧光pcr检测试剂盒及应用
CN114438248A (zh) * 2022-02-21 2022-05-06 广州白云山光华制药股份有限公司 基于scar分子标记鉴定竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡的方法
CN116162722A (zh) * 2022-09-26 2023-05-26 中国中医科学院中药研究所 用于鉴定不同产地红柴胡的InDel标记及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103571956A (zh) * 2013-11-01 2014-02-12 山西大学 采用特异性引物pcr检测柴胡和狭叶柴胡的方法
RU2573937C1 (ru) * 2014-10-20 2016-01-27 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Алтайский государственный университет" НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ВОЛОДУШКИ МНОГОЖИЛЬЧАТОЙ (Bupleurum multinerve DC.)

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103571956A (zh) * 2013-11-01 2014-02-12 山西大学 采用特异性引物pcr检测柴胡和狭叶柴胡的方法
RU2573937C1 (ru) * 2014-10-20 2016-01-27 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Алтайский государственный университет" НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ВОЛОДУШКИ МНОГОЖИЛЬЧАТОЙ (Bupleurum multinerve DC.)

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
丁锤等: "柴胡属5种易混药材的鉴别研究", 《中药材》 *
严华等: "南柴胡与常见混伪品的鉴别方法研究", 《中国药学杂志》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108998554A (zh) * 2018-08-14 2018-12-14 山东省农业科学院生物技术研究中心 鉴别药典中3种药用石斛的荧光pcr检测试剂盒及应用
CN108998554B (zh) * 2018-08-14 2022-02-25 山东省农业科学院生物技术研究中心 鉴别药典中3种药用石斛的荧光pcr检测试剂盒及应用
CN108977571A (zh) * 2018-09-04 2018-12-11 山东省农业科学院生物技术研究中心 鉴别四种天南星科药用植物的荧光pcr检测试剂盒及应用
CN108977571B (zh) * 2018-09-04 2022-02-25 山东省农业科学院生物技术研究中心 鉴别四种天南星科药用植物的荧光pcr检测试剂盒及应用
CN114438248A (zh) * 2022-02-21 2022-05-06 广州白云山光华制药股份有限公司 基于scar分子标记鉴定竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡的方法
CN114438248B (zh) * 2022-02-21 2024-04-16 广州白云山光华制药股份有限公司 基于scar分子标记鉴定竹叶柴胡和/或窄竹叶柴胡的方法
CN116162722A (zh) * 2022-09-26 2023-05-26 中国中医科学院中药研究所 用于鉴定不同产地红柴胡的InDel标记及其应用
CN116162722B (zh) * 2022-09-26 2023-11-07 中国中医科学院中药研究所 用于鉴定不同产地红柴胡的InDel标记及其应用

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