CN106834480B - 一种快速鉴定大量群体大葱细胞质育性的kasp标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速鉴定大量群体大葱细胞质育性的KASP标记及其应用，用于扩增所述标记的引物核苷酸序列如SEQ No.1、SEQ No.2和SEQ No.3所示。本发明只需提取大葱总DNA进行批量PCR扩增，然后进行读板即可，实验均由仪器操作完成，可以进行批量实验，节省了大量人力，而且特别适用于大量样本的操作。通过读板后的数据显示即可判断细胞质类型，分子标记鉴定结果与遗传分析结果完全一致。

Description

一种快速鉴定大量群体大葱细胞质育性的KASP标记及其应用
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，涉及一种快速鉴定大葱细胞质育性的KASP标记及其应用，特别适用于大量群体的细胞质育性鉴定。
背景技术
大葱(Allium fistulosum L.)是起源于中国的一种蔬菜作物，在中国、日本、韩国等国家广泛栽培。大葱是非常重要的香辛类蔬菜，是中国人日常生活中必不可少的蔬菜和调味品，其味辛、性温、生食或熟食皆宜，具有开胃消食、抗癌、抗肿瘤、保护心血管、降血压、提高人体免疫力和防止衰老等保健功能。然而，我国种植的大葱品种则以章丘大葱等地方品种以及日本进口品种为主。现有品种不能满足生产的需要，并存在着进口种子价格昂贵的问题。因此，我们必须培育出具有我国自主知识产权的大葱杂交种。
利用雄性不育特性培育和生产杂交种是保持品种特性、保证种子质量、降低种子成本最为有效的技术措施，因此蔬菜作物雄性不育的研究无论是在应用基础还是基础理论研究都是非常重要的热点。由于大葱是两年生蔬菜，传统方式选育大葱雄性不育系与保持系，具有费时、费工、效率低的问题，利用常规育种与分子标记辅助育种相结合能够有效地解决育种年限长，选择效率低的关键性环节。大葱雄性不育属于核质互作，只有细胞质和细胞核均不育时，才能表现为不育。大葱不育基因型只有一种，即S(sm1sm1sm2sm2)，而可育基因型很多，我们只选择基因型为N(sm1sm1sm2sm2)的大葱植株作为保持系。选择具有N型细胞质的大葱植株进行下一步的测交等试验，缩小筛选群体范围，减小工作量，提高选择效率。
在大葱细胞质雄性不育分子标记研究方面，已有相关报道。盖树鹏等以章丘大葱不育系与保持系为材料，对细胞质线粒体DNA进行了RAPD标记，获得了两个能够鉴定部分大葱品种细胞质类型的RAPD标记(盖树鹏，孟祥栋，徐丽娟.2004.大葱雄性不育分子标记辅助选择的研究.分子植物育种，2：223–228.；盖树鹏，孟祥栋.2004.大葱胞质雄性不育位点RAPD标记转化为SCAR标记的研究.莱阳农学院学报，21：189–192；WANG,C.,LI,H.Y.,ZHANG,L.Y.,PEI,Y.X.and WANG,Y.Q.2013.Identification of an AFLP marker andconversion to a SCAR marker to identify cytoplasmic male-sterile or normalcytoplasm in Welsh onion(Allium fistulosum L.).Journal of HorticulturalScience&Biotechnology,88,409–414.)。然而该标记是以线粒体DNA为材料，由于线粒体DNA的提取比较复杂，因此在实际应用上受到一定的限制。后来，本课题组开发了以大葱总DNA为模板的SCAR分子标记(高莉敏，董飞，霍雨猛，刘冰江，缪军，陈运起*，大葱细胞质雄性不育基因的SCAR标记开发，园艺学报，第40卷，第7期，1382-1388页，2013；高莉敏，陈运起，董飞，孔素萍，一种大葱细胞质雄性不育检测的试剂盒及其应用，中国，ZL201210348974.X；Li Min Gao,Yun Qi Chen,Yu Meng Huo,Fei Dong,Yan Yan Yang,Su Ping Kong,WeiChen and Xiong Wu*Development of SCAR markers to distinguish male-sterile andnormal cytoplasm in bunching onion(Allium fistulosum L.),Journal ofHorticultural Science&Biotechnology,2015,90(1):57-62.)，这些标记的开发与应用有效的避免了保持系筛选的盲目性，提高了选择效率。但是，这些标记均以PCR为基础，然后进行电泳来判断细胞质育性，虽然较田间鉴定快速的多，但是这些实验均需人工操作，实验室工作量也不小。一般的PCR仪只有96孔板，我们每次只能检测96个样品。对于大量样本检测来说，具有一定的局限性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速鉴定大量群体大葱细胞质育性的KASP标记及其应用，可用于辅助选育大葱雄性不育系和配套保持系，能够方便、快捷、准确的鉴定出细胞质的类型。
本发明一种鉴定大葱细胞质育性的KASP标记，用于扩增所述标记的引物核苷酸序列如序列表中SEQ No.1、SEQ No.2和SEQ No.3所示。
SEQ No.1(KASP-F)：
CTCTCGGTTTGGTCCTACTGATGAT
SEQ No.2(KASP-R1)：下划线部分为FAM荧光标签序列
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCCCCTCCCTTTTTCGTAACAAAT
SEQNo.3(KASP-R)：下划线部分为HEX荧光标签序列
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCCCCTCCCTTTTTCGTAACAAAA。
所述荧光标签序列还可以采用其他本领域通用的荧光标签序列。
本发明还提供一种利用上述标记进行大葱细胞质育性检测的方法，检测步骤包括：
a.提取被检测大葱的总DNA；
b.将样本从96孔板中通过Replikator转移至384孔板中，再最终转移至1536
孔板中，确保样本DNA终浓度约为10ng/ul；
c.将装有DNA的1536孔板置于65℃烘箱中干燥30min；
d.干燥后的DNA进行PCR体系构建，每个反应仅需1ul反应体系，包括10ng DNA,0.5μl KASP 2x Master Mix standard ROX(LCG Genomics,Teddington,Middlesex,UK,Beverly,MA,USA)and 0.014μl KASP-by-Design assay mix(LGC Genomics,Beverly,MA,USA)，ddH2O补至1μl；
e.将加好反应体系的孔板进行封膜，并低速快速离心；
f.离心后进行水浴PCR，反应程序包括94℃预变性15min；94℃变性20s，61-55℃退火1min(每一个循环降低0.6℃)，10个循环；94℃变性20s，55℃退火1min，26-29个循环；
g.将完成反应的孔板，吹干降温后在酶标仪Pherastar上进行读板。
h.检测出的不育细胞质位于图片的左上方，为红色标记(纯合T-atp6)，可育细胞质位于图片的右下方，为绿色(杂合atp6)和蓝色标记(纯合A-atp6)。由于绿色和蓝色均为可育细胞质类型，在实际检测中合并为一类，均显示蓝色。对5对大葱雄性不育系与保持系进行KASP标记验证，PCR结果与遗传分析结果一致，说明标记的有效性。
进一步，本发明还提供一种用于鉴定大葱细胞质育性的试剂盒，包括含有核苷酸序列如序列表中SEQ No.1、SEQ No.2和SEQ No.3所示的引物，还含有荧光探针及PCR体系构建所需试剂。
利用本发明可以对大量群体的大葱细胞质育性进行快速准确的判断，提高大葱保持系选育效率，对于建立大葱分子标记辅助育种技术体系具有重要意义。
本发明的有益效果为：
(1)快速准确：通过本发明，只需提取大葱总DNA进行批量PCR扩增，然后进行读板即可，这些实验均由仪器操作完成，可以进行批量实验，节省了大量人力，而且特别适用于大量样本的操作。通过读板后的数据显示即可判断细胞质类型。
(2)标记稳定：对已经育成的5对不育系及其保持系进行验证，其分子标记鉴定结果与遗传分析结果完全一致。且本发明仅需要一对引物即可完成检测，既高效又准确。
(3)和国际上最先进类似标记(Li Min Gao,Yun Qi Chen,Yu Meng Huo,FeiDong,Yan Yan Yang,Su Ping Kong,Wei Chen and Xiong Wu*Development of SCARmarkers to distinguish male-sterile and normal cytoplasm in bunching onion(Allium fistulosum L.),Journal of Horticultural Science&Biotechnology,2015,90(1):57-62.)相比，本标记的优点在于实验操作可以批量化、自动化、标准化，特别适用于大量群体的检测。
附图说明
图1为实施例1样本检测结果，左上方的红色圆点标记表示不育细胞质类型，右下方的绿色和蓝色圆点标记表示可育细胞质类型。
图2为实施例2KASP标记检测验证结果，左上方的红色圆点标记表示不育细胞质类型，右下方的蓝色圆点标记表示可育细胞质类型。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。下述实施例中所用的材料、试剂等，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1 KASP标记及检测方法的建立
根据GenBank数据库中大葱T-atp6(GenBank No.KR973431)以及A-atp6(GenBank(No.KR973430)基因序列，采用Primer Premier 5.0和Primer 3.0(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/input.htm)设计KASP标记引物，核苷酸序列如序列表中SEQ No.1、SEQ No.2和SEQ No.3所示：
SEQ No.1(KASP-F)：
CTCTCGGTTTGGTCCTACTGATGAT
SEQ No.2(KASP-R1)：下划线部分为FAM荧光标签序列
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCCCCTCCCTTTTTCGTAACAAAT
SEQNo.3(KASP-R)：下划线部分为HEX荧光标签序列
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCCCCTCCCTTTTTCGTAACAAAA
在本发明中，采用的荧光报告基团A为FAM，荧光报告基团B为HEX，荧光淬灭基团为BHQ。荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和探针B来自于KASP 2×Master Mix(LGC公司产品)。
大葱材料总DNA提取方法采用北京天根生化科技有限公司生产的快捷型植物基因组提取试剂盒，提取方法参照说明书。琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和质量。
用核苷酸序列如序列表中SEQ No.1、SEQ No.2和SEQ No.3所示的引物进行PCR反应。将样本从96孔板中通过Replikator转移至384孔板中，再最终转移至1536孔板中，确保样本DNA终浓度约为10ng/ul；将装有DNA的1536孔板置于65℃烘箱中干燥30min；干燥后的DNA进行PCR体系构建，每个反应仅需1ul反应体系，包括10ng DNA,0.5μl KASP 2x MasterMix standard ROX(LCG Genomics,Teddington,Middlesex,UK,Beverly,MA,USA)and0.014μl KASP-by-Design assay mix(LGC Genomics,Beverly,MA,USA)，ddH2O补至1μl。将加好反应体系的孔板进行封膜，并低速快速离心；离心后进行水浴PCR，反应程序包括94℃预变性15min；94℃变性20s，61-55℃退火1min(每一个循环降低0.6℃)，10个循环；94℃变性20s，55℃退火1min，26-29个循环。将完成反应的孔板，吹干降温后在酶标仪Pherastar上进行读板。检测结果如图1所示：位于左上方红色标记显示的为不育细胞质大葱材料，纯合T-atp6；位于图片的右下方，绿色和蓝色标记显示的是可育细胞质大葱材料：绿色的为杂合atp6，蓝色标记为纯合A-atp6，由于绿色和蓝色均为可育细胞质类型，在实际检测中合并为一类。
实施例2 KASP标记检测方法的验证
参试的大葱雄性不育系与保持系共5组：山东省农业科学院蔬菜花卉研究所选育的3组(980238A/B、980128A/B、200501A/B)，辽宁省农业科学院蔬菜研究所提供1组(244A/B)，河南省新乡市农业科学院提供1组(08-9A/B)。5个雄性不育系均为多代回交选育而成的稳定不育系，与其保持系核背景高度一致。
对上述已知细胞质育性的5对雄性不育系及其保持系进行KASP标记验证，所有S型细胞质材料检测结果均位于图谱的左上方，为红色标记；所有N型细胞质材料检测结果均位于图谱的右下方，为蓝色标记(如图2所示)。KASP检测结果与遗传分析结果一致，说明本发明所用引物及检测方法完全可以鉴别大葱细胞质类型。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省农业科学院蔬菜花卉研究所
<120> 一种快速鉴定大量群体大葱细胞质育性的KASP标记及其应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctctcggttt ggtcctactg atgat 25
<210> 2
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gaaggtgacc aagttcatgc tccccctccc tttttcgtaa caaat 45
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gaaggtcgga gtcaacggat tccccctccc tttttcgtaa caaaa 45

Claims (4)

1.一种快速鉴定大量群体大葱细胞质育性的KASP标记，其特征是，用于扩增所述标记的引物核苷酸序列包括KASP-F、KASP-R1和KASP-R，KASP-F如SEQ.No.1所示，KASP-R1 如SEQ.No.2所示，KASP-R如SEQ.No.3所示。
2.权利要求1所述的快速鉴定大量群体大葱细胞质育性的KASP标记在检测大葱细胞质育性中的应用。
3.一种采用权利要求1所述的标记进行大葱细胞质育性检测的方法，其特征在于，检测步骤包括：
a．提取被检测大葱的总DNA；
b．将样本从96孔板中转移至384孔板中，再最终转移至1536孔板中，确保样本DNA终浓度为10ng/ul；
c．将装有DNA的1536孔板置于65℃烘箱中干燥30min；
d．干燥后的DNA进行PCR体系构建，每个反应1ul反应体系，包括10 ng DNA、0.5 μlKASP 2x Master Mix standard ROX 、0.014 μl KASP-by-Design assay mix 、ddH2O补至1μl；用核苷酸序列如序列表中SEQ No.1、SEQ No.2和SEQ No.3所示的引物进行PCR反应；
e．将加好反应体系的孔板进行封膜，并低速快速离心；
f．离心后进行水浴PCR，反应程序包括94℃预变性15 min；94℃变性20 s，61-55℃ 退火 1 min ，每一个循环降低0.6℃， 10个循环；94℃变性20 s， 55℃ 退火 1 min，26-29个循环；
将完成反应的孔板，吹干降温后在酶标仪Pherastar上进行读板，即可分辨出待检测大葱样品的细胞质育性。
4.一种用于快速鉴定大量群体大葱细胞质育性的试剂盒，其特征是，包括核苷酸序列如序列表中SEQ No.1、SEQ No.2和SEQ No.3所示的引物，及荧光探针、PCR体系构建所需试剂。
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