CN111154912B - 一种烟叶的特异引物及烤后烟叶品种鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种烟叶的特异引物及烤后烟叶品种鉴定方法，用于红花大金元烟叶的检测，其中，特异引物序列中，确定为特定的上游引物和下游引物，并经过PCR扩增，经过琼脂糖电泳后进行判定，若特异性的扩增产物为明亮230bp条带时，判断对应的烟叶为红花大金元烟叶。应用本技术方案的方法，烟叶经DNA提取、PCR扩增和常规的琼脂糖电泳后即可判定是否为红花大金元，无需对扩增产物进行限制性内切酶酶切。对于烟叶原料收购中烟叶弄虚作假的防治具有重要的实用价值，本技术方案与现有技术相比，具有特异性强、实用性好、操作简便快捷的技术优势和积极效果。

Description

一种烟叶的特异引物及烤后烟叶品种鉴定方法
技术领域
本发明属于烟叶原料检测、鉴定技术领域，涉及一种烟叶的特异引物及烤后烟叶品种鉴定方法，本技术方案专用于红花大金元烟叶品种的快速、灵敏及准确的分子鉴定。
背景技术
烟丝配方原料稳定是卷烟产品质量稳定的基础。原料的稳定不但包括原料产量的稳定，而且包括原料品种的稳定。卷烟工业生产的多样化也促进了烟草向多类型多方向发展。当前对烟草品种鉴别依据种子形态特征、田间农艺性状和初烤烟叶外观来进行。但在烟叶种植、烘烤、收购、调拨等环节，由于各种因素会造成烟叶品种不真实或品种混杂等现象，造成卷烟配方失真，卷烟品质波动。而传统的烟草品种鉴别方法不能实现在上述环节对烟草品种进行准确鉴定。因此，寻求一种合理的品种鉴定方法对于保证产品质量至关重要。
目前卷烟企业对红花大金元等重要烟叶原料的鉴定方法主要为感官评吸，该方法存在准确度低、人为影响因素大等问题。
近年来随着生物技术的不断发展，利用DNA分子标记技术从基因水平上对品种进行准确鉴别，已经在中药、玉米、小麦等多个领域进行广泛的研究，并取得相应的研究成果。同时，在人类基因组研究计划（human genome project, HGP）的推动下，分子标记的研究和应用得到了迅猛的发展。与形态学标记、生化标记等传统的标记手法相比，分子标记具有以下优越性：（1）直接以DNA的形式表现，在植物体的各个组织、各发育时期均可被测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否的问题；（2）数量极多，遍及整个基因组；（3）多态性高，自然存在着许多等位变异，不需专门创造特殊的遗传材料；（4）表现为“中性”，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；（5）有许多分子标记表现为共显性，能够鉴别出纯合基因型与杂合基因型，提供完整的遗传信息；（6）遗传稳定，不受环境因素的影响；（7）操作简单、迅速，提取的DNA样品在适宜的温度条件下可以长期保存，易于实现自动化。
鉴于以上原因，本技术方案设计并筛选出一对红花大金元的特异性引物，构建出红花大金元烟叶快速、简便、特异性强、灵敏度高的鉴定体系。可应用于烟叶原料快速鉴定，为防止烟叶原料弄虚作假提供了技术支撑。
发明内容
目前卷烟企业对红花大金元等重要烟叶原料的鉴定方法主要为感官评吸，该方法存在准确度低、人为影响因素大等问题。本发明的目的是提供一种红花大金元烤后烟叶的特异引物及烤后烟叶品种鉴定方法，以解决红花大金元烟叶品种快速、准确鉴定问题。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种烟叶的特异引物，用于红花大金元烟叶的检测，特异引物序列如下：
下游引物W5-R：5'-GATTGCCAAAAAAAAAAGAA-3'；
上游引物W5-F：5'-GGGCCACAATTATCACATCA-3'。
一种烤后烟叶品种鉴定方法，利用上述的特异引物进行PCR扩增，经过琼脂糖电泳后进行判定，若特异性的扩增产物为230 bp 条带时，判断对应的烟叶为红花大金元烟叶。
鉴定方法的具体步骤包括：
（1）待检测烟叶的DNA提取
（2）PCR扩增
PCR反应体系包括2×Taq Plus Master Mix Ⅱ；引物W5-R；引物W5-F；ddH2O及DNA模板；
PCR反应条件为94℃预变性6 min、94℃变性50s、48℃退火20s、72℃延伸20s，从变性到延伸为一个循环，进行30个循环后，72℃再延伸6 min，得到PCR扩增产物；
（3）将PCR扩增产物置于含EB或其它DNA荧光染料的1.5%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上检测并拍照，根据是否扩增出产物判定结果；
（4）若PCR扩增产物为230 bp 时，即判断为红花大金元烟叶。
进一步的，DNA提取步骤包括：
（1）向盛有样品的离心管中，加入2×CTAB提取缓冲液，混匀，65℃温浴30 min；
（2）加等体积氯仿和异戊醇混合液，混匀，9000 r/min离心10 min；
（3）取步骤（2）的上清液，加等体积2×CTAB提取缓冲液，再加入等体积氯仿和异戊醇混合液，混匀，9000 r/min离心10 min；
（4）取步骤（3）离心后的上清分装入两个离心管，分别加2倍体积的CTAB沉淀缓冲液，再分别加入等体积的异丙醇，混匀，放入-20℃环境中静置1小时；
（5）静止后，9000 r/min离心10 min，弃去上清液，沉淀物用1.2 mol/L NaCl 溶液溶解，静置10-15 min；
（6）静置后，9000 r/min离心10 min后两个离心管各取上层水相至新离心管中，加入0.6体积-20℃预冷的异丙醇，混匀，-20℃静置40 min；9000 r/min离心20 min,弃去上清液；
（7）加入-20℃的70%的乙醇溶液，静置5 min；弃去上清液，用超纯水溶解沉淀。
所述氯仿和所述异戊醇混合液的体积比为24：1。
本发明的有益效果是：
本发明方法适用于红花大金元快速可靠的检测和鉴定，对于烟叶原料收购中烟叶弄虚作假的防治具有重要的实用价值。本技术方案与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：
1、特异性强：本技术方案已经对国内卷烟厂常用的烟叶样本进行验证，结果具有很强的特异性；
2、实用性好：本技术方案设计的特异性引物，可用于红花大金元高灵敏度快速分子检测鉴定，因此本方法的实用性强，满足快速可靠的检测和鉴定的需要；
3、操作简便快速：应用本技术方案的方法，对待测烟叶DNA提取、PCR扩增和常规的琼脂糖电泳后即可判定是否为红花大金元，无需对扩增产物进行限制性内切酶酶切。一般整个检测过程可在5小时内完成。
附图说明
图1为本发明所检测的红花大金元的特异性PCR扩增图；其中：M为2000bp DNAmarker；1为红花大金元；2为云烟85；3为云烟87；4为K326；5为TN86；6为云烟105；7为鄂烟3号；8为云烟109；9为云烟99；10为G80；11为云烟110；12为中烟100；13为T66；14为南江3号；15为云烟113；16为中烟99；17为云烟203；18为龙烟412CN；19为龙烟221；N为空白对照。
图2为采用系列浓度检测的红花大金元PCR扩增图；其中：1-9分别表示DNA被稀释成为0 ng/µL 、0.01ng/µL、0.1 ng/µL、1 ng/µL、3.125 ng/µL、6.25 ng/µL、12.5 ng/µL、25ng/µL、50 ng/µL。
图3为本发明所检测的红花大金元的特异性PCR扩增图；其中：M为2000bp DNAmarker；A为红花大金元；B为云烟85；C为云烟87；D为K326；N为空白对照。
图4为红花大金元与其它烟叶混合的PCR扩增图；其中：M为2000bp DNA marker；N为空白对照；1为红花大金元；2为红花大金元与云烟85的混和样品；3为红花大金元与云烟87的混合样品；4为红花大金元与K326的混合样品；5为红花大金元与云烟85、云烟87的混合样品；6为红花大金元与云烟85、K326的混合样品；7为红花大金元与云烟87、K326的混合样品；8为红花大金元与云烟85、云烟87、K326的混合样品。
图5为未知样品PCR扩增图；其中：M为2000bp DNA marker；1-12分别为未知样品H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12。
具体实施方式
以下通过实施例来详细说明本发明的技术方案，以下的实施例仅是示例性的，仅能用来解释和说明本发明的技术方案，而不能解释为是对本发明技术方案的限制。
在本申请的技术方案，红花大金元为一种烟草品种，其生产的烟叶用于卷烟的烟丝中。
本申请提供一种烟叶的特异引物，用于红花大金元烟叶的检测，特异引物序列如下：
下游引物W5-R：5'-GATTGCCAAAAAAAAAAGAA-3'；
上游引物W5-F：5'-GGGCCACAATTATCACATCA-3'。
利用该特异性引物扩增出230 bp产物时，即可判断被检测的烟叶为红花大金元烟叶。
实施例1：引物对红花大金元的特异性扩增
材料：红花大金元、云烟85、云烟87、K326、 TN86、云烟105、鄂烟3号、云烟109、云烟99、G80、云烟110、中烟100、T66、南江3号、云烟113、中烟99、云烟203、龙烟412CN、龙烟221均由红云红河烟草（集团）有限责任公司及吉林烟草工业有限责任公司提供，以上烟叶品种都经过验证，品种鉴定可靠。
1、DNA提取
向盛有样品（0.1～0.2g）的1.5ml离心管中，加750µL 2×CTAB提取缓冲液，混匀，65℃温浴30 min；加入等体积氯仿/异戊醇混合液（体积比为24:1，-20℃），混匀，9000 r/min离心10 min；取上清液500 µL，加等体积2×CTAB提取缓冲液，再加入等体积氯仿/异戊醇混合液（体积比为24:1，-20℃），混匀，9000 r/min离心10 min；取上清400µL分装入两个1.5ml离心管，分别加2倍体积的CTAB沉淀缓冲液，再分别加入等体积的异丙醇，混匀，放入-20℃环境中静置1小时；静止后，9000 r/min离心10 min，弃去上清液，沉淀物用500µL 1.2mol/L NaCl 溶液溶解，静置10-15 min；9000 r/min离心10 min后两个离心管各取500µL上层水相至新离心管中，加入0.6体积-20℃预冷的异丙醇，混匀，-20℃静置40 min；9000 r/min离心20 min,弃去上清液，加入500 µL 70%的乙醇溶液（-20℃），静置5 min；弃去上清液，用40µL超纯水溶解沉淀物。
2、不同烟叶品种的特异检测
PCR反应体系20µL包括2×Taq Plus Master Mix Ⅱ 10 µL；引物W5-R 0.5 µL；引物W5-F 0.5 µL；ddH2O 8.5 µL；DNA模板 0.5 µL；PCR反应条件为94℃预变性6 min、94℃变性50s、48℃退火20s、72℃延伸20s，从变性到延伸为一个循环，进行30个循环后，72℃再延伸6 min。
3、检测结果
检测的特异性：如图1所示，红花大金元可特异扩增出230bp产物；云烟85、云烟87、K326、 TN86、云烟105、鄂烟3号、云烟109、云烟99、G80、云烟110、中烟100、T66、南江3号、云烟113、中烟99、云烟203、龙烟412CN、龙烟221、空白对照均无扩增产物，该引物对红花大金元具有很强的特异性。
实施例2：特异引物的灵敏性检测
1、DNA浓度稀释：提取的红花大金元基因组DNA，经紫外分光光度计测过浓度后，九个样品采用系列浓度稀释。
2、灵敏性检测：PCR反应体系如实施例1。
3、检测结果：如图2 所示，在20µL反应体系中，9个样品红花大金元基因组DNA除前三个样品无明显扩增的带外，其余样品均可获得明显扩增目的条带，产物大小为230bp，检测灵敏度可达0.1ng。
实施例3：特异引物对红花大金元与其他烟叶品种混合的PCR扩增。
材料：红花大金元、云烟85、云烟87、K326由红云红河烟草（集团）有限责任公司及吉林烟草工业有限责任公司提供，以上烟叶品种都经过验证，品种鉴定可靠。
1、红花大金元与不同品种烟叶混合：将红花大金元与云烟85混和；将红花大金元与云烟87混合；将红花大金元与K326混合；将红花大金元与云烟85、云烟87混合；将红花大金元与云烟85、K326混合；将红花大金元与云烟87、K326混合；将红花大金元与云烟85、云烟87、K326混合。
2、DNA提取：DNA提取步骤如实施例1。
3、混合烟叶PCR检测：PCR反应体系如实施例1。
4、检测结果：如图3、图4所示，红花大金元、红花大金元与云烟85混和样品、红花大金元与云烟87混合样品、红花大金元与K326混合样品、红花大金元与云烟85、云烟87混合样品、红花大金元与云烟85、K326混合样品、红花大金元与云烟85、云烟87、K326混合样品均可获得明显扩增目的条带，产物大小为230bp；云烟85、云烟87、K326与空白对照均无扩增产物。说明该引物对红花大金元有很强的特异性，可用作混合烟叶中红花大金元的定性检测。
实施例4：特异引物对未知样品的PCR扩增。
材料：未知品种烟叶样品H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12均由红云红河烟草（集团）有限责任公司提供。
1、DNA提取：DNA提取步骤如实施例1。
2、未知品种烟叶样品PCR检测：PCR反应体系如实施例1。
3、检测结果：如图5所示，未知品种烟叶样品H2、H3、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12均在230bp处有明显亮带，H1、H4处无亮带，由PCR的结果得出除了H1与H4之外，其余未知样品均为红花大金元。经鉴定H1与H4不是红花大金元，其余样品均为红花大金元。这与PCR的结果一样，因此该引物可用于定性检测红花大金元。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明 的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变形，本发明的范围由所附权利要求及其等同限定。

Claims (5)

1.一种烟叶的特异引物，其特征在于，用于红花大金元烟叶的检测，特异引物序列如下：
下游引物W5-R：5'-GATTGCCAAAAAAAAAAGAA-3'；
上游引物W5-F：5'-GGGCCACAATTATCACATCA-3'。
2.一种烤后烟叶品种鉴定方法，其特征在于，利用权利要求1所述的特异引物进行PCR扩增，经过琼脂糖电泳后进行判定，若特异性的扩增产物为230 bp 时，判断对应的烟叶为红花大金元烟叶。
3.根据权利要求2所述的烤后烟叶品种鉴定方法，其特征在于，鉴定方法的具体步骤包括：
（1）待检测烟叶的DNA提取
（2）PCR扩增
PCR反应体系包括2×Taq Plus Master Mix Ⅱ；引物W5-R；引物W5-F；ddH2O及DNA模板；
PCR反应条件为94℃预变性6 min、94℃变性50s、48℃退火20s、72℃延伸20s，从变性到延伸为一个循环，进行30个循环后，72℃再延伸6 min，得到PCR扩增产物；
（3）将PCR扩增产物置于含EB或其它DNA荧光染料的1.5%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上检测并拍照，根据是否扩增出产物判定结果；
（4）若PCR扩增产物为明亮230 bp条带时，即判断为红花大金元烟叶。
4.根据权利要求3所述的烤后烟叶品种鉴定方法，其特征在于，DNA提取步骤包括：
（1）向盛有样品的离心管中，加入2×CTAB提取缓冲液，混匀，65℃温浴30 min；
（2）加等体积氯仿和异戊醇混合液，混匀，9000 r/min离心10 min；
（3）取步骤（2）的上清液，加等体积2×CTAB提取缓冲液，再加入等体积氯仿和异戊醇混合液，混匀，9000 r/min离心10 min；
（4）取步骤（3）离心后的上清分装入两个离心管，分别加2倍体积的CTAB沉淀缓冲液，再分别加入等体积的异丙醇，混匀，放入-20℃环境中静置1小时；
（5）静止后，9000 r/min离心10 min，弃去上清液，沉淀物用1.2 mol/L NaCl 溶液溶解，静置10-15 min；
（6）静置后，9000 r/min离心10 min后两个离心管各取上层水相至新离心管中，加入0.6体积-20℃预冷的异丙醇，混匀，-20℃静置40 min；9000 r/min离心20 min,弃去上清液；
（7）加入-20℃的70%的乙醇溶液，静置5 min；弃去上清液，用超纯水溶解沉淀。
5.根据权利要求4所述的烤后烟叶品种鉴定方法，其特征在于，所述氯仿和所述异戊醇混合液的体积比为24：1。
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