CN104946633B - 一种鉴定大葱细胞质育性的dCAPS标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种鉴定大葱细胞质育性的dCAPS标记及其应用，采用本发明dCAPS标记鉴定大葱细胞质类型时，在N型细胞质大葱上有两条扩增条带，在S型细胞质大葱上只有一条扩增条带，能够方便、快捷、准确的鉴定出细胞质的类型。可用于辅助选育大葱雄性不育系和配套保持系。

Description

一种鉴定大葱细胞质育性的dCAPS标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域，特别涉及一种鉴定大葱细胞质育性的dCAPS标记及其应用。

背景技术

大葱(Allium fistulosum L.)是起源于中国的一种蔬菜作物，在中国、日本、韩国等国家广泛栽培。大葱是非常重要的香辛类蔬菜，是中国人日常生活中必不可少的蔬菜和调味品，其味辛、性温、生食或熟食皆宜，具有开胃消食、抗癌、抗肿瘤、保护心血管、降血压、提高人体免疫力和防止衰老等保健功能。然而，我国种植的大葱品种则以章丘大葱等地方品种以及日本进口品种为主。现有品种不能满足生产的需要，并存在着进口种子价格昂贵的问题。因此，我们必须培育出具有我国自主知识产权的大葱杂交种。

利用雄性不育特性培育和生产杂交种是保持品种特性、保证种子质量、降低种子成本最为有效的技术措施，因此蔬菜作物雄性不育的研究无论是在应用基础还是基础理论研究都是非常重要的热点。由于大葱是两年生蔬菜，传统方式选育大葱雄性不育系与保持系，具有费时、费工、效率低的问题，利用常规育种与分子标记辅助育种相结合能够有效地解决育种年限长，选择效率低的关键性环节。大葱雄性不育属于核质互作，只有细胞质和细胞核均不育时，才能表现为不育。大葱不育基因型只有一种，即S(sm1sm1sm2sm2)，而可育基因型很多，我们只选择基因型为N(sm1sm1sm2sm2)的大葱植株作为保持系。选择具有N型细胞质的大葱植株进行下一步的测交等试验，缩小筛选群体范围，减小工作量，提高选择效率。

在大葱细胞质雄性不育分子标记研究方面，已有相关报道。盖树鹏等以章丘大葱不育系与保持系为材料，对细胞质线粒体DNA进行了RAPD标记，获得了两个能够鉴定部分大葱品种细胞质类型的RAPD标记(盖树鹏，孟祥栋，徐丽娟.2004.大葱雄性不育分子标记辅助选择的研究.分子植物育种，2：223–228.；盖树鹏，孟祥栋.2004.大葱胞质雄性不育位点RAPD标记转化为SCAR标记的研究.莱阳农学院学报，21：189–192；WANG,C.,LI,H.Y.,ZHANG,L.Y.,PEI,Y.X.and WANG,Y.Q.2013.Identification of an AFLP marker andconversion to a SCAR marker to identify cytoplasmic male-sterile or normalcytoplasm in Welsh onion(Allium fistulosum L.).Journal of HorticulturalScience&Biotechnology,88,409–414.)。然而该标记是以线粒体DNA为材料，由于线粒体DNA的提取比较复杂，因此在实际应用上受到一定的限制。后来，本课题组开发了以大葱总DNA为模板SCAR分子标记(高莉敏，董飞，霍雨猛，刘冰江，缪军，陈运起*，大葱细胞质雄性不育基因的SCAR标记开发，园艺学报，第40卷，第7期，1382-1388页，2013；高莉敏，陈运起，董飞，孔素萍，一种大葱细胞质雄性不育检测的试剂盒及其应用，中国，ZL201210348974.X)，这些标记的开发与应用有效的避免了保持系筛选的盲目性，提高了选择效率。但是，这些标记均为大葱细胞质雄性不育S型细胞质的特异标记，在N型可育细胞质上没有扩增条带，致使在应用时有一定的局限性。后来，本课题组开发了鉴定大葱细胞质S和N的SCAR标记(LiMin Gao,Yun Qi Chen,Yu Meng Huo,Fei Dong,Yan Yan Yang,Su Ping Kong,Wei Chenand Xiong Wu*Development of SCAR markers to distinguish male-sterile andnormal cytoplasm in bunching onion(Allium fistulosum L.),Journal ofHorticultural Science&Biotechnology,2015,90(1):57-62.)，此标记能够在N型细胞质上扩增出1412bp片段，S型细胞质上扩增出327bp片段。但是，此标记在每个样本中只扩增出一条带，在鉴定细胞质类型时，如果没有点Marker，就无从知道扩增出来的单一条带是1412bp还是327bp，也无法判断是S型细胞质还是N型细胞质。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鉴定大葱细胞质育性的dCAPS标记及其应用，可用于辅助选育大葱雄性不育系和配套保持系，能够方便、快捷、准确的鉴定出细胞质的类型。

本发明一种鉴定大葱细胞质育性的dCAPS标记，用于扩增所述标记的引物的核苷酸序列如序列表中SEQ No.1和SEQ No.2所示。所扩增的标记片段在S型细胞质大葱中为201bp，序列如SEQ No.3所示；在N型细胞质大葱中为201bp，序列如SEQ No.3所示；和172bp，序列如SEQ No.4所示。

本发明还提供一种利用上述标记进行大葱细胞质育性检测的方法，检测步骤包括：

a.提取被检测大葱的总DNA；

b.以被检测的大葱的总DNA作为模板进行PCR扩增反应，得到扩增产物，PCR扩增反应引物的核苷酸序列如序列表中SEQ No.1和SEQ No.2所示；

c.对PCR扩增产物用限制性内切酶MseI进行酶切；

d.判断所述的酶切产物中条带数量，是一条带还是两条带，即可分辨大葱的细胞质类型。

上述b步骤中PCR扩增反应的体系为20μl，包括有：

2×Pfu MasterMix 10μl

核苷酸序列如序列表中SEQ No.1所示的上游引物：1μl

核苷酸序列如序列表中SEQ No.2所示的下游引物：1μl

待检测样品DNA 50ng

ddH₂O补至20μl。

PCR扩增反应的程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸3min，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

上述c步骤中酶切反应的体系为30μl，包括有：

10×FastDigest Buffer 2μl

FastDigest enzyme 1μl

PCR反应产物10μl

ddH₂O补至30μl；

酶切反应条件为37℃孵化1h。

进一步，本发明还提供一种用于鉴定大葱细胞质育性的试剂盒，包括含有核苷酸序列如序列表中SEQ No.1和SEQ No.2所示的引物，及PCR扩增、酶切反应所需要的试剂。

利用本发明的标记可以对大葱育性进行快速准确的判断，提高大葱保持系选育效率，对于建立大葱分子标记辅助育种技术体系具有重要意义。

本发明的有益效果为：

(1)快速准确：通过本发明，只需提取大葱总DNA进行PCR扩增，酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，即可有效的鉴定细胞质的类型，实现筛选保持系的第一步，快速寻找N型细胞质的大葱植株。

(2)标记稳定：对已经育成的5份不育系与保持系以及4份杂交种进行验证，其分子标记鉴定结果与遗传分析结果完全一致。

(3)和国际上最先进类似标记(Li Min Gao,Yun Qi Chen,Yu Meng Huo,FeiDong,Yan Yan Yang,Su Ping Kong,Wei Chen and Xiong Wu*Development of SCARmarkers to distinguish male‐sterile and normal cytoplasm in bunching onion(Allium fistulosum L.),Journal of Horticultural Science&Biotechnology,2015,90(1):57‐62.)相比，本标记的优点在于琼脂糖凝胶电泳时，N型细胞质上有两条带，S型细胞质上只有一条带，即使没有Marker，不知道这两条带的大小，也可以很方便快捷的鉴定大葱细胞质类型。

附图说明

图1为5组大葱雄性不育系与保持系的细胞质育性检测结果

其中：M为DM2000的Marker，1、3、5、7、9为S型不育细胞质，2、4、6、8、10为N型可育细胞质。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

实施例1dCAPS标记及检测方法的建立

根据GenBank数据库中大葱atp6假基因序列(GenBank AccessionNo.JQ283733.1)，采用Primer Premier 5.0和Primer 3.0(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/input.htm)分别设计atp6假基因序列内引物和TAIL-PCR的3′和5′引物，经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，获得用于扩增dCAPS标记的引物，核苷酸序列如序列表中SEQ No.1和SEQ No.2所示：

正向引物：5′-ATGAGTGCTGAAAGGAGGAAAG-3′(SEQ No.1)；

反向引物：5′-TGACTTTCCCCCTCCCTTTTTCGTAACAAT-3′(SEQ No.2)。在N型细胞质的扩增片段中具有限制性内切酶Mse I酶切位点，由北京博尚生物技术有限公司合成，PAGE纯化。

参试的大葱雄性不育系与保持系共5组：山东省农业科学院蔬菜花卉研究所选育的3组(980238A/B、980128A/B、200501A/B)，辽宁省农业科学院蔬菜研究所提供1组(244A/B)，河南省新乡市农业科学院提供1组(08-9A/B)。5个雄性不育系均为多代回交选育而成的稳定不育系,与其保持系核背景高度一致。

大葱材料总DNA提取方法采用北京天根生化科技有限公司生产的快捷型植物基因组提取试剂盒，提取方法参照说明书。琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和质量。

用核苷酸序列如序列表中SEQ No.1和SEQ No.2所示的引物进行PCR反应，PCR反应均在Bio-Rad公司生产的TC-XP-D型基因扩增仪上进行，目的片段的获得采用2×PfuMasterMix(北京康为世纪生物科技有限公司)，TAIL-PCR采用20μL的反应体系中，2×PfuMasterMix 10μL，两条引物(10μmol·L^-1)各1.0μL，样品DNA 50ng；反应程序为，94℃预变性2min，94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸3min，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。然后对PCR产物进行限制性内切酶Mse I酶切1小时，酶切反应的体系：10×FastDigestBuffer 2μl，FastDigest enzyme 1μl，PCR反应产物10μl，ddH₂O补至30μl。利用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统自动成像，结果如图1所示。1、3、5、7、9有一条201bp(SEQNo.3)扩增条带，为S型不育细胞质，2、4、6、8、10有201bp(SEQ No.3)和172bp(SEQ No.4)的两条扩增条带，为N型可育细胞质。若去掉左边的Marker或者在只有一个样本的情况下，我们一样可以清晰地分辨出两条带的是N型细胞质。

实施例2dCAPS标记检测方法的验证

对已知细胞质育性的14份材料进行PCR验证(见表1)，所有的S型细胞质材料中只有一条片段，N型细胞质材料中有两条片段，PCR结果与遗传分析结果一致，说明本发明所用引物及检测方法完全可以鉴别大葱细胞质类型。

表1大葱不同材料细胞质类型单株验证结果

注：980238A与200501A等凡是在编号后带有A字母的，均为不育系，其细胞质类型为S型细胞质，即不育细胞质类型；980238B与200501B等凡是在编号后带有B字母的，均为不育系，其细胞质类型为N型细胞质，即可育细胞质类型。RSxZQ(F1)、RSxLY(F1)、RSxDZ(F1)、RSxRB(F1)为杂交种，其细胞质类型为S。

Claims (4)

1.一种大葱细胞质育性检测的方法，其特征在于，检测步骤包括：

a.提取被检测大葱的总DNA；

b.以被检测的大葱的总DNA作为模板进行PCR扩增反应，得到扩增产物，PCR扩增反应的引物核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；

c.对PCR产物进行限制性内切酶Mse I酶切；

d.判断所述的酶切产物中条带数量，是一条带还是两条带，即可分辨大葱的细胞质类型。

2.如权利要求1所述大葱细胞质育性检测的方法，其特征在于：b步骤中PCR扩增反应的体系为20μl，包括有：

2×Pfu MasterMix 10μl

核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示的上游引物：1μl

核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示的下游引物：1μl

待检测样品DNA 50ng

ddH₂O补至20μl；

PCR扩增反应的程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸3min，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

3.如权利要求1所述大葱细胞质育性检测的方法，其特征在于：c步骤中酶切反应的体系为30μl，包括有：

10×FastDigest Buffer 2μl

FastDigest enzyme 1μl

PCR反应产物10μl

ddH₂O补至30μl；

酶切反应条件为37℃孵化1h。

4.一种用于鉴定大葱细胞质育性的试剂盒，其特征在于，包括核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物，及PCR扩增、酶切反应所需要的试剂；所述酶为内切酶Mse I。