CN102965443A

CN102965443A - 特异分子标记法鉴定烟草 “中烟90” 品种纯度的方法

Info

Publication number: CN102965443A
Application number: CN2012105292539A
Authority: CN
Inventors: 杨龙; 黄莉莎; 王玉军; 曹恒春; 王毅
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2012-12-10
Filing date: 2012-12-10
Publication date: 2013-03-13

Abstract

本发明涉及一种特异分子标记法鉴定烟草“中烟90”品种纯度的方法，是利用SSR分子标记鉴定烤烟“中烟90”品种的纯度；本发明通过大量实验验证得到了扩增出中烟90特征条带的特异性引物，利用“中烟90”的特征引物进行纯度检验，检测结果可靠且直观，相比传统的常规检测方法操作简单，检测效率高，成本更低。利用本发明检验周期短，即在苗期阶段就可通过本方法检测种子纯度，且标准统一，不受人为以及环境的影响，结果准确可靠。

Description

特异分子标记法鉴定烟草 “中烟90” 品种纯度的方法

(一)技术领域

本发明涉及一种特异分子标记法鉴定烟草“中烟90”品种纯度的方法，属于烟草育种与生物技术领域。

(二)背景技术

种子是农业最基本的生产资料，种子质量的优劣直接影响农作物的产量和质量。目前主栽烟草品种混杂和种子退化比较严重，给农民带来了巨大的经济损失。开展种子纯度检验对保证种子质量和提高烟草生产效益具有重要意义。

种子纯度是评价烟草种子质量的重要指标之一，目前我国采用的烟草种子纯度鉴定方法主要为:常规鉴定法。其中常规鉴定法主要包括种子形态鉴定法、幼苗形态鉴定法、物理化学鉴定法、大田期形态鉴定法。这些方法在烟草种子纯度和品种一致性的检测中起着重要的作用，但是这些方法都有一定的缺陷或局限性，主要为所需费用高、周期长的问题。特别是小区种植鉴定,需5-7个月才能完成，且许多性状受栽培技术及环境因素的影响,其结果会产生偏差,同时鉴定者的观测经验也制约着鉴定结果的准确性。另外，20世纪80年代开始，生化鉴定开始应用到烟草种子纯度，主要包括同工酶电泳、蛋白质电泳、高效液相色谱等方法，这些方法发展很快，检验种子纯度准确性高。但是，这类检测技术成本相对较高，且遗传信息量有限，加上烤烟品种遗传背景狭窄，这些方法揭示品种间的多态性有限，其应用受到了限制。

随着分子标记技术的发展，作为育种的辅助工具，具有高效、准确、不受环境影响等特点，其应用越来越受到重视。特别是SSR标记技术，具有结果可靠，重复性好，多态性丰富，操作简单，呈共显性遗传等特点。十分有利于种子纯度检验。只要找到特异的SSR引物，在一个品种中具有特征带，就可以快速鉴定出杂种。

“中烟90”是中国农科院烟草科学研究所通过SpeightG-28、单育2号和净叶黄三亲本复合杂交，经分类选择、定向培育的一个具有多抗性且推广面积较大的烤烟新品。通过与“K326”品种作对比试验，试验结果表明,“中烟90”品种具有以下优点：1、优质适产。该品种与“K326”对比,平均每亩增加烟叶20干克；2、抗病性明显。“中烟90”对黑胫病、赤星病和气候斑病的抗性比“K326”的强。3、农艺性状好。“中烟90”植株呈筒型,叶为长椭圆形，株高90-120厘米,可留叶21片左右。

(三)发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种特异分子标记法鉴定烟草“中烟90”品种纯度的方法；目的在于利用主栽烟草品种中的特征SSR引物，提供一种快速、高效鉴定烟草“中烟90”品种纯度的方法。

一种特异分子标记法鉴定烟草“中烟90”品种纯度的方法，包括如下步骤：

（1）设计特异性引物，以烟草品种“中烟90”的基因组DNA（采用CTAB/NaCl法）为模板，得到“中烟90”特征条带，“中烟90”特征条带大小分别为159bp和98bp（图1）。

所述特异性引物为：

正向引物：

F：5′—GAACAGATTGCTGAAACTGAGAGA—3′其序列如Seq ID No：1所示；

反向引物：

R：5′—GATGAGGTGGAGGCACAAG—3′其序列如Seq ID No：2所示；

（2）进行品种鉴定：

以待测品种的基因组DNA为模板进行PCR扩增：PCR扩增总体积为15μl，具体为1.5μl的10×PCRbuffer，2.5mmol/L的MgCl₂，0.25mmol/L的dNTPs，Taq酶1.0U，模板DNA20-25ng，步骤1）所述的正向和反向引物各0.36μmol/L，不足部分ddH₂O补足；PCR扩增在MYCYCLE扩增仪上进行，扩增程序为DNA 94℃预变性4min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃复性1min，35个循环；72℃延伸10min；最后扩增产物4℃保存。

（3）对扩增产物进行凝胶电泳：

扩增产物采用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳缓冲液为1×TBE，电压120V，电泳时间：2.5小时；电泳结束后，凝胶显色采用银染方法，在凝胶成像系统中进行观察、照相。

（4）品种的鉴定：

依据步骤3）中待测样品的凝胶成像，对照步骤1）中“中烟90”的特征条带，若有“中烟90”的特征条带出现的，则为“中烟90”纯种；若无“中烟90”特征条带出现的，则为杂种。

本发明通过大量实验验证得到了扩增出“中烟90”特征条带的特异性引物，利用“中烟90”的特征引物进行纯度检验，检测结果可靠且直观，相比传统的常规检测方法操作简单，检测效率高，成本更低。

(四)附图说明

图1为本发明设计的特异性引物在9个品种中的扩增结果，其中1.K326；2.中烟90；3.NC89；4.NC297；5.中烟100；6.翠碧一号；7.红花大金元；8.K346；9.云烟87；M.Marker；箭头指向为“中烟90”特征带分别为159bp和98bp。

图2为“中烟90”品种纯度鉴定，品种顺序如表1中的编号。

(五)具体实施方式

实施例1确定中烟90特征带

1、供试材料如表1：

表1供试材料

2、将表1中各种待测定的供试材料种子单粒播种在光照培养箱中的育苗盘上,待植株长到可直接提取基因组DNA为止。

3、提取待测烟草品种的基因组DNA（采用CTAB/NaCl法）：

每个供试材料的单株取一片嫩叶约0.2g，放到研钵中，倒入液氮并迅速研磨成粉，装入装有0.7ml 65℃预热的CTAB提取缓冲液的1.5ml离心管中，快速振荡混匀，65℃水浴1h，期间不定时摇匀；放置室温，加入等体积（0.7ml）的氯仿－异戊醇（v/v 24:1），轻轻混匀，4℃，8000r，离心10min；取出上清，加入0.6体积（420μl）的异丙醇，室温下静置15min；8000r，4℃，离心10min，取沉淀，用75％的乙醇洗两次，最后用无水乙醇洗一次，自由挥发过夜；最后将沉淀溶解在200μl TE缓冲液中，置于-20℃冰箱保存。

4、PCR扩增

以上述烟草植株DNA为模板，利用“中烟90”特征SSR引物（正向引物F和反向引物R）进行PCR扩增：PCR扩增总体积为15μl，分别为1.5μl的10×PCRbuffer，2.5mmol/L的MgCl2，0.25mmol/L的dNTPs，Taq酶1.0U，模板DNA20-25ng，正向引物和反向引物各0.36μmol/L，不足部分ddH₂O补足。PCR扩增在MYCYCLE扩增仪上进行，扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃复性1min，35个循环；72℃延伸10min；最后扩增产物4℃保存。

5、电泳分离和显色

扩增产物采用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳分离（丙烯酰胺：甲叉=19：1，1×TBE），电泳缓冲液为1×TBE，电压120V，跑2小时30分钟。电泳结束后，凝胶显色采用银染方法：1.固定：量取10ml乙醇和0.5ml冰醋酸，加蒸馏水到100ml，倒入盘中(视凝胶数量多少，等比例配制，适当增加固定液量，以下相同)，摇匀后将凝胶浸入固定液中，平行摇动3-5min。2.染色：在盘中加入1ml 20%AgNO₃后，平行摇动5-8min。3.水洗：倒掉定影液，加入蒸馏水清洗2-3次，时间为1-2min，洗净后倒掉蒸馏水。4．显影：在盘中加入100ml 3%NaOH溶液和0.5ml甲醛，迅速震荡，使显影液均匀作用，然后平行摇动直至显影。清楚显影后，倒掉显影液，加入蒸馏水清洗1-2次。最后在凝胶成像系统中照相保存。

6、纯度鉴定

在这些扩增产物中，若有“中烟90”的特异条带，则为纯种，否则，为杂种，见图2。

传统种子纯度检验方法中：首先需从种子的形态检验，根据其形态、大小、色泽、种脊表面波形等形态特征进行检验。因烟草种子微小，要借助电镜才能观察，且品种间种子形态虽然有差异，但是特征很难掌握。其次，幼苗形态检验，主要观察苗期烟苗的叶耳、叶色、叶形、茎叶角度、叶脉、生长势和组织结构等，由于在苗期品种特性未充分显现,只能作为初步鉴定结果；最后还要依据大田鉴定法，主要观察植株在团棵期、现蕾期和中心花开放期形态，不同的检验人员对一些性状的标准不同，检验结果受人为和环境因素的影响大，结果可靠性差。另外传统种子纯度检验方法检验周期长，至少需要4-5个月的时间。

利用本发明可以迅速且准确地鉴定品种“中烟90”的种子纯度，全部检测过程可完全在实验室完成。烟草种子播种于光照培养箱中的育苗盘中，经过约20天生长后烟苗即可用于提取DNA，进行种子纯度检验。此方法检验周期短，即在苗期阶段就可通过本方法检测种子纯度，且标准统一，不受人为以及环境的影响，结果准确可靠。

Claims

1.一种特异分子标记法鉴定烟草“中烟90”品种纯度的方法，其特征在于包括如下步骤：

1）设计特异性引物，以烟草品种“中烟90”的基因组DNA为模板，采用CTAB/NaCl法扩增得到“中烟90”特征条带，“中烟90”特征条带大小分别为159bp和98bp；

所述特异性引物为：

正向引物：

F：5′—GAACAGATTGCTGAAACTGAGAGA—3′其序列如Seq ID No：1所示；

反向引物：

R：5′—GATGAGGTGGAGGCACAAG—3′其序列如Seq ID No：2所示；

2）进行品种鉴定：

以待测品种的基因组DNA为模板进行PCR扩增：PCR扩增总体积为15μl，具体为1.5μl的10×PCRbuffer，2.5mmol/L的MgCl2，0.25mmol/L的dNTPs，Taq酶1.0U，模板DNA20-25ng，步骤1）所述的正向和反向引物各0.36μmol/L，不足部分ddH₂O补足；PCR扩增在MYCYCLE扩增仪上进行，扩增程序为DNA 94℃预变性4min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃复性1min，35个循环；72℃延伸10min；最后扩增产物4℃保存；

3）对扩增产物进行凝胶电泳：

扩增产物采用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳缓冲液为1×TBE，电压120V，电泳时间：2.5小时；电泳结束后，凝胶显色采用银染方法，在凝胶成像系统中进行观察、照相；

4）品种的鉴定：

依据步骤3）中待测样品的凝胶成像，对照步骤1）中“中烟90”的特征条带，若有“中烟90”的特征条带出现的，则为中烟90纯种；若无中烟90特征条带出现的，则为杂种。