CN108486270B - 一种利用scar分子标记进行烟草品种鉴别的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于烟草生物技术领域，具体涉及一种利用SCAR分子标记进行烟草品种鉴别的方法。该方法包括：设计SCAR引物、提取待鉴定烟草基因组DNA、PCR扩增、初步分组、RAPD分子标记、建立对应的分子ID等步骤。本申请以具体的53个烟草品种为例，利用较为成熟的SCAR分子标记和RAPD分子标记技术，建立了特征性的分子ID，可为烟草指纹图谱库的建立奠定良好基础。总体而言，本申请具有鉴定快速、结果准确、重复性较好的技术优势，可为烟草配方中烟草品种的鉴定和烟支质量的稳定鉴定良好基础，能够缓解烟叶品种不真实或品种混杂造成的卷烟配方失真、卷烟品质波动、卷烟风格变化等技术问题，因而具有较好应用价值。

Description

一种利用SCAR分子标记进行烟草品种鉴别的方法
技术领域
本发明属于烟草生物技术领域，具体涉及一种利用SCAR分子标记进行烟草品种鉴别的方法。
背景技术
烟支制备过程中，卷烟配方原料的稳定是卷烟产品质量稳定的前提。而原料的稳定包括产量及烟草品种的稳定两个方面。现有技术中，针对烟草品种鉴别，主流方法仍然是依据种子形态特征、田间农艺性状和调制后烟叶外观来进行鉴别的。但由于烟支生产涉及烟叶种植、调制、收购、调拨等多个环节，多种因素影响下都可能造成烟叶品种的不真实或品种混杂，进而导致卷烟配方失真，卷烟品质出现波动。而传统的烟草品种鉴别方法又不能实现在上述环节中对烟草品种的准确区分和鉴定。因此，对于烟叶品种间的鉴别问题亟待解决。
就作物品种鉴定而言，随着分子生物学技术的快速发展，利用分子生物标记方法进行品种识别和鉴定已经取得了一些进展。其中在烟草品种鉴定方面，也有一些较好成果。如中国专利《一种鉴别烟草品种的SCAR标记引物及其方法》（2011104084483），即可实现对多个烟草品种的鉴定识别。但该方法也存在一些扩增产物片段较大、鉴定品种较少的缺陷，因而仍有一定改进空间。
发明内容
本申请目的在于提供种利用SCAR分子标记进行烟草品种鉴别的方法，从而为烟支质量稳定奠定基础。
本申请所采取的技术方案详述如下。
一种利用SCAR分子标记进行烟草品种鉴别的方法，该方法具体包括如下步骤：
（1）设计2对SCAR引物（S4-1、S4-2引物对和S8-1、S8-2引物对），引物序列如SEQ IDNO.1~4所示，具体如下：
S4-1：5’-GGTGCACTCTCAGTACAATCTGC-3’，
S4-2：5’-CCAGTTCGATGTAACCCACTCG-3’；
以烟草基因组为模板，应用S4-1、S4-2引物对进行PCR扩增时，PCR扩增产物大小为525bp；
S8-1：5’-GATTTTGGGTCCCCGGAATCCCG-3’，
S8-2：5’-GTGGTGACACTCGTCATATAGC-3’；
以烟草基因组为模板，应用S8-1、S8-2引物对进行PCR扩增时，PCR扩增产物大小为374bp。
（2）提取待鉴定烟草基因组DNA，以所提取DNA为模板，利用步骤（1）中的SCAR引物进行PCR扩增，并对PCR扩增产物进行电泳检测分析，据此对待鉴定烟草进行初步分组；
提取待鉴定烟草基因组DNA时，具体可利用改良CTAB法进行提取；
PCR扩增时，20μL反应体系可参考设计如下：
DNA模板，50ng/μL、0.3~0.7μL；
10×PCR Buffer，1~2μL；
MgCl2，25mmol/L、0.8~1.6μL；
dNTP，10mmol/L、0.5~2μL；
上下游引物，10μmmol/L、各0.2~1μL；
Taq酶，5U/μL、0.2~0.8μL；
ddH2O，加至20μL；
反应程序为：94℃预变性6 min；94℃变性50s，在各自退火温度下退火20s，72℃延伸，延伸时间按1min延伸1000bp计算，反应35个循环；72℃延伸6min，4℃保温。
所述待鉴定烟草品种，应属于但不限于如下所述53个烟草品种，具体鉴定时可针对其中一种或任意几种同时进行鉴定；
而依据利用步骤（1）中2对SCAR引物PCR扩增时特异性条带有无的组合情况，可将53个烟草品种分为10、11、00、01四组，其中：0表示未出现特征条带，1表示出现特征条带，具体分组情况如下：
10组（7个）：红花大金元、延晒2号、延晒8号、延晒10号、吉烟5号、NC71、翠碧1号；
11组（17个）：云烟85、云烟98、云烟203、云烟317、延晒1号、延晒6号、吉烟1号、吉烟7号、吉烟10号、吉烟9号、豫烟10号、龙江911、龙江925、龙江982、K346、SAM、9407；
00组（13个）：云烟87、云烟100、云烟105、云烟202、延晒7号、豫烟6号、豫烟7号、豫烟11号、中烟100、龙江981、NC297、CT1410、GR17；
01组（16个）：云烟97、云烟99、云烟116、延晒3号、延晒4号、延晒5号、延晒9号、益延1号、延安1号、豫烟12号、中烟206、K326、NC89、NC102、秦烟96、V2。
（3）利用RAPD分子标记技术，对步骤（2）中初步分组后的组内烟草进行分子标记，建立对应的分子ID；具体而言：
对步骤（2）中初步分组后的每个小组的组内烟草进行若干轮RAPD-PCR，并对扩增产物进行电泳检测分析，根据电泳结果对小组内相关品种进行鉴定，最终得到4个小组中不同品种的分子ID；
RAPD-PCR时，20μL反应体系参考设计如下：
DNA模板，50ng/µL、0.7µL；
10×PCR Buffer，2µL；
MgCl2，25mmol/L、1.6µL；
dNTPs，10mmol/L、1µL；
RAPD随机引物，10µmol/L、0.5µL；
Taq酶，5U/µL、0.5µL；
ddH2O，13.7µL；
反应程序为：94℃预变性6 min；94℃变性50s，36℃退火30s，72℃延伸90s，40个循环；72℃终延伸6min；
PCR产物直接电泳检测分析或者4℃保存备用；
依据电泳检测结果，分别用“1”、“0”表示步骤（2）中53个烟草品种对应DNA模板在随机RAPD引物扩增结果中表现的特异性谱带的“有”、“无”，据此53个烟草品种的分子ID具体如下：
10组（7个）：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
11组（17个）：
Figure 768276DEST_PATH_IMAGE002
00组（13个）：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
01组（16个）：
Figure 967308DEST_PATH_IMAGE004
。
本申请以具体的53个烟草品种为例，利用较为成熟的SCAR分子标记和RAPD分子标记技术，建立了特征性的ID图谱，可为烟草指纹图谱库的建立奠定良好基础。总体而言，本申请具有鉴定快速、结果准确、重复性较好的技术优势，可为烟草配方中烟草品种的鉴定和烟支质量的稳定鉴定良好基础，能够缓解烟叶品种不真实或品种混杂造成的卷烟配方失真、卷烟品质波动、卷烟风格变化等技术问题，因而具有较好应用价值。
附图说明
图1为对53个烟草品种基因组DNA的提取结果；
图2为引物对S4-1/S4-2对53个烟草品种的扩增结果，1~53分别为对应的烟草品种，M是2000bp DNA ladder marker；
图3为引物对S8-1/S8-2对53个烟草品种的扩增结果，1~53分别为对应的烟草品种，M是2000bp DNA ladder marker；
图4为RAPD随机引物S236、S231、S248对10组样品扩增的电泳图，其中1~7泳道为烟草品种：延晒2号、红花大金元、延晒8号、NC71、翠碧1号、延晒10号、吉烟5号；M是2000bp DNAladder marker；
图5~10分别为RAPD随机引物S251、S42、S236、S246、S44、S231对11组样品扩增的电泳图，1~17泳道为烟草品种：云烟203、龙江925、云烟85、云烟317、吉烟10号、豫烟10号、龙江911、9407、云烟98、延晒1号、延晒6号、吉烟1号、吉烟7号、吉烟9号、龙江982、K346、SAM；M是2000bp DNA ladder marker；
图11~13分别为RAPD随机引物S227、S236、S202对00组样品扩增的电泳图，1~13泳道为烟草品种：云烟87、云烟100、豫烟7号、云烟105、CT1410、云烟202、延晒7号、豫烟6号、豫烟11号、中烟100、龙江981、NC297、GR17；M是2000bp DNA ladder marker；
图14~17分别为RAPD随机引物S236、S251、S246、S42对01组样品扩增的电泳图，1~16泳道为烟草品种：云烟99、云烟97、云烟116、K326、延晒3号、延晒4号、益延1号、豫烟12号、中烟206、NC102、V2、延晒5号、延晒9号、延安1号、NC89、秦烟96；M是2000bp DNA laddermarker；
图18为5个未知品种基因组DNA提取结果，1~5泳道为未知品种1、2、3、4、5；
图19为引物对S4-1/S4-2对未知品种的扩增结果，1~5泳道为未知品种1、2、3、4、5，M是250bp DNA ladder marker；
图20为引物对S8-1/S8-2对未知品种的扩增结果，1~5泳道为未知品种1、2、3、4、5，M是2000bp DNA ladder marker。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中涉及部分实验材料、实验试剂及仪器等背景情况简要介绍说明如下。
实验材料：
下述实施例中所涉及相关烟草材料，均为可公开获得烟草材料，均由河南中烟工业有限责任公司提供；
相关引物由生工生物工程（上海）有限公司合成提供；
实验试剂：
Taq酶、MgCl2、10×buffer等，为宝生物工程（大连）有限公司产品；
dNTPs购自上海prommega公司；
实验仪器：
DYY-6C型电泳仪，北京市六一仪器厂产品；
Vetiti型梯度PCR仪，美国ABI公司生产；
Mini Bis Pro型凝胶成像分析系统，以色列DNR凝胶成像系统有限公司产品。
实施例1
应用本申请所提供的利用SCAR分子标记进行烟草品种鉴别的方法，以53个烟草品种为例，对其进行鉴定识别，其主要技术思路为：首先设计特定的2对SCAR引物，依据PCR扩增产物的有无首先将这53个烟草品种分为4组，其次利用RAPD分子标记技术分别对4个组内烟草品种进行鉴定，并据此建立分子ID，从而为今后鉴定应用奠定基础。具体过程介绍如下。
（一）设计SCAR引物
本申请中采用了2对SCAR引物（S4-1、S4-2引物对和S8-1、S8-2引物对），引物序列如SEQ ID NO.1~4所示，具体如下：
S4-1：5’-GGTGCACTCTCAGTACAATCTGC-3’，
S4-2：5’-CCAGTTCGATGTAACCCACTCG-3’；
以烟草基因组为模板，应用S4-1、S4-2引物对进行PCR扩增时，PCR扩增产物大小为525bp；
S8-1：5’-GATTTTGGGTCCCCGGAATCCCG-3’，
S8-2：5’-GTGGTGACACTCGTCATATAGC-3’；
以烟草基因组为模板，应用S8-1、S8-2引物对进行PCR扩增时，PCR扩增产物大小为374bp。
（二）提取基因组DNA，并进行PCR扩增，据此进行初步分组
以53个烟草品种的复烤烟叶为样品材料（也可采用新鲜烟叶、初烤烟叶或仓储烟叶等其他材料），采用改良CTAB法对53个烟草品种分别提取DNA（提取DNA电泳结果如图1所示），以此为模板，利用步骤（1）中的SCAR引物对进行PCR扩增，并对PCR扩增产物进行电泳检测分析，据此对待鉴定烟草进行初步分组。
利用改良CTAB法对烟叶样品进行DNA提取时，具体操作参考如下：
（1）向盛有样品（0.1g）的1.5ml离心管中，加500μL、0.75×CTAB提取缓冲液，混匀，65℃温浴40min以上；
（2）加入500μL三氯甲烷/异戊醇（24﹕1），混匀，12000r/min离心10min；
（3）取上清，加1/10体积10%CTAB提取缓冲液，再加入等体积三氯甲烷/异戊醇（24﹕1），混匀，12000r/min离心5min；
（4）取上清，加入等体积的Tris平衡酚，抽提1次；
（5）加入等体积的三氯甲烷/异戊醇（24﹕1），混匀，12000r/min离心5min；
（6）取上清，加入2μL RNase（10mg/mL），37℃处理10min，12000r/min离心5min；
（7）取上清，加1.5倍体积的CTAB沉淀缓冲液，混匀，12000r/min离心20min；
（8）弃上清，加200μL高盐TE，65℃温浴20min；
（9）加入2.0倍体积冷的无水乙醇，-20℃，30min；
（10）12000r/min离心15min，沉淀溶于50μL超纯水中。
SCAR-PCR扩增时，20μL反应体系可参考设计如下：
DNA模板，50ng/μL、0.5μL；
10×PCR Buffer，1.5μL；
MgCl2，25mmol/L、1.0μL；
dNTP，10mmol/L、1.0μL；
上下游引物，10μmmol/L、各0.5μL；
Taq酶，5U/μL、0.5μL；
ddH2O，加至20μL；
反应程序：94℃预变性6min；94℃变性50s，在各自退火温度下退火20s，72℃延伸，延伸时间按1min延伸1000bp计算，反应35个循环；72℃延伸6min，4℃保温。
PCR扩增产物在85~100V稳定电压下，用1×TAE、2.0%的琼脂糖凝胶电泳40min。然后利用凝胶成像系统拍照，建立凝胶电泳图谱并进行分析（图2为利用S4-1/S4-2引物对的扩增产物的电泳图，图3为利用S8-1/S8-2引物对的扩增产物的电泳图）。
分组标记特征（分组依据）：
S4-1/S4-2标记特征：利用S4-1/S4-2引物对进行PCR扩增时，在：云烟85、云烟98、云烟203、云烟317、延晒1号、延晒6号、吉烟1号、吉烟7号、吉烟10号、吉烟9号、豫烟10号、龙江911、龙江925、龙江982、K346、SAM、9407、红花大金元、延晒2号、延晒8号、延晒10号、吉烟5号、NC71、翠碧1号中，均能扩增获得525bp条带（如图2所示）。
标记特征：利用S8-1/S8-2引物对进行PCR扩增时，在：云烟85、云烟98、云烟203、云烟317、延晒1号、延晒6号、吉烟1号、吉烟7号、吉烟10号、吉烟9号、豫烟10号、龙江911、龙江925、龙江982、K346、SAM、9407、云烟97、云烟99、云烟116、延晒3号、延晒4号、延晒5号、延晒9号、益延1号、延安1号、豫烟12号、中烟206、K326、NC89、NC102、秦烟96、V2中，均能扩增获得374bp条带（如图3所示）。
根据上述电泳图谱，依据PCR扩增后凝胶电泳中特异性条带有无的组合情况，可将53个烟草品种分为10、11、00、01四组，其中：0表示未出现特征条带，1表示出现特征条带，具体分组情况如下：
10组（7个）：红花大金元、延晒2号、延晒8号、延晒10号、吉烟5号、NC71、翠碧1号；
11组（17个）：云烟85、云烟98、云烟203、云烟317、延晒1号、延晒6号、吉烟1号、吉烟7号、吉烟10号、吉烟9号、豫烟10号、龙江911、龙江925、龙江982、K346、SAM、9407；
00组（13个）：云烟87、云烟100、云烟105、云烟202、延晒7号、豫烟6号、豫烟7号、豫烟11号、中烟100、龙江981、NC297、CT1410、GR17；
01组（16个）：云烟97、云烟99、云烟116、延晒3号、延晒4号、延晒5号、延晒9号、益延1号、延安1号、豫烟12号、中烟206、K326、NC89、NC102、秦烟96、V2。
（三）进行RAPD分子标记
利用RAPD分子标记技术，对步骤（2）中初步分组后的每个小组的组内烟草进行若干轮RAPD-PCR，并对扩增产物进行电泳检测分析，根据电泳结果对小组内相关品种进行鉴定，最终得到4个小组中不同品种的分子ID。
根据实验结果，共筛选出编号为S42、S44、S202、S227、S231、S236、S246、S248、S251的9个特异性较好的RAPD引物，9条特异性引物序列具体为：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
。
RAPD-PCR时，20μL反应体系参考设计如下：
DNA模板，50ng/µL、0.7µL；
10×PCR Buffer，2µL；
MgCl2，25mmol/L、1.6µL；
dNTPs，10mmol/L、1µL；
RAPD随机引物，10µmol/L、0.5µL；
Taq酶，5U/µL、0.5µL；
ddH2O，13.7µL；
反应程序为：94℃预变性6 min；94℃变性50s，36℃退火30s，72℃延伸90s，40个循环；72℃终延伸6min；
PCR产物直接电泳检测分析或者4℃保存备用。
依据电泳检测结果，分别用“1”、“0”表示步骤（2）中53个烟草品种对应DNA模板在随机RAPD引物扩增结果中表现的特异性谱带的“有”、“无”（即：分别用1、0标识RAPD条带的有、无），对步骤（2）各组（10组、11组、00组、01组）鉴定情况介绍如下。
组情况
随机引物S236（序列：GGCGGTTGTC）、S231（序列：GTCTTGCGGA）、S248（序列GGGCGGTACT）用于10组烟草品种鉴定时，表现出较好多态性 (结果如图4所示) 。
具体而言：
应用随机引物S236时，在1850bp处，NC71、延晒10号、吉烟5号有特异性扩增，其他4个品种没有特异性扩增；
应用机引物S236时，在450bp处，翠碧1号、延晒10号有特异性扩增，其他5个品种没有特异性扩增，据此可将翠碧1号、延晒10号鉴定出来；
应用随机引物S231时，在500bp处，NC71有特异性扩增，其他6个品种没有特异性扩增，据此可将NC71鉴定出来；
应用随机引物S231时，在3000bp处延晒8号、吉烟5号有特异性扩增，其他5个品种没有特异性扩增，据此可将延晒8号被鉴定出来；
应用随机引物S248时，在1500bp处延晒2号、翠碧1号有特异性扩增，其他5个品种没有特异性扩增，据此可将延晒2号被鉴定出来。
根据上述RAPD图谱，按照S236（1850bp）、S236（450bp）、S231（500bp）、S231（3000bp）、S248（1500bp）的顺序，建立7个烟草品种的分子ID如下（分别用1、0标识RAPD条带的有、无）：延晒2号（00001）、红花大金元（00000）、延晒8号（00010）、NC71（10100）、翠碧1号（01001）、延晒10号（11000）、吉烟5号（10010）。
组情况
随机引物S251（序列：TGCGAGAGTC）、S42（序列：TTCCCGCACT）、S236（序列：GGCGGTTGTC）、S246（序列：GTGACAGGCT）、S44（序列：CAAGCTCGTG）、S231（序列：GTCTTGCGGA）用于11组烟草品种鉴定时，表现出较好多态性(结果如图5~图10所示)。
简单而言：
依据RAPD电泳图谱，可知17个烟草品种在S251（1000bp）、S251（1250bp）、S236（150bp）、S236（700bp）、S236（800bp）、S236（1850bp）、S246（2150bp）、S44（300bp）、S44（2000bp）、S42（420bp）、S231（3000bp）处有不同程度的特异性扩增；按照特异性条带显示顺序，建立17个烟草品种的分子ID如下：
云烟203（10010100000）、龙江925（00010001000）、云烟85（11110101101）、云烟317（11110100101）、吉烟10号（10000110111）、豫烟10号（00000100000）、龙江911（10000100101）、9407（10000100100）、云烟98（11110001000）、延晒1号（10000100111）、延晒6号（10001100100）、吉烟1号（10000111101）、吉烟7号（00000110101）、吉烟9号（10000101111）、龙江982（10110101101）、K346（10110101001）、SAM（10001100000）。
组情况
随机引物S227（序列：GGTGGTCAAG）、S236（序列：GGCGGTTGTC）、S202（序列GGTGAGGTCA）用于00组烟草品种鉴定时，表现出较好多态性(结果如图11~图13所示)。
简单而言：
依据RAPD电泳图谱，可知13个烟草品种在S227（230bp）、S227（260bp）、S227（300bp）、S227（400bp）、S227（750bp）、S236（230bp）、S236（700bp）、S236（1850bp）、S202（1100bp）、S202（1750bp）处有不同程度的特异性扩增；按照如上所示特异性条带显示顺序，建立13个烟草品种的分子ID如下：
云烟87（1000001010）、云烟100（0000101111）、豫烟7号（1010001000）、云烟105（1100111011）、CT1410（1101101011）、云烟202（1101101111）、延晒7号（1000110111）、豫烟6号（1100011111）、豫烟11号（1101110100）、中烟100（1101111110）、龙江981（1101111100）、NC297（1101111101）、GR17（1101101110）。
组情况
随机引物S236（序列：GGCGGTTGTC）、S251（序列：TGCGAGAGTC）、S231（序列：GTCTTGCGGA）、S246（序列：GTGACAGGCT）、S42（序列：TTCCCGCACT）用于00组烟草品种鉴定时，表现出较好多态性（结果如图14~图17所示）。
简单而言：
依据RAPD电泳图谱，可知16个烟草品种在S236（1850bp）、S236（700bp）、S236（150bp）、S236（800bp）、S251（270bp）、S251（1100bp）、S251（1250bp）、S231（500bp）、S246（250bp）、S42（420bp）、S42（2850bp）处有不同程度的特异性扩增；按照如上所示特异性条带显示顺序，建立16个烟草品种的分子ID如下：
云烟99（10001101010）、云烟97（01100000100）、云烟116（01000010010）、K326（10001100101）、延晒3号（01111011101）、延晒4号（10011001100）、益延1号（11001101101）、豫烟12号（01101100100）、中烟206（11101111101）、NC102（11001111100）、V2（11101001100）、延晒5号（10011001001）、延晒9号（10001001100）、延安1号（10001100100）、NC89（10001101100）、秦烟96（11101111110）。
（四）建立分子ID
依据通常规则，设计烟草分子总ID写法为：SCAR分组ID +组内RAPD筛选ID；据此，本申请中53个烟草品种总的ID谱图为：
10组（7个）：
Figure 641652DEST_PATH_IMAGE006
11组（17个）：
Figure DEST_PATH_IMAGE007
00组（13个）：
Figure 99179DEST_PATH_IMAGE008
01组（16个）：
Figure DEST_PATH_IMAGE009
。
需要解释和说明的是，具体进行品种鉴定应用时，可对上述53个烟草品种中一种或任意几种同时进行鉴定，同时该方法也不仅限于这53个品种的应用，对于其他烟草品种也有适用范围，但需进一步制备ID后才能应用。
实施例2
本实施例从实施例1中所述53个烟草品种中随机挑选5个品种烟叶样品进行盲测（盲选品种记为品种1、2、3、4、5），以此检验本申请技术方案的准确性和可重复性。
（一）提取基因组DNA，并进行PCR扩增
相关操作参考实施例1，不再详述，提取DNA电泳结果如图18所示。利用S4-1/S4-2引物对PCR结果由图19所示，S8-1/S8-2引物对PCR结果如图20所示。
（二）依据步骤（一）的SCAR-PCR扩增结果，进行初步分组，分组依据如下：
S4-1/S4-2标记特征：利用S4-1/S4-2引物对进行PCR扩增时，只在未知样品4、5中有扩增，而在盲测样品1、2、3中没有扩增（结果如图19所示）。
标记特征：利用S8-1/S8-2引物对进行PCR扩增时，只在未知样品3中没有扩增，而在盲测样品1、2、4、5中有扩增（结果如图20所示）。
据此，按照S4-1/S4-2、S8-1/S8-2的顺序，将5个烟草品种分组如下（表示条带存在的为“1”，条带缺失的为“0”）：
01组：盲选品种1、盲选品种2
00组：盲选品种3
11组：盲选品种4、盲选品种5
（三）进行RAPD分子标记
利用RAPD分子标记技术，对步骤（二）中初步分组后的每个小组的组内烟草进行若干轮RAPD-PCR，并对扩增产物进行电泳检测分析，根据电泳结果对小组内相关品种进行鉴定，具体操作参考实施例1，不再重复，仅就相关结果简要解释说明如下。
利用对01组能产生特异性片段的随机引物S236、S251、S231、S246、S42对盲选品种1、2进行检测鉴定，结果表明：
盲选品种1在S236（1850bp）、S251（1100bp）、S42（420bp）未出现特异性片段，均出现其他特征条带，则按照原01组记录顺序可知该品种分子ID为0101111011101；
盲选品种2在S236（1850bp）、S236（800bp）、S251（270bp）、S231（500bp）、S246（250bp）均有特异性条带出现，其他特异性条带没有出现，则可知该品种分子ID为0110011001100。
利用对00组能产生特异性片段的随机引物S227、S236、S202对盲选品种3进行检测鉴定，结果表明：
盲选品种3在S227（300bp）、S236（700bp）、S202（1100bp）、S202（1750bp）均无特异性条带出现，其他特异性条带均有出现，则可知该品种的分子ID为001101110100。
利用对11组能产生特异性片段的随机引物S251、S236、S246、S44、S42、S231对盲选品种4、5进行检测鉴定，结果表明：
盲选品种4在S236（800bp）、S246（2150bp）、S42（420bp）、均无特异性条带出现，其他特异性条带均有出现，则可知该品种的分子ID为1111110101101；
盲选品种5在S236（800bp）、S246（2150bp）、S44（2000bp）、S42（420bp）、均无特异性条带出现，其他特异性条带均有出现，则可知该品种的分子ID为1111110100101。
（四）盲选品种判定
在步骤（三）所得分子ID基础上，结合实施例1中所确认的分子ID，可以判定：盲测品种1为延晒3号，盲测品种2为延晒4号，盲测品种3为豫烟11号，盲测品4为云烟85，盲测品种3为云烟317，判定结果与预期实验结果完全一致。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南中烟工业有限责任公司
<120> 一种利用SCAR分子标记进行烟草品种鉴别的方法
<130> none
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工设计
<400> 1
ggtgcactct cagtacaatc tgc 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工设计
<400> 2
ccagttcgat gtaacccact cg 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工设计
<400> 3
gattttgggt ccccggaatc ccg 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工设计
<400> 4
gtggtgacac tcgtcatata gc 22

Claims (4)

1.一种利用SCAR分子标记进行烟草品种鉴别的方法，其特征在于，该方法具体包括如下步骤：
（1）设计2对SCAR引物，引物序列如SEQ ID NO.1~4所示，具体如下：
S4-1：5’-GGTGCACTCTCAGTACAATCTGC-3’，
S4-2：5’-CCAGTTCGATGTAACCCACTCG-3’；
S8-1：5’-GATTTTGGGTCCCCGGAATCCCG-3’，
S8-2：5’-GTGGTGACACTCGTCATATAGC-3’；
（2）提取待鉴定烟草基因组DNA，以所提取DNA为模板，利用步骤（1）中的SCAR引物进行PCR扩增，并对PCR扩增产物进行电泳检测分析，据此对待鉴定烟草进行初步分组；
所述待鉴定烟草品种，为如下所述53个烟草品种；
依据利用步骤（1）中2对SCAR引物PCR扩增时特异性条带有无的组合情况，将53个烟草品种分为10、11、00、01四组，其中：0表示未出现特征条带，1表示出现特征条带，具体分组情况如下：
10组：红花大金元、延晒2号、延晒8号、延晒10号、吉烟5号、NC71、翠碧1号；
11组：云烟85、云烟98、云烟203、云烟317、延晒1号、延晒6号、吉烟1号、吉烟7号、吉烟10号、吉烟9号、豫烟10号、龙江911、龙江925、龙江982、K346、SAM、9407；
00组：云烟87、云烟100、云烟105、云烟202、延晒7号、豫烟6号、豫烟7号、豫烟11号、中烟100、龙江981、NC297、CT1410、GR17；
01组：云烟97、云烟99、云烟116、延晒3号、延晒4号、延晒5号、延晒9号、益延1号、延安1号、豫烟12号、中烟206、K326、NC89、NC102、秦烟96、V2；
（3）利用RAPD分子标记技术，对步骤（2）中初步分组后的组内烟草进行分子标记，建立对应的分子ID；具体而言：
对步骤（2）中初步分组后的每个小组的组内烟草进行若干轮RAPD-PCR，并对扩增产物进行电泳检测分析，根据电泳结果对小组内相关品种进行鉴定，最终得到4个小组中不同品种的分子ID；
RAPD-PCR时，具体RAPD引物序列如下：
Figure 257879DEST_PATH_IMAGE001
依据电泳检测结果，分别用“1”、“0”表示步骤（2）中53个烟草品种对应DNA模板在随机RAPD引物扩增结果中表现的特异性谱带的“有”、“无”；
分别按照：S236、1850bp，S236、450bp，S231、500bp，S231、3000bp，S248、1500bp的引物编号与扩增序列长度的对应关系，建立10组的7个烟草品种的分子ID；
分别按照：S251、1000bp，S251、1250bp，S236、150bp，S236、700bp，S236、800bp，S236、1850bp，S246、2150bp，S44、300bp，S44、2000bp，S42、420bp，S231、3000bp的引物编号与扩增序列长度的对应关系，建立11组的17个烟草品种的分子ID；
分别按照：S227、230bp，S227、260bp，S227、300bp，S227、400bp，S227、750bp，S236、230bp，S236、700bp，S236、1850bp，S202、1100bp，S202、1750bp的引物编号与扩增序列长度的对应关系，建立00组的13个烟草品种的分子ID；
分别按照：S236、1850bp，S236、700bp，S236、150bp，S236、800bp，S251、270bp，S251、1100bp，S251、1250bp，S231、500bp，S246、250bp，S42、420bp，S42、2850bp的引物编号与扩增序列长度的对应关系，建立01组的16个烟草品种的分子ID；
按照“总ID=SCAR分组ID +组内RAPD筛选ID”的写法，53个烟草品种的总ID如下：
10组：
Figure 574459DEST_PATH_IMAGE002
11组：
Figure 795356DEST_PATH_IMAGE003
00组：
Figure 414556DEST_PATH_IMAGE004
01组：
Figure 337382DEST_PATH_IMAGE005
。
2.如权利要求1所述利用SCAR分子标记进行烟草品种鉴别的方法，其特征在于，步骤（2）中，提取待鉴定烟草基因组DNA时，利用改良CTAB法进行提取。
3.如权利要求1所述利用SCAR分子标记进行烟草品种鉴别的方法，其特征在于，步骤（2）中，PCR扩增时，20μL反应体系设计如下：
DNA模板，50ng/μL、0.3~0.7μL；
10×PCR Buffer，1~2μL；
MgCl2，25mmol/L、0.8~1.6μL；
dNTP，10mmol/L、0.5~2μL；
上下游引物，10μmmol/L、各0.2~1μL；
Taq酶，5U/μL、0.2~0.8μL；
ddH2O，加至20μL；
反应程序为：94℃预变性6 min；94℃变性50s，在各自退火温度下退火20s，72℃延伸，延伸时间按1min延伸1000bp计算，35个循环；72℃延伸6min，4℃保温。
4.如权利要求1所述利用SCAR分子标记进行烟草品种鉴别的方法，其特征在于，步骤（3）中，RAPD-PCR时，20μL反应体系设计如下：
DNA模板，50ng/µL、0.7µL；
10×PCR Buffer，2µL；
MgCl2，25mmol/L、1.6µL；
dNTPs，10mmol/L、1µL；
RAPD随机引物，10µmol/L、0.5µL；
Taq酶，5U/µL、0.5µL；
ddH2O，13.7µL；
反应程序为：94℃预变性6 min；94℃变性50s，36℃退火30s，72℃延伸90s，40个循环；72℃终延伸6min。
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