CN113122647A - 一种基于荧光定量pcr技术的混合烟叶中红花大金元定量鉴定方法 - Google Patents
一种基于荧光定量pcr技术的混合烟叶中红花大金元定量鉴定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113122647A CN113122647A CN201911426251.5A CN201911426251A CN113122647A CN 113122647 A CN113122647 A CN 113122647A CN 201911426251 A CN201911426251 A CN 201911426251A CN 113122647 A CN113122647 A CN 113122647A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- pair
- seq
- fluorescent
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 title claims abstract description 58
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 title claims abstract description 58
- 235000003255 Carthamus tinctorius Nutrition 0.000 title claims abstract description 42
- 244000020518 Carthamus tinctorius Species 0.000 title claims abstract description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 title abstract description 14
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 14
- 229960003511 macrogol Drugs 0.000 title description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 45
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 40
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims abstract description 21
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims abstract description 21
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 45
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 38
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 35
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 35
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 241001522633 Betula utilis subsp. albosinensis Species 0.000 claims description 10
- 239000008830 Carthamus tinctorius Honghua extract Substances 0.000 claims description 10
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 8
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 8
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 claims description 8
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 76
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 16
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 16
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 235000019504 cigarettes Nutrition 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 2
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种基于荧光定量PCR技术的混合烟叶中红花大金元定量鉴定方法，并公开三组对红花大金元具有特异性的引物和荧光探针序列，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑8所示，通过将具有特异性引物转换成TaqMan荧光探针，TaqMan荧光探针具有高度的选择特异性和重复性；该技术的灵敏度和准确度比普通PCR技术较高；该技术操作步骤简单，可实现实时定量检测；实现混合复烤烟叶品种的定性，定量检测。
Description
技术领域
本发明涉及烟草生物技术领域，特别是涉及一种基于荧光定量PCR技术的混合烟草品种定量鉴定方法。
背景技术
卷烟的在线生产过程中，烟叶配方真实稳定是保障卷烟产品质量稳定的基础，原料的稳定包括产量和烟草品种的稳定两个方面。目前的技术中，对于烟草品种的鉴别，主要还是依据烟草种子的形态特征、田间的农艺性状和调制后烟叶的外观来进行鉴别。但是由于烟支生产涉及烟叶收购，打叶复烤、回潮切丝等多个环节，在多种因素的作用下都有可能造成烟叶品种的不真实或者烟叶配比前后不一致，进而导致卷烟配方的失真，卷烟品质出现波动。传统的烟草品种鉴别方法不能实现上述环节中对烟草品种的准确鉴定与定量检测。随着分子生物学的发展，利用荧光定量技术定性定量检测烟叶配方中烟叶品种真实性与烟叶配比一致性具有重要意义。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种基于荧光定量PCR技术的混合烟叶中红花大金元定量鉴定方法
本发明的目的是以下述方式实现的：
一种红花大金元烟叶构建特异定量PCR精准检测的引物组，所述引物组包括3对，引物序列如下所示：
第一对引物上游序列：SEQ ID NO.1；
第一对引物下游序列：SEQ ID NO.2；
第二对引物上游序列：SEQ ID NO.3；
第二对引物下游序列：SEQ ID NO.4；
第三对引物上游序列：SEQ ID NO.5；
第三对引物下游序列：SEQ ID NO.6；
第一对荧光探针序列：SEQ ID NO.7；
第二对荧光探针序列：SEQ ID NO.8；
第三对荧光探针序列：SEQ ID NO.9。
一种利用权利要求1所述的引物序列进行测定混合烟叶中红花大金元含量的方法，包括如下步骤：
（1）合成序列为SEQ ID NO.1-6的三组引物以及序列为SEQ ID NO.7-9的三对荧光探针；
（2）制备红花大金元DNA稀释液和预混样品DNA稀释液，预混样品DNA稀释液为红花大金元DNA与其他品种烟叶DNA的混合稀释液；
（3）分别以红花大金元DNA稀释液为模板和预混样品DNA稀释液为模板进行PCR扩增反应，然后荧光定量PCR检测。
所述步骤（3）中荧光PCR反应体系为：DNA稀释液模板，1-2µl；2×AceQ UniversalU+ Probe Master Mix，7-10µl；取上述三对引物中一对引物的上游引物和下游引物，10µmol/L、各0.2-1µl；与上游引物和下游引物对应的荧光探针，10µmol/L，0.1-0.5µl；ddH2O，加至20µl。
所述步骤（3）中荧光PCR扩增反应程序为：37℃污染消化2min；95℃预变性5min；95℃变性10s，45-60℃延伸10-30s，反应40-45个循环。
本发明有益效果：通过采集红花大金元烟叶DNA，并确定具有特异性的引物，通过将具有特异性引物转换成TaqMan荧光探针，TaqMan荧光探针具有高度的选择特异性和重复性；该技术的灵敏度和准确度比普通PCR技术较高；该技术操作步骤简单，可实现实时定量检测；实现混合复烤烟叶品种的定性，定量检测。
附图说明
图1是红花大金元、云烟85、云烟87、K326烟草基因组DNA提取结果；
图2是第一对引物对于四个烟草品种的扩增结果，1-5红花大金元，云烟85，云烟87，K326，空白，M：maker；
图3是第二对引物对于四个烟草品种的扩增结果，1-5红花大金元，云烟85，云烟87，K326，空白，M：maker
图4是第三对引物对于四个烟草品种的扩增结果，1-5红花大金元，云烟85，云烟87，K326，空白，M：maker；
图5是第四对引物对于四个烟草品种的扩增结果，1-5红花大金元，云烟85，云烟87，K326，空白，M：maker；
图6是第五对引物对于四个烟草品种的扩增结果，1-5红花大金元，云烟85，云烟87，K326，空白，M：maker；
图7是第一对引物转化成荧光探针后对于四个烟草品种的扩增结果，1-5红花大金元，云烟85，云烟87，K326，空白，M：maker；
图8是第二对引物转化成荧光探针后对于四个烟草品种的扩增结果，1-5红花大金元，云烟85，云烟87，K326，空白，M：maker；
图9是第三对引物转化成荧光探针后对于四个烟草品种的扩增结果，1-5红花大金元，云烟85，云烟87，K326，空白，M：maker；
图10 第一对引物的标准曲线方程 ；
图11 第二对引物的标准曲线方程；
图12 第三对引物样品1的标准曲线方程；
图13 第三对引物样品2的标准曲线方程。
具体实施方式
下面结合实例对本发明进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
本申请所提供的一种基于荧光定量PCR技术的混合烟草品种定量鉴定方法，以红花大金元与云烟85，云烟87，K326不同比例混合为例，对其进行定性定量检测，其主要技术思路为：首先筛选出针对红花大金元的特异性引物，再将针对红花大金元的特异性引物转化成荧光探针，然后对未知混合品种中是否含有红花大金元以及含量多少进行定性定量检测。
SCAR引物的设计合成：根据已知的基因组DNA序列利用Primer Primer 5 引物设计软件重新设计合成出5对SCAR引物，引物序列如下所示：
SEQ ID NO.1~6与SEQ ID NO.10~13。
提取四种烟叶基因组DNA：四种烟叶为红花大金元、云烟85、云烟87、K326，其提取步骤大体上与改良版的CTAB法提取步骤一样，主要区别在于复烤烟叶的研磨方式采用组织研磨仪在65HZ，120S的条件下研磨2次；水浴时间选择65℃，30min；离心转速全部选择为9000r/min；DNA洗涤剂选用70%的乙醇。分别以提取的四种烟叶DNA稀释液为模板，进行PCR扩增，每种烟叶DNA进行5次扩增，每次选用5对引物中的一种引物，并进行电泳检测，20µl反应体系设计如下：提取烟叶DNA稀释液模板，0.1-1µl；2×Taq Plus Master Mix II，7-10µl；5对引物中的一种上游引物和下游引物，10µmol/L、各0.2-1µl；ddH2O，加至20µl；每种烟叶DNA稀释液模板分别与5对引物进行一次扩增。每次PCR扩增反应程序为均为：94℃预变性6min；94℃变性50s，在各自的退火温度下退火20s，72℃延伸，延伸时间按1min中1000bp计算，反应30-35个循环；72℃延伸30s，4℃保温。
扩增后经琼脂糖凝胶电泳检测，由图2~6可知，序列为SEQ ID NO.1~6的引物在红花大金元100-250bp之间的位置中出现特异性条带，序列为SEQ ID NO.10~13的引物在四种烟叶样品中均有条带，即无特异性。
将序列为SEQ ID NO.1~6引物根据红花大金元基因组DNA特点和荧光定量精度的要求，探针的上游区域5’的位置选择FAM荧光基团修饰，下游区域的3’位置选用MGB淬灭基团修饰，产物的长度保持在80-200bp，转化成荧光探针。如图7~9所示，转化后的荧光探针只在红花大金元处有特异性条带，且该条带大小也在100-250bp之间，由此可知序列为SEQ IDNO.1~6引物转化成功，转化成功的探针序列为SEQ ID NO.7~9。
利用荧光探针进行荧光定量PCR定性、定量检测配方中烟叶品种真实性和烟叶配比前后是否一致：
制备将浓度为55 ng/µl的红花大金元DNA与ddH2O分别按红花大金元质量占比10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%进行混配作为标准样品，
红花大金元DNA荧光PCR扩增时，20µl反应体系设计如下：红花大金元DNA稀释液模板，1-2µl；2×AceQ Universal U+ Probe Master Mix，7-10µl；取三对引物中一对引物的上游引物和下游引物，10µmol/L、各0.2-1µl；与上游引物和下游引物对应的荧光探针，10µmol/L，0.1-0.5µl；ddH2O，加至20µl。
制备预混样品DNA稀释液，预混样品DNA稀释液为红花大金元DNA与其他品种烟叶DNA的混合稀释液。
预混样品DNA荧光PCR扩增时，20µl反应体系设计如下：预混样品DNA稀释液模板，50ng/µl、1-2µl；2×AceQ Universal U+ Probe Master Mix，7-10µl；取三对引物中一对引物的上游引物和下游引物，10µmol/L、各0.2-1µl；与上游引物和下游引物对应的荧光探针，10µmol/L，0.1-0.5µl；ddH2O，加至20µl。
将以红花大金元DNA稀释液为模板的体系和以预混样品DNA稀释液为模板的体系同时同一程序进行PCR扩增，其反应程序为：37℃污染消化2min；95℃预变性5min；95℃变性10s，45-60℃延伸10-30s，反应40-45个循环，污染消化步骤主要是除去影响扩增的杂质，如空气气溶胶、加样过程中的一写污染物。在此过程中收集数据，以红花大金元DNA浓度为横坐标，三次CT均值为纵坐标，绘制标准曲线，得到红花大金元DNA浓度与CT值之间的线性方程；预混样品的CT平均值带入到对应引物的标准曲线中，得出待测样品中红花大金元的含量。同样的操作将，将三对引物对应的进行PCR扩增并绘制出标准曲线。
第一对引物上游序列SEQ ID NO.1为：5’-TTGCCAAAAAAAAAAGAAGA-3’；
第一对引物下游序列SEQ ID NO.2为：5’-GCCACAATTATCACATCATA-3’；
第二对引物上游序列SEQ ID NO.3为：5’-GATTGCCAAAAAAAAAAGAA-3’；
第二对引物下游序列SEQ ID NO.4为：5’-GCCACAATTATCACATCATA-3’；
第三对引物上游序列SEQ ID NO.5为：5’-GGGCCACAATTATCACATCATAC-3’；
第三对引物下游序列SEQ ID NO.6为：5’-GCGGATTGCCAAAAAAAAAAGAAG-3’；
第一对荧光探针序列SEQ ID NO.7为：5’-TTCCTCCACATCTCA-3’；
第二对荧光探针序列SEQ ID NO.8为：5’-CCTCCACATCTCACATCATTATCA-3’；
第三对荧光探针序列SEQ ID NO.9为：5’-TTCCTCCACATCTCACATCATTATCAAT-3’；
第四对引物上游序列SEQ ID NO.10为：5’-AAAAAAAAAAGAAGAGAG-3’；
第四对引物下游序列SEQ ID NO.11为：5’-ACATAGTTTGGCATAATA-3’；
第五对引物上游序列SEQ ID NO.12为：5’- TTGCCAAAAAAAAAAGAA-3’；
第五对引物下游序列SEQ ID NO.13为：5’- GGGCCACAATTATCACAT-3’。
实施例1
合成序列为SEQ ID NO.1-6的引物以及序列为SEQ ID NO.7-9的荧光探针；制备预混样品DNA稀释液，预混样品DNA稀释液即为红花大金元DNA与其他烟叶DNA的混合稀释液；配制荧光PCR反应体系并进行荧光PCR扩增反应；利用荧光探针进行荧光定量PCR定性、定量检测配方中烟叶品种真实性和烟叶配比前后是否一致。
将红花大金元DNA与云烟85DNA按照红花大金元质量占比50%、60%、70%、80%、90%、100%进行预混，预混样品按照荧光定量PCR反应条件和反应程序进行荧光定量PCR扩增，每组实验重复3次。荧光PCR扩增时，20µl反应体系设计如下：红花大金元DNA与云烟85DNA稀释液模板，50ng/µl、2µl；2×AceQ Universal U+ Probe Master Mix，10µl；第一对上游引物和下游引物，10µmol/L、各0.4µl；第一对荧光探针，10µmol/L，0.2µl；ddH2O，加至20µl。
将浓度为55 ng/µl的红花大金元DNA与ddH2O分别按红花大金元质量占比10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%进行混配作为标准样品，进行第一对引物的荧光定量PCR，荧光PCR扩增时，20µl反应体系设计如下：红花大金元DNA稀释液，2µl；2×AceQUniversal U+ Probe Master Mix，10µl；第一对上游引物和下游引物，10µmol/L、各0.4µl；第一对荧光探针，10µmol/L，0.2µl；ddH2O，加至20µl。
荧光PCR扩增反应程序为：37℃污染消化2min；95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃延伸20s，反应40个循环，在此过程中收集数据。
然后以红花大金元DNA浓度为横坐标，三次CT均值为纵坐标，绘制标准曲线，得到红花大金元DNA浓度与CT值之间的线性方程y= -1.249ln(x) + 28.151，其中标准方程的R2(相关系数)为0.95，如图10所示，根据得到的标准曲线方程，依次带入各预混样品的CT平均值，分别计算出待测样品中红花大金元的含量，如表1所示。
分析结果可知：50%的红花大金元与50%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为42.63%，与实际值的偏差为7.36%，相对误差为14.37%；60%的红花大金元与40% 的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为48%，与实际值的偏差为11.99%，相对误差为19.98%；70%的红花大金元与30%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为73.45%，与实际值的偏差为3.45%，相对误差为4.93%；80%的红花大金元与20%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为72%，与实际值的偏差为8%，相对误差为9.99%；90%的红花大金元与10%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为96.9%，与实际值的偏差为3.1%，相对误差为7.67%；100%的红花大金元与0%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为91.45%， 与实际值的相对误差为8.55%。
表1 第一对引物预混样品的DNA浓度
实施例2
过程同实例1，将红花大金元DNA与云烟85DNA按照红花大金元质量占比50%、60%、70%、80%、90%、100%进行预混，预混样品按照荧光定量PCR反应条件和反应程序进行荧光定量PCR扩增，每组实验重复3次。荧光PCR扩增时，20µl反应体系设计如下：红花大金元DNA与云烟85DNA稀释液模板，50ng/µl、1µl；2×AceQ Universal U+ Probe Master Mix，8µl；第二对上游引物和下游引物，10µmol/L、各1µl；第二对荧光探针，10µmol/L，0.5µl。
将浓度为55 ng/µl的红花大金元DNA与ddH2O分别按红花大金元质量占比10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%进行混配作为标准样品进行第二对引物的荧光定量PCR；20µl反应体系设计如下：红花大金元DNA稀释液，1µl；2×AceQ Universal U+Probe Master Mix，8µl；第二对上游引物和下游引物，10µmol/L、各1µl；第二对荧光探针，10µmol/L，0.5µl；ddH2O，加至20µl。
荧光PCR扩增反应程序为：37℃污染消化2min；95℃预变性5min；95℃变性10s，45℃延伸10s，反应45个循环，在此过程中收集数据。
然后以红花大金元DNA浓度为横坐标，三次CT均值为纵坐标，绘制标准曲线，得到DNA浓度与CT值之间的线性方程y = -1.376ln(x) + 27.793，其中标准方程的R2（相关系数）为0.995，如图11所示，根据得到的标准曲线方程，依次带入各预混样品的CT平均值，分别计算出待测样品中红花大金元DNA浓度，如表2所示。
分析结果可知：50%的红花大金元与50%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为57.04%，相对误差为15.88%；60%的红花大金元与40%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为50.64%，相对误差为-15.77%；70%的红花大金元与30%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为69.71%，相对误差为0.72%；80%的红花大金元与20%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为85.88%，相对误差为7.35%；90%的红花大金元与10%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为80.09%，相对误差为-10.24%；100%的红花大金元与0%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为95.16%，与实际值的相对误差为-4.84%。
表2 第二对引物预混样品的DNA浓度
实施例3
过程同实例1，将红花大金元DNA与云烟85DNA按照红花大金元质量占比50%、60%、70%、80%、90%、100%进行预混，预混样品按照荧光定量PCR反应条件和反应程序进行荧光定量PCR扩增，每组实验重复3次。荧光PCR扩增时，20µl反应体系设计如下：红花大金元DNA与云烟85DNA稀释液模板，50ng/µl、1.5µl；2×AceQ Universal U+ Probe Master Mix，8µl；第三对上游引物和下游引物，10µmol/L、各1µl；第三对荧光探针，10µmol/L，0.5µl；ddH2O，加至20µl。
将浓度为55 ng/µl的红花大金元DNA与ddH2O分别按红花大金元质量占比10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%进行混配作为标准样品进行第三对引物的荧光定量PCR；PCR扩增时，20µl反应体系设计如下：红花大金元 DNA稀释液模板，1.5µl；2×AceQUniversal U+ Probe Master Mix，8µl；第三对上游引物和下游引物，10µmol/L、各1µl；第三对荧光探针，10µmol/L，0.5µl；ddH2O，加至20µl。
荧光PCR扩增反应程序为：37℃污染消化2min；95℃预变性5min；95℃变性10s，50℃延伸30s，反应43个循环。
然后以DNA浓度为横坐标，三次CT均值为纵坐标，绘制标准曲线，得到DNA浓度与CT值之间的线性方程y = -1.473ln(x) + 27.747，其中标准方程的R2（相关系数）为0.968，如图12所示，根据得到的标准曲线方程，依次带入各实验样品的CT平均值，分别计算出待测样品中红花大金元DNA浓度，如表3所示。
分析结果可知：50%的红花大金元与50%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为50.74%，与实际值的偏差为0.74%，相对误差为1.48%；60%的红花大金元与40%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为58.19%，与实际值的偏差为1.81%，相对误差为3.02%；70%的红花大金元与30%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为77.86%，与实际值的偏差为7.86%，相对误差为11.23%；80%的红花大金元与20%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为93.94%，与实际值的偏差为13.94%，相对误差为17.43%；90%的红花大金元与10%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为94.17%，与实际值的偏差为4.17%，相对误差为4.63%；100%的红花大金元与0%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为106.14%，与实际值的相对误差为6.14%。
表3 第三对引物预混样品的DNA浓度
将实施例1~3实验进行统计分析。分析结果可知：经100组实验后可知，见表4，50%的红花大金元与50%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为40.64%，与实际值的偏差为9.36%，相对误差18.72%；60%的红花大金元与40%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为50.02%，与实际值的偏差为10.02%，相对误差16.64%；70%的红花大金元与30%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为61.00%，与实际值的偏差为9.0%，相对误差12.86%；80%的红花大金元与20%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为73.84%，与实际值的偏差为6.16%，相对误差7.70%；90%的红花大金元与10%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为81.53%，与实际值的偏差为8.47%，相对误差9.41%；100%的红花大金元与0%的云烟85混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为85.10%，相对误差14.91%。
表4 实施例1~3荧光定量检测结果
实施例4
过程同实例1，将质量占比为50%的红花大金元与25%的云烟87、25%的K326进行预混，预混样品按照荧光定量PCR反应条件和反应程序进行荧光定量PCR扩增，实验重复3次。荧光PCR扩增时，20µl反应体系设计如下：红花大金元DNA与云烟87DNA、K326DNA稀释液模板，50ng/µl、2µl；2×AceQ Universal U+ Probe Master Mix，10µl；第三对上游引物和下游引物，10µmol/L、各0.8µl；第三对荧光探针，10µmol/L，0.4µl；ddH2O，加至20µl。
将浓度为55 ng/µl的红花大金元DNA与ddH2O分别按红花大金元质量占比10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%进行混配作为标准样品进行第三对引物的荧光定量PCR。荧光PCR扩增时，20µl反应体系设计如下：红花大金元 DNA稀释液模板，2µl；2×AceQ Universal U+ Probe Master Mix，9µl；第三对上游引物和下游引物，10µmol/L、各0.8µl；第三对荧光探针，10µmol/L，0.4µl；ddH2O，加至20µl。
荧光PCR扩增反应程序为：37℃污染消化2min；95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃延伸30s，反应40个循环。
然后以DNA浓度为横坐标，三次CT均值为纵坐标，绘制标准曲线，得到DNA浓度与CT值之间的线性方程y = -1.498ln(x) + 27.518，其中标准方程的R2（相关系数）为0.986，如图13，根据得到的标准曲线方程，依次带入各实验样品的CT平均值，分别计算出待测样品中红花大金元DNA浓度，如表5所示。
分析结果可知：50%的红花大金元与25%的云烟87、25%的K326混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为50.38%，相对误差为0.77%；60%的红花大金元与20%的云烟87、20%的K326混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为53.36%，相对误差为-11.07%；70%的红花大金元与20%的云烟87、10%的K326混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为58.08%，相对误差为-17.02%；80%的红花大金元与10%的云烟87、10%的K326混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为80.02%，相对误差为0.03%；90%的红花大金元与3%的云烟87、7%的K326混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为77.79%，相对误差为-13.57%；100%的红花大金元与0%的云烟87、0%的K326混合之后，经荧光定量检测后红花大金元含量为89.82%，与实际值的相对误差为10.18%。
表5 第三对引物预混样品的DNA浓度
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 郑州轻工业大学
<120> 一种基于荧光定量PCR技术的混合烟叶中红花大金元定量鉴定方法
<130> 1912714CGCN-ZL-WXL-LPY
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 第一对引物上游序列
<400> 1
ttgccaaaaa aaaaagaaga 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 第一对引物下游序列
<400> 2
gccacaatta tcacatcata 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 第二对引物上游序列
<400> 3
gattgccaaa aaaaaaagaa 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 第二对引物下游序列
<400> 4
gccacaatta tcacatcata 20
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 第三对引物上游序列
<400> 5
gggccacaat tatcacatca tac 23
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 第三对引物下游序列
<400> 6
gcggattgcc aaaaaaaaaa gaag 24
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> 第一对荧光探针序列
<400> 7
ttcctccaca tctca 15
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 第二对荧光探针序列
<400> 8
cctccacatc tcacatcatt atca 24
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 第三对荧光探针序列
<400> 9
ttcctccaca tctcacatca ttatcaat 28
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 第四对引物上游序列
<400> 10
aaaaaaaaaa gaagagag 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 第四对引物下游序列
<400> 11
acatagtttg gcataata 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 第五对引物上游序列
<400> 12
ttgccaaaaa aaaaagaa 18
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 第五对引物下游序列
<400> 13
gggccacaat tatcacat 18
Claims (4)
1.一种红花大金元烟叶构建特异定量PCR精准检测的引物组，其特征在于：所述引物组包括3对，引物序列如下所示：
第一对引物上游序列：SEQ ID NO.1；
第一对引物下游序列：SEQ ID NO.2；
第二对引物上游序列：SEQ ID NO.3；
第二对引物下游序列：SEQ ID NO.4；
第三对引物上游序列：SEQ ID NO.5；
第三对引物下游序列：SEQ ID NO.6；
第一对荧光探针序列：SEQ ID NO.7；
第二对荧光探针序列：SEQ ID NO.8；
第三对荧光探针序列：SEQ ID NO.9。
2.一种利用权利要求1所述的引物序列进行测定混合烟叶中红花大金元含量的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）合成序列为SEQ ID NO.1-6的三组引物以及序列为SEQ ID NO.7-9的三对荧光探针；
（2）制备红花大金元DNA稀释液和预混样品DNA稀释液，预混样品DNA稀释液为红花大金元DNA与其他品种烟叶DNA的混合稀释液；
（3）分别以红花大金元DNA稀释液为模板和预混样品DNA稀释液为模板进行PCR扩增反应，然后荧光定量PCR检测。
3.根据权利要求2所述的测定混合烟叶中红花大金元含量的方法，其特征在于：所述步骤（3）中荧光PCR反应体系为：DNA稀释液模板，1-2µl；2×AceQ Universal U+ ProbeMaster Mix，7-10µl；取上述三对引物中一对引物的上游引物和下游引物，10µmol/L、各0.2-1µl；与上游引物和下游引物对应的荧光探针，10µmol/L，0.1-0.5µl；ddH2O，加至20µl。
4.根据权利要求2所述的测定混合烟叶中红花大金元含量的方法，其特征在于：所述步骤（3）中荧光PCR扩增反应程序为：37℃污染消化2min；95℃预变性5min；95℃变性10s，45-60℃延伸10-30s，反应40-45个循环。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911426251.5A CN113122647B (zh) | 2019-12-31 | 2019-12-31 | 一种基于荧光定量pcr技术的混合烟叶中红花大金元定量鉴定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911426251.5A CN113122647B (zh) | 2019-12-31 | 2019-12-31 | 一种基于荧光定量pcr技术的混合烟叶中红花大金元定量鉴定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113122647A true CN113122647A (zh) | 2021-07-16 |
| CN113122647B CN113122647B (zh) | 2024-06-21 |
Family
ID=76771182
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911426251.5A Active CN113122647B (zh) | 2019-12-31 | 2019-12-31 | 一种基于荧光定量pcr技术的混合烟叶中红花大金元定量鉴定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113122647B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111154912A (zh) * | 2020-03-17 | 2020-05-15 | 河南中烟工业有限责任公司 | 一种烟叶的特异引物及烤后烟叶品种鉴定方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102605047A (zh) * | 2011-12-09 | 2012-07-25 | 郑州轻工业学院 | 一种鉴别烟草品种的scar标记引物及其方法 |
| CN107345252A (zh) * | 2017-07-10 | 2017-11-14 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 用于鉴定烤烟秦烟96的引物组合及试剂盒、应用及鉴定方法 |
| CN111154912A (zh) * | 2020-03-17 | 2020-05-15 | 河南中烟工业有限责任公司 | 一种烟叶的特异引物及烤后烟叶品种鉴定方法 |
-
2019
- 2019-12-31 CN CN201911426251.5A patent/CN113122647B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102605047A (zh) * | 2011-12-09 | 2012-07-25 | 郑州轻工业学院 | 一种鉴别烟草品种的scar标记引物及其方法 |
| CN107345252A (zh) * | 2017-07-10 | 2017-11-14 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 用于鉴定烤烟秦烟96的引物组合及试剂盒、应用及鉴定方法 |
| CN111154912A (zh) * | 2020-03-17 | 2020-05-15 | 河南中烟工业有限责任公司 | 一种烟叶的特异引物及烤后烟叶品种鉴定方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 候宁宁: "红花大金元特异性SCAR引物筛选", 农产品加工, no. 10, pages 59 - 65 * |
| 李萌: "荧光定量PCR法定量检测混合烟叶中的红花大金元", 烟草科技, vol. 55, no. 1, pages 25 - 32 * |
| 汪安云, 肖炳光, 李天飞, 李永平, 卢江平, 刘勇, 莫笑晗: "烤烟品种的RAPD引物筛选", 中国烟草学报, no. 04, pages 7 - 11 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111154912A (zh) * | 2020-03-17 | 2020-05-15 | 河南中烟工业有限责任公司 | 一种烟叶的特异引物及烤后烟叶品种鉴定方法 |
| CN111154912B (zh) * | 2020-03-17 | 2022-07-22 | 河南中烟工业有限责任公司 | 一种烟叶的特异引物及烤后烟叶品种鉴定方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113122647B (zh) | 2024-06-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107604078B (zh) | 与绵羊羊毛纤维直径性状相关的分子标记及其特异性引物对和应用 | |
| CN112195264B (zh) | 一种鉴定番茄杂交种纯度的snp位点、引物组及应用 | |
| CN115725749A (zh) | 小鼠源细胞str检测试剂盒、方法及应用 | |
| CN107988413A (zh) | 一种鉴定黄瓜品种真实性的方法及其专用ssr引物组 | |
| CN113122647B (zh) | 一种基于荧光定量pcr技术的混合烟叶中红花大金元定量鉴定方法 | |
| CN113699220A (zh) | 一种以地域植物源鉴别蜂蜜及蜂蜜产地溯源的方法 | |
| CN114622028B (zh) | 检测转基因番木瓜的引物对组合、试剂盒及检测方法 | |
| CN113265481B (zh) | 石蒜属荧光est-ssr分子标记引物和鉴定石蒜属种间杂交种f1代的方法及其应用 | |
| CN114231651A (zh) | 一套适用于SSR-Seq技术的萝卜全基因组SSR核心引物组合及其应用 | |
| CN114032322A (zh) | 玉米花期基因的snp分子标记的开发及应用 | |
| CN113430276A (zh) | 一种基于coⅰ基因鉴别绵羊毛与山羊毛的方法 | |
| CN112251519A (zh) | 鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的特异性引物和探针、试剂盒及方法 | |
| CN114369678B (zh) | 一种检测甜菜转基因成分和转基因品系的引物组合、试剂盒、检测方法及应用 | |
| CN117925902B (zh) | 鉴别李氏重楼的方法、引物、探针及应用 | |
| CN114196782B (zh) | 一种检测番茄转基因成分和转基因品系的引物组合、试剂盒、检测方法及应用 | |
| CN114277178B (zh) | 一种检测油菜转基因成分的引物对组合、试剂盒、检测方法及应用 | |
| CN117925904B (zh) | 鉴别滇重楼遗传纯合个体的方法、引物、探针及应用 | |
| CN116179740B (zh) | 一种用于薏苡品种鉴定的ssr引物组合及其鉴定方法 | |
| CN114807407B (zh) | 一种检测大豆转基因品系的引物对组合、试剂盒及检测方法 | |
| CN108330202B (zh) | 鉴定水稻细胞质类型的方法 | |
| CN117106863B (zh) | 一种检测hek293细胞残留dna的方法 | |
| CN117757979B (zh) | 一种用于鉴定大豆品种的引物组、试剂盒及鉴定方法 | |
| CN102586459A (zh) | 采用复合est-ssr标记进行大白菜品种鉴定的方法 | |
| CN107012253A (zh) | 一种鉴定栽培燕麦母本的方法 | |
| CN109593872B (zh) | 一种利用毛细管电泳荧光ssr指纹图谱鉴别白蜡新品种青碧的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |