CN107354205A - 用于鉴定烤烟中烟100的引物组合及试剂盒、应用及检测方法 - Google Patents

用于鉴定烤烟中烟100的引物组合及试剂盒、应用及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于鉴定烤烟中烟100的引物组合及试剂盒、应用及检测方法，属于烟草品种鉴定技术领域。本发明利用烟草420K高密度SNP芯片对近年来我国烟草主栽品种进行全基因组SNP分型，根据品种间多态性SNP位点筛选获得了一套适用于鉴定烤烟中烟100的特异性SNP标记共13个，并对比栽培烟草参考基因组获得的13个SNP位点侧翼序列，其序列如SEQ ID NO:1～13所示，基于该序列设计引物；利用设计的引物，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术对这些位点进行分型检测。根据检测结果获得SNP分型结果，鉴定样品是否为中烟100，本发明的检测方法检测时所需检测样品量少，检测通量高，鉴定结果准确。

Description

用于鉴定烤烟中烟100的引物组合及试剂盒、应用及检测方法
技术领域
本发明涉及用于鉴定烤烟中烟100的引物组合及试剂盒、应用及检测方法，属于烟草品种鉴定技术领域。
背景技术
烟草是一种重要的经济作物，是卷烟生产的主要原料。烤烟品种中烟100是中国烟草遗传育种研究(北方)中心采用优质品种NC82为中心亲本与多抗性互补亲本9201杂交，再用NC82回交5代后，用系谱法定向选择培育而成的优质多抗烤烟新品种，2002年12月通过全国烟草品种审定委员会审定。植株筒形，着生叶数24片左右，可收叶20～22片，叶形椭圆，叶面稍皱，叶尖渐尖，叶色绿，腰叶长65.6cm，宽30.1cm。花枝较松散，花冠粉红色，蒴果卵圆形。移栽至中心花开放59～63天，大田生育期116天左右。中烟100是近年来我国烟叶生产中重要的主栽烤烟品种，也是卷烟生产中重要的工业常用品种。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)主要是指在基因组上由单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性。与传统的分子标记相比，SNP标记具有密度高、分布范围广、分型简单等优点。随着全基因组序列鉴定技术以及自动化的SNP芯片分型技术的发展，利用大规模、高通量SNP芯片进行遗传多样性研究已经变得越来越普遍。国家烟草基因研究中心设计研制出首张烟草高密度SNP芯片(420K Tobacco SNP array)，涵盖绝大多数标签SNP位点并均匀分布整个烟草基因组，为从全基因组水平上对烟草品种进行遗传多样性研究提供了便利。采用烟草高密度SNP芯片标记技术对烟草主栽品种的遗传多样性进行分析，可以筛选获得特定主栽品种的特异性SNP分子标记。基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术的MassARRAY分子量阵列平台可以针对SNP位点设计最高多达40重PCR反应和基因型检测，实验设计非常灵活，分型结果准确性高。根据应用需要，对于数十到数百个SNP位点进行数百至数千份样本检测时，MassARRAY具有极高性价比。特别适合于对有限数量的SNP位点进行大规模分型检测。
品种是优质烟叶原料生产的基础，是影响烟叶品质最主要的因素之一。根据《中华人民共和国种子法》和《烟草专卖法》，为保证烟叶生产的稳定性和可持续发展，必须选用经全国烟草品种审定委员会审(认)定的品种，严禁种植劣杂品种。此外，烟草工业生产和产品开发对特定烟叶品种也提出了严格的要求。目前，我国面临着烟草主栽品种的遗传背景狭窄，形态学上相似程度高难以区分鉴别的问题。烟草品种的检测方法主要是田间种植鉴定法。但是，该方法存在田间种植规模大、鉴别项目多(鉴别性状涉及株高、叶数、节距、叶长、叶宽、茎叶角度等)、周期长(跨越烟草不同生育期)、鉴别难度大(性状指标差异小)、同一性状年度间存在差异(受环境影响)等不足。烟草品种保护，种子纯度的监测，烟叶真假检测等方面，都迫切需要从分子水平上进行烟草DNA身份鉴定。
专利CN105734141A公开了一种鉴定烟草品种纯度的分子生物学方法，包括：分别提取对照与待测烟草品种的基因组总DNA，采用最新测序技术对其进行适当深度的全基因组测序，基于烟草基因组参考序列利用生物信息学手段对它们进行序列拼接、组装与全基因组序列比较，统计二者碱基差异，计算出待测烟草品种相对于对照烟草品种的纯度百分比。该方法不受环境条件和季节影响，鉴定结果准确可靠，可从最小遗传单位单碱基变异水平上准确鉴别烟草品种的纯度，用于烟草品种亲本提纯与真伪鉴定。但是该方法操作复杂，检测成本非常高。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于鉴定烤烟中烟100的引物组合，该引物可简单、快速、高效地鉴定检测样品是否为烤烟中烟100。
本发明的另一个目的是提供包含上述引物组合的鉴定试剂盒。
本发明还提供了上述引物组合及鉴定试剂盒的应用。
本发明还提供一种能够简单、快速、高效地鉴定烤烟中烟100的方法。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
用于鉴定烤烟中烟100的引物组合，所述引物分别针对烤烟中烟100的13个特异性SNP位点侧翼序列设计，具体根据检测方法的不同对应设计引物。这13个SNP标记是基于近年来我国烟草主栽品种全基因组SNP分型结果筛选出来的烤烟中烟100独有的特异性SNP位点，其物理位置是基于栽培烟草品种红花大金元的全基因组序列比对确定的，具体位点信息如下表1所示，分别命名为FP01～FP13。包含这13个SNP位点的基因序列如SEQID NO:1～13所示。
表1烤烟中烟100的13个特异性SNP位点
所述检测方法可采用SNP经典检测法如PCR-RFLP、单链构象多态性(SSCP)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、等位基因特异PCR(AS-PCR)法，或是采用SNPs高通量检测法如DNA测序法、基因芯片技术、变性高效液相色谱(DHPLC)、Taqman探针法、SNap shot法、MassARRAY分子量阵列技术，以实现烤烟中烟100的品种鉴定和育种材料检测。
烤烟中烟100鉴定试剂盒，除包含上述引物组合外，还可以包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、PCR Enzyme、SAP酶、SAP缓冲液、iPLEX缓冲液、iPLEX termination mix、iPLEXEnzyme、水等。
上述引物组合或试剂盒在烤烟中烟100品种鉴定方面的应用。具体为：取烟草样本基因组DNA进行SNP分型检测，若检测样本中13个SNP位点的基因型与下表2中所示的结果完全一致，则判定该烟草样本为烤烟中烟100。
表2烤烟中烟100中各SNP位点的基因型
FP01 FP02 FP03 FP04 FP05 FP06 FP07 FP08 FP09 FP10 FP11 FP12 FP13
GG GG TT GG AA TT CC AA GG TT TT AA AA
本发明优选采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MassARRAY分子量阵列平台)，并基于Assay Design Suit(Agena)针对每个位点设计两条扩增引物和一条延伸引物，引物组合如下表3所示。
表3基于烤烟中烟100的特异性SNP位点设计的引物组合
烤烟中烟100的鉴定方法，包括以下步骤：
1)SNP位点多重PCR扩增反应
以烟草样本基因组DNA为模板，利用引物组合中的扩增引物进行多重PCR扩增反应，得PCR产物；
2)SAP酶反应
用SAP酶去除PCR产物中剩余的dNTP和引物，得反应产物；
3)单碱基延伸反应
在反应产物中加入延伸引物进行单碱基延伸反应，得延伸产物；
4)基因型检测及结果判定
对延伸产物进行预处理，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术进行SNP基因型检测，若检测样本中SNP标记FP01～FP13的基因型依次为GG、GG、TT、GG、AA、TT、CC、AA、GG、TT、TT、AA、AA，则判断该烟草样本为烤烟中烟100。
步骤1)中多重PCR扩增反应为：反应体系：10×PCR缓冲液0.5μL、25mM MgCl2 0.4μL、25mM dNTPs 0.1μL、5U/μL PCR Enzyme 0.2μL、1μM扩增引物的混合液1μL、10ng/μL烟草样本基因组DNA 1μL，水补足至5μL；反应条件为：95℃2min；95℃30s、56℃30s、72℃1min，45个循环；72℃5min。
步骤2)中SAP酶反应为：在PCR产物中加入1.7U/μL SAP 0.3μL和10×SAP缓冲液0.17μL，水补足至7μL；反应条件为：37℃40min，85℃5min。
步骤3)中单碱基延伸反应为：在反应产物中加入10×iPLEX缓冲液0.2μL、10×iPLEXtermination mix 0.2μL、33U/μL iPLEX Enzyme 0.041μL和1μM延伸引物的混合液0.94μL，水补足至9μL；反应条件为：94℃30s；[94℃5s、(52℃5s、80℃5s)5个循环]40个循环；72℃3min。
步骤4)中预处理为：在延伸产物中加入水41μL，洁净树脂15mg，混匀后进行脱盐去离子防干扰处理，离心取上清液备用。
步骤4)中SNP基因型检测为：利用MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪将上清液点到384点SpectroCHIP芯片上，将芯片置于MassARRAY Typer Workstation MA4中，用MALDI-TOF(基质辅助激光解吸电离飞行时间)质谱仪扫描芯片，得到SNP基因型检测结果。
本发明中所用引物混合液中所有引物是等量的。
本发明的有益效果：
本发明利用烟草420K高密度SNP芯片对近年来我国烟草主栽品种进行全基因组SNP分型，根据品种间多态性SNP位点筛选获得了一套适用于鉴定烤烟中烟100的特异性SNP标记共13个，具体位点信息见上表1，并根据位点信息设计相应引物，具体序列见表3，利采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术对候选样品进行SNP分型检测，建立一套简便、快捷、高效、可靠的烤烟中烟100品种分子检测体系，为烤烟中烟100的鉴定技术体系提供了基础和依据。
本发明使用基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术的MassARRAY分子量阵列平台可以针对SNP位点设计最高多达40重PCR反应和基因型检测，实验设计非常灵活，分型结果准确性高。根据应用需要，对于数十到数百个SNP位点进行数百至数千份样本检测时，MassARRAY具有极高性价比。特别适合于对有限数量的SNP位点进行大规模分型检测。
本发明利用烟草420K高密度SNP芯片对我国不同烤烟主栽品种进行全基因组SNP分型，筛选获得了一套适用于鉴定烤烟中烟100的特异性SNP分子标记。对比栽培烟草参考基因组获得的13个SNP位点侧翼序列，并基于SNP位点侧翼序列设计引物，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术对这些位点进行分型检测。根据检测结果获得的SNP分型结果，若检测样本中SNP标记FP01～FP13的基因型依次为GG、GG、TT、GG、AA、TT、CC、AA、GG、TT、TT、AA、AA，则判断该烟草样本为烤烟中烟100。检测时样品用量少，周期短，鉴定结果准确，可重复性好，检测通量高，有很好的应用推广前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。本实施例中所有引物均由华大基因合成。
实施例1
用于鉴定烤烟中烟100的引物组合，针对烤烟中烟100的特异性SNP位点标记设计，包括：
1、烟草主栽品种全基因组SNP分型检测。
利用420K Tobacco SNP array(Affymetrix)对近年来我国烟草主栽品种进行全基因组扫描，依托国家烟草基因研究中心Gene Titan芯片平台(Affymetrix)进行样本DNA的SNP分型。烟草样品DNA经全基因组扩增后将产物随机片段化为25到125bp之间的片段。片段纯化后进行重悬浮，与420K Tobacco SNP array进行杂交。每一个SNP通过芯片表面所发生的双色连接反应进行鉴别连接。杂交过程完成后进行严谨性洗涤以去除非特异性结合。连接反应完成后，芯片在Gene Titan多通道自动化芯片工作站上完成染色洗涤等步骤，最后进行扫描并输出结果。将芯片分析获得的数据进行处理，得到不同品种SNP分型结果。
2、烤烟中烟100特异性SNP位点筛选。
根据芯片系统数据分级及推荐类型，只选取Poly high resolution和Mono highresolution两种类型位点数据，过滤后得到高质量SNP分型结果，保留在所有检测品种中Call rate均为100％的位点，进一步筛选去除在任一品种中出现杂合分型的位点，最终获得在所有检测品种中纯合的SNP位点。筛选获得在烤烟中烟100中特异性的SNP位点。由于烟草中存在大量重复序列，为避免检测引物设计中出现非特异性扩增，对SNP位点侧翼各200bp序列与参考基因组进行blast比对，筛选基因组中无高度相似序列的位点。结合SNP位点在染色体上分布情况，在存在多态性位点的染色体上挑选一个位点，染色体多态性较好的挑选两个位点作为烤烟中烟100的特异性SNP标记。
本发明筛选得到13个用于鉴定烤烟中烟100的特异性SNP分子标记，13个SNP标记是基于近年来我国烟草主栽品种全基因组SNP分型结果筛选出来的烤烟中烟100独有的特异性SNP位点，其物理位置是基于栽培烟草品种红花大金元的全基因组序列比对确定的；所述13个SNP标记是FP01-FP13，具体位点信息发明内容部分表1所示。
3、用于鉴定烤烟中烟100的引物组合设计。
对筛选得到的特异性SNP位点在参考基因组中进行染色体定位，获得包含这些SNP位点的上下游序列。基于Assay Design Suit(Agena)针对每个位点设计两条扩增引物和一条延伸引物，引物序列如发明内容部分表3所示。
实施例2
烤烟中烟100鉴定试剂盒：包含实施例1中扩增引物混合液(1μM)5mL，10×PCR缓冲液5mL，25mM MgCl2 4mL，25mM dNTPs 2mL，5U/μL PCR Enzyme 2mL，1.7U/μL SAP 3mL，10×SAP缓冲液3mL，10×iPLEX缓冲液2mL，10×iPLEX termination mix 2mL，33U/μL iPLEXEnzyme 1mL，实施例1中延伸引物混合液(1μM)5mL，水200mL。
实施例3
烤烟中烟100的鉴定方法，包括以下步骤：
1、待测样品DNA提取：采集样品新鲜叶片组织，利用Gene Pure Neway PlantGenomic DNA Kit试剂盒(Gene Answer)提取样品基因组DNA；利用核酸蛋白测定仪NanoDrop ND-2000(ThermoFisher Scientific)检测DNA浓度，将DNA稀释至10ng/μL备用。
2、MassARRAY检测：操作方法按照MassARRAY系统平台(Agena)要求进行，反应利用iPLEX Gold Reagent Kit试剂盒(Agena)进行，具体为：
1)SNP位点多重PCR扩增反应：
以待测样品基因组DNA为模板，利用实施例1中扩增引物进行多重PCR扩增反应，得PCR产物；
反应体系为：PCR缓冲液(10×)0.5μL、MgCl2(25mM)0.4μL、dNTPs(25mM)0.1μL、PCREnzyme(5U/μL)0.2μL、扩增引物的混合液(1μM)1μL、基因组DNA(10ng/μL)1μL，水补足至5μL。反应条件为：95℃2min；95℃30s、56℃30s、72℃1min，45个循环；72℃5min。
2)SAP酶反应：
虾碱性磷酸酶(shrimp alka-line phosphatase，SAP)去除PCR产物中dNTP；在步骤1)PCR产物中加入SAP(1.7U/μL)0.3μL、SAP缓冲液(10×)0.17μL、水补足至7μL；反应条件为：37℃40min，85℃5min。
3)单碱基延伸反应：
使用iPLEX Reagent Kit进行延伸反应：在步骤2)得到的产物中加入iPLEX缓冲液(10×)0.2μL、iPLEX termination mix(10×)0.2μL、iPLEX Enzyme(33U/μL)0.041μL、1μM延伸引物的混合液0.94μL、水补足至9μL；反应条件为：94℃30s；[94℃5s、(52℃5s、80℃5s)5个循环]40个循环；72℃3min；
4)基因型检测：
在步骤3)产物中加入水41μL，洁净树脂15mg(96孔板)，颠倒摇匀15min进行脱盐去离子防干扰处理；3200g离心5min；取上清备用。利用MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪对步骤4)延伸产物的上清液点样仪将样本点到384点SpectroCHIP(芯片)上。将芯片放到MassARRAY Typer Workstation MA4里，利用MALDI-TOF(基质辅助激光解吸电离飞行时间)质谱仪扫描芯片，扫描结果以Typer 4.0软件分析并导出结果。
3、检测结果比对
对获得的SNP标记检测结果进行判定，若检测样品中13个SNP位点的检测结果与中烟100指纹图谱结果完全一致，则待鉴定品种为烤烟中烟100。
本发明使用的基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术的MassARRAY分子量阵列平台可以针对13个SNP位点设计13重PCR反应和基因型检测，实验设计灵活，分型结果准确性高。可以对13个SNP位点同时进行396份样本的检测，检测通量高。
试验例
以24份不同品种样品为例，采用实施例3中的方法进行鉴定，验证该方法的特异性，结果如表4所示。参与检测样品1-24分别为：烤烟K326、红花大金元、中烟100、翠碧1号、云烟85、云烟87、云烟97、云烟100、NC95、龙江911、龙江981、秦烟96、毕纳1号、南江3号；香料烟云香巴斯玛1号、云香2号、Basma；白肋烟鄂烟1号、鄂烟3号、VAM、Burley-21；雪茄烟Beinhart-1000、Havana-10、Florida-301。参与检测样品中，烤烟K326、红花大金元、中烟100、翠碧1号、云烟85、云烟87、云烟97、云烟100、龙江911、龙江981、秦烟96、毕纳1号、南江3号；香料烟云香巴斯玛1号、云香2号；白肋烟鄂烟1号、鄂烟3号均为近年来我国烟叶生产中推广使用的主栽品种。
表4 24份烟草样品检测结果
FP01 FP02 FP03 FP04 FP05 FP06 FP07 FP08 FP09 FP10 FP11 FP12 FP13
样品1 AA AA CC TT GG CC TT GG AA CC CC GG GG
样品2 AA AA CC TT GG CC TT GG AA CC CC GG GG
样品3 GG GG TT GG AA TT CC AA GG TT TT AA AA
样品4 AA AA CC TT GG CC TT GG AA CC CC GG GG
样品5 AA AA CC TT GG CC TT GG AA CC CC GG GG
样品6 AA AA CC TT GG CC TT GG AA CC CC GG GG
样品7 AA AA CC TT GG CC TT GG AA CC CC GG GG
样品8 AA AA CC TT GG CC TT GG AA CC CC GG GG
样品9 AA AA CC TT GG CC TT GG AA CC CC GG GG
样品10 AA AA CC TT GG CC TT GG AA CC CC GG GG
样品11 AA AA CC TT GG CC TT GG AA CC CC GG GG
样品12 AA AA CC TT GG CC TT GG AA CC CC GG GG
样品13 AA AA CC TT GG CC TT GG AA CC CC GG GG
样品14 AA AA CC TT GG CC TT GG AA CC CC GG GG
样品15 AA AA CC TT GG CC TT GG AA CC CC GG GG
样品16 AA AA CC TT GG CC TT GG AA CC CC GG GG
样品17 AA AA CC TT GG CC TT GG AA CC CC GG GG
样品18 AA AA CC TT GG CC TT GG AA CC CC GG GG
样品19 AA AA CC TT GG CC TT GG AA CC CC GG GG
样品20 AA AA CC TT GG CC TT GG AA CC CC GG GG
样品21 AA AA CC TT GG CC TT GG AA CC CC GG GG
样品22 AA AA CC TT GG CC TT GG AA CC CC GG GG
样品23 AA AA CC TT GG CC TT GG AA CC CC GG GG
样品24 AA AA CC TT GG CC TT GG AA CC CC GG GG
由表4可知，24份样品中只有样品3的SNP位点检测结果与中烟100的指纹图谱结果完全一致，说明该检测方法对烤烟中烟100具有特异性。
<110> 中国烟草总公司郑州烟草研究院
<120> 用于鉴定烤烟中烟100的引物组合及试剂盒、应用及检测方法
<160> 52
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<211> 201
<212> DNA
<213> 序列
<221> 包含FP01的基因序列
<400> 1
tttactaata tttttcctcc ttacgacatt tgtcacttct tgatctttta ttacattgaa 60
tagaattaac aaaaagaaaa aaaatagcag tacgtagaat ntgaatttat ctttggcaac 120
ggtctcaaga tctatgaggg ggccgtggtc catgaaatct tttgctaaag ctagaattgt 180
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<211> 201
<212> DNA
<213> 序列
<221> 包含FP02的基因序列
<400> 2
ggtgataggc ctgccatgtc ttttgaggcc ttattaagac tggataagtt taccaagctc 60
tttccagttc acttcagtgg tacaccttct gaggacccac nggagtatct tgaacgctgc 120
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cggatgacgg gttccgccaa g 201
<211> 201
<212> DNA
<213> 序列
<221> 包含FP03的基因序列
<400> 3
accaagcttt atcatatgga attgattctt ataggttgtg ttgattatat taagttgttt 60
atggctagat ttgagtcgtt cggaggctga ttcgagaggc nagagcttgt tagagtacat 120
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aaatatgagt tatgtggtta g 201
<211> 201
<212> DNA
<213> 序列
<221> 包含FP04的基因序列
<400> 4
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tgatctttca agtaataaat tggtcggagg tattcctaaa nagatagctg aaatgagagg 120
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ccaaatgaag atgttggagt c 201
<211> 201
<212> DNA
<213> 序列
<221> 包含FP05的基因序列
<400> 5
aaagcatcat atagcacatt aggcccaaac atgtaacaaa atcagataaa acgaaatata 60
acaatttatc taagctcgaa ttctgaaccc taaaccacgt ngtcgtggat ttgatctcca 120
acagagttgt cagagctgtc atacctcctt cttacctaca cccccgtaaa gggtagtata 180
taagggagtt tttccaatat a 201
<211> 201
<212> DNA
<213> 序列
<221> 包含FP06的基因序列
<400> 6
gactggaata gtcaagaccg ctaccgtagt ctgatatacc tagatctaca cacaaggtgt 60
aggggtaacg tgagtacaac aactcagtat gtaacaagtc nagactatga actgatatgt 120
agtgacaaaa gtaacctcat caagaaataa aaataaattg tgcaaaaaga gtatgcatgc 180
taacagttca ggaatatagc t 201
<211> 201
<212> DNA
<213> 序列
<221> 包含FP07的基因序列
<400> 7
cccgccccat agcaagttta aaccaaatta acaactaaca agagacttag agatcttaaa 60
tttcagttta acactaggac actatatcca taacatgaaa nagactaaca aaatgcacct 120
agaaccaaaa tattacaagc catgaataag attgaagaat aagaaataca attcaacaaa 180
agacactgat gttcatcata t 201
<211> 201
<212> DNA
<213> 序列
<221> 包含FP08的基因序列
<400> 8
atcagaaaac tatacgcgat cgcgaaacac atcagaacac tagtatatca gcagtacaaa 60
aaccatccaa aatggcccga aaccatcccg aatcacaccc natcccccct ggacctcgtc 120
caaacacatc aacaagtcta aatacattat ccaaacttat ccaaaagctt gaaatatcat 180
ataataataa aaccaagaat c 201
<211> 201
<212> DNA
<213> 序列
<221> 包含FP09的基因序列
<400> 9
tccatgtatt tattaagttt ataaatatat attattctac ggattgattc acccgggttg 60
agtagtgtgc cgatgcggat cacaagcttt aggttgtgac ntaaaccaat gacccctaaa 120
agttcacaga ttcatctgac atcctagtag aactatagtg cttctagagg aatctagaac 180
caaagtaata taaaaaattg t 201
<211> 201
<212> DNA
<213> 序列
<221> 包含FP10的基因序列
<400> 10
agccatatta ttgttgcggt gagcaacccg atccttatct tgacattgtt gcagcggcaa 60
cccgatccaa cataccaatt cacatgggat aatctaacaa nacatccaac tatagcaaac 120
attcataata actatcgagg agactaaaat agtataattc actaaggaag agatggacac 180
gaataagaaa taatgccaaa t 201
<211> 201
<212> DNA
<213> 序列
<221> 包含FP11的基因序列
<400> 11
cctctaaaag tactgcagaa actacataat cttcaagggt tgcttataac tgaacattag 60
cattgtactg tatgtcctat tgcaaagtaa tcatggctac nttttcctct tagaacatct 120
tgatctactc ctatttttta tcttgttcaa gcagatgttt ggggtctata tagactacca 180
agtcatgatg gcaagagata t 201
<211> 201
<212> DNA
<213> 序列
<221> 包含FP12的基因序列
<400> 12
tgaagcaaca ctactggtgg agaagaatga agaaggatat tgtagagtac gtggctcgat 60
gtttgaactg tcaacaagta tgaggattag agaccaggtg ntttacttca gaggcttgat 120
attccggagt ggaagtggga gtgtatcact ttggattttg tagttggaat tccatggacc 180
ttgacgagat tcgatgcact g 201
<211> 201
<212> DNA
<213> 序列
<221> 包含FP13的基因序列
<400> 13
gcctttagtt ctcgcaaagc ttggatgcac tcgggagtcc attcgaggtt gttgtccttt 60
ttgagtacgc caaaaatatt gtcacatcta tcagacgatc ncgagatgaa tctcgatagg 120
gcggcgattc gaccagttaa cctacggact tgattcttgg tagttaagag ctccggtatc 180
ccctcgatag ctttgattta g 201
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP01-F
<400> 14
acgttggatg gaaaaaaaat agcagtacg 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP01-R
<400> 15
acgttggatg aagatttcat ggaccacggc 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP01-E
<400> 16
ccgttgccaa agataaattc a 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP02-F
<400> 17
acgttggatg ccaagctctt tccagttcac 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP02-R
<400> 18
acgttggatg tacacctcat agcagcgttc 30
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP02-E
<400> 19
ccttctgagg acccac 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP03-F
<400> 20
acgttggatg agatttgagt cgttcggagg 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP03-R
<400> 21
acgttggatg gttacttacc tcaaacagcg 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP03-E
<400> 22
catgtactct aacaagctct 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP04-F
<400> 23
acgttggatg gtaataaatt ggtcggaggt 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP04-R
<400> 24
acgttggatg tcagtgatac ttccattcag 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP04-E
<400> 25
ggtcggaggt attcctaaa 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP05-F
<400> 26
acgttggatg ctaagctcga attctgaacc 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP05-R
<400> 27
acgttggatg ggtatgacag ctctgacaac 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP05-E
<400> 28
ttggagatca aatccacgac 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP06-F
<400> 29
acgttggatg tctacacaca aggtgtaggg 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP06-R
<400> 30
acgttggatg gaggttactt ttgtcactac 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP06-E
<400> 31
ccaactcagt atgtaacaag tc 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP07-F
<400> 32
acgttggatg tcagtttaac actaggacac 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP07-R
<400> 33
acgttggatg ttggttctag gtgcattttg 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP07-E
<400> 34
ggtggtgcat tttgttagtc t 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP08-F
<400> 35
acgttggatg aaaccatcca aaatggcccg 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP08-R
<400> 36
acgttggatg tgtgtttgga cgaggtccag 30
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP08-E
<400> 37
tcccgaatca caccc 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP09-F
<400> 38
acgttggatg tgcggatcac aagctttagg 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP09-R
<400> 39
acgttggatg ggatgtcaga tgaatctgtg 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP09-E
<400> 40
gggttagggg tcattggttt a 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP10-F
<400> 41
acgttggatg ccgatccaac ataccaattc 30
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP10-R
<400> 42
acgttggatg gtctcctcga tagttattat g 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP10-E
<400> 43
ggtgtttgct atagttggat gt 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP11-F
<400> 44
acgttggatg ctgtatgtcc tattgcaaag 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP11-R
<400> 45
acgttggatg ccccaaacat ctgcttgaac 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP11-E
<400> 46
gattgcaaag taatcatggc tac 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP12-F
<400> 47
acgttggatg gtggctcgat gtttgaactg 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP12-R
<400> 48
acgttggatg actccggaat atcaagcctc 30
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP12-E
<400> 49
tcaagcctct gaagtaaa 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP13-F
<400> 50
acgttggatg ttgtcctttt tgagtacgcc 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP13-R
<400> 51
acgttggatg aggttaactg gtcgaatcgc 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FP13-E
<400> 52
ggttcacatc tatcagacga tc 22

Claims (10)

1.用于鉴定烤烟中烟100的引物组合，其特征在于：所述引物针对烤烟中烟100的13个特异性SNP位点侧翼序列设计，包含13个SNP位点的基因序列如SEQ ID NO:1～13所示。
2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于：所述13个特异性SNP位点的引物序列如SEQ ID NO:14～52所示。
3.包含如权利要求1或2所述引物组合的烤烟中烟100鉴定试剂盒。
4.如权利要求1或2所述引物组合、权利要求3所述试剂盒在烤烟中烟100品种鉴定方面的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：包括：取烟草样本基因组DNA进行SNP分型检测，若检测样本中13个SNP位点的基因型与烤烟中烟100的完全一致，则判定该烟草样本为烤烟中烟100；烤烟中烟100中13个SNP位点FP01～FP13的基因型依次GG、GG、TT、GG、AA、TT、CC、AA、GG、TT、TT、AA、AA。
6.采用如权利要求2所述引物组合鉴定烤烟中烟100的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)SNP位点多重PCR扩增反应
以烟草样本基因组DNA为模板，利用引物组合中的扩增引物进行多重PCR扩增反应，得PCR产物；
2)SAP酶反应
用SAP酶去除PCR产物中剩余的dNTP和引物，得反应产物；
3)单碱基延伸反应
在反应产物中加入延伸引物进行单碱基延伸反应，得延伸产物；
4)基因型检测及结果判定
对延伸产物进行预处理，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术进行SNP基因型检测，若检测样本中SNP标记FP01～FP13的基因型依次为GG、GG、TT、GG、AA、TT、CC、AA、GG、TT、TT、AA、AA，则判断该烟草样本为烤烟中烟100。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤1)中多重PCR扩增反应为：反应体系：10×PCR缓冲液0.5μL、25mM MgCl2 0.4μL、25mM dNTPs 0.1μL、5U/μL PCR Enzyme 0.2μL、1μM扩增引物的混合液1μL、10ng/μL烟草样本基因组DNA 1μL，水补足至5μL；反应条件为：95℃2min；95℃30s、56℃30s、72℃1min，45个循环；72℃5min。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤2)中SAP酶反应为：在PCR产物中加入1.7U/μL SAP 0.3μL和10×SAP缓冲液0.17μL，水补足至7μL；反应条件为：37℃40min，85℃5min。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤3)中单碱基延伸反应为：在反应产物中加入10×iPLEX缓冲液0.2μL、10×iPLEX termination mix 0.2μL、33U/μL iPLEXEnzyme 0.041μL和1μM延伸引物的混合液0.94μL，水补足至9μL；反应条件为：94℃30s；94℃5s，52℃5s、80℃5s、5个循环，40个循环；72℃3min。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤4)中预处理为：在延伸产物中加入水41μL，洁净树脂15mg，混匀后进行脱盐去离子处理，离心取上清液备用；利用点样仪将上清液点到芯片上，用MALDI-TOF质谱仪扫描芯片，得到SNP基因型检测结果。
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