CN106868135B - 一种鉴定大豆雄性不育系的引物及其方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，提供了一种鉴定大豆雄性不育系的引物及其方法，所述引物如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示，所述方法包括：以大豆基因组DNA为模板，利用所述引物进行PCR扩增和BstXI酶切后，若产物仅含一条472bp的条带，则为雄性不育系，若包含266bp和202bp，则为雄性可育系；本发明在发现大豆雄性不育性状受到一对隐形单基因控制的基础上，开发了一种鉴定大豆雄性不育系的共显性分子标记，并提供了鉴定大豆雄性不育系的引物及其方法，该引物和方法可以在大豆育种过程中的任何时期对大豆育性及其基因型进行高效准确的鉴定，为大豆雄性不育系的分子鉴定提供了新的途径。
Description
技术领域
本发明涉及的是基因工程技术领域，尤其涉及的是一种鉴定大豆雄性不育系的引物及其方法。
背景技术
常规杂交是大豆育种中最常用的方法，但是这种方法主张优中选优，亲本之一常为当地的优良品种，长期以往，生产上使用的品种的亲缘就会十分接近，必然导致遗传基础趋于单一化，因此对实现优质、高产、多抗并且遗传基础广泛的高标准育种目标已显得力所不及。于是人们逐步重视利用轮回选择进行群体改良，以解决常规杂交存在的遗传基础狭窄的问题。
大豆作为自花授粉作物，其花器小、杂交困难且成活率太低，导致利用轮回选择法改良大豆品种的难度较大。自20世纪至今，在大豆上陆续发现了一些雄性不育材料，利用其作为母本进行杂交，既省去了人工去雄，降低了生产成本，还能得到大量纯净优质的杂交种，为轮回选择在大豆群体改良中的应用开辟了广阔前景。
大豆核雄性不育分为三种类型：第一类为雄性不育但是雌性可育，这类突变无雄性生殖功能而雌性生殖功能不受影响或影响很小。大豆雄性不育研究最多且被广泛利用的是隐性单基因控制的雄性不育雌性可育系列。第二类为雄性不育且雌性也不育，此类不育很难在遗传育种中应用，没有实际意义。第三类为大豆质核互作雄性不育，最早是Davis通过栽培大豆间杂交获得了首例大豆质核互作的雄性不育系，20世纪90年代孙寰等报道了中国创造的第一个细胞质雄性不育系，现在国内已经相继成功选育了十多个质核互作雄性不育系并实现了三系配套。
目前常利用的大豆雄性不育雌性可育材料，用昆虫传粉代替了复杂的人工授粉，使得轮回选择在大豆中得以利用。我国大豆轮回选择起步较晚，所见报的极少。南京农业大学宋启建等利用大豆雄性不育基因材料与40个亲本合成了我国第一个高产、高蛋白含量基础轮回群体。
大豆雄性不育的鉴定方法目前主要依赖于表型鉴定，在大豆生长早期很难进行准确鉴定。而如果在分子水平可以鉴定出来，无疑是最高效准确的方法，但是目前针对大豆雄性不育的分子标记技术的有效专利很少，本发明正是针对这个方面的研究成果。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种鉴定大豆雄性不育系的引物及其方法，以提供一种新的针对大豆雄性不育的分子标记及大豆雄性不育系的分子鉴定方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种检测大豆雄性不育系的引物，所述引物序列为：
SEQ ID NO.1：上游引物：ATCATCTCACTCTGCGTGTA
SEQ ID NO.2：下游引物：CCATCCTTTCCCTACCTT
本发明还提供了一种鉴定大豆雄性不育系的方法，包括以下步骤：
(1)提取大豆植株组织DNA；
(2)以大豆植株组织DNA为模板，利用如权利要求1所述的引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
(3)将PCR扩增产物用限制性内切酶BstXI进行酶切，若酶切产物仅含一条472bp的条带，则对应的大豆植株为雄性不育植株，若酶切产物包含266bp和202bp，则对应的大豆植株为雄性可育植株。
进一步地，所述步骤(3)中，若酶切产物仅包含266bp和202bp的条带，则为纯合雄性可育植株，若酶切产物包含472bp、266bp和202bp三条带，则为杂合雄性可育植株，若酶切产物仅有472bp，则为纯合不育植株。
本发明相比现有技术具有以下优点：本发明在发现大豆雄性不育性状受到一对隐形单基因控制的基础上，提供了一种鉴定大豆雄性不育系的引物及其方法，该引物和方法可以在大豆育种过程中的任何时期对大豆育性及其基因型(纯和、杂合)进行高效准确的鉴定，为大豆雄性不育系的分子鉴定提供了一种新的方法。
附图说明
图1为酶切产物琼脂糖凝胶电泳结果，其中，条带1-13为不育材料育性基因酶切结果，条带A-C为纯合基因型可育材料酶切结果，条带D、E为杂合基因型可育材料酶切结果，条带S为不育对照酶切结果，条带F为可育对照酶切结果，Marker为5K。
具体实施方式
实施例1
1、材料
本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
2、方法
2.1提取大豆DNA
以田间杂交得到的杂合可育大豆种植来的发生性状分离的F2代材料作为待测样品，以雄性不育系大豆植株的不育肉荚作为不育对照，取雄性可育系大豆植株的可育豆粒作为可育对照，利用CTAB法或SDS法提取待测样品、不育对照和可育对照的DNA。
2.2 PCR扩增
设计特异性扩增引物，并进行PCR扩增，所述特异性扩增引物如SEQ ID NO.1，SEQID NO.2所示：
SEQ ID NO.1：上游引物：ATCATCTCACTCTGCGTGTA
SEQ ID NO.2：下游引物：CCATCCTTTCCCTACCTT
利用TOYOBO公司的KOD FX Neo酶进行PCR扩增，扩增体系为25ul，具/体为：
ddH2O：3.3ul
2×PCR Buffer for KOD FX Neo：13ul
2mM dNTPs:5ul
上游引物F:0.6ul
下游引物R:0.6ul
KOD FX Neo酶:0.5ul
GENE DNA：2ul
PCR扩增条件为：94℃预变性2min，98℃变性10s，59℃退火30s，68℃延伸30s，35个循环，获得扩增产物，置于4℃储存备用。
PCR产物经1％质量比的琼脂糖凝胶电泳检测，发现有长度约为500bp左右的条带，与预测的472bp大小一致，将PCR扩增产物回收后，送去上海生工测序，结果与预测结果一致。
2.3酶切验证
将PCR产物用限制性内切酶BstXI进行酶切，酶切体系为20ul，具体为：
PCR产物：17ul
NEB Buffer：2ul
BstXI内切酶：1ul
获得的酶切产物用1％质量比的琼脂糖凝胶电泳进行验证。
2.4结果
结果如图1所示，图中，不育对照(泳道S)的酶切产物仅有一条500bp左右的条带，而可育对照(泳道F)的酶切产物包含两条250bp左右的条带，泳道1-13为纯合不育系植株，泳道A-C为纯合可育系植株，泳道D-E为杂合可育植株，与实际结果一致。
以上为本发明一种详细的实施方式和具体的操作过程，是以本发明技术方案为前提下进行实施，但本发明的保护范围不限于上述的实施例。
SEQUENCE LISTING
<110> 安徽农业大学
<120> 一种鉴定大豆雄性不育系的引物及其方法
<130> /
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atcatctcac tctgcgtgta 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccatcctttc cctacctt 18
Claims (3)
1.一种检测大豆雄性不育系的引物，其特征在于，所述引物序列为：
SEQ ID NO.1：上游引物：ATCATCTCACTCTGCGTGTA
SEQ ID NO.2：下游引物：CCATCCTTTCCCTACCTT。
2.一种鉴定大豆雄性不育系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取大豆植株组织DNA；
(2)以大豆植株组织DNA为模板，利用如权利要求1所述的引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
(3)将PCR扩增产物用限制性内切酶BstXI进行酶切，若酶切产物仅含一条472bp的条带，则对应的大豆植株为雄性不育植株，若酶切产物包含266bp和202bp，则对应的大豆植株为雄性可育植株。
3.根据权利要求2所述的一种鉴定大豆雄性不育系的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，若酶切产物仅包含266bp和202bp的条带，则为纯合雄性可育植株，若酶切产物包含472bp、266bp和202bp三条带，则为杂合雄性可育植株，若酶切产物仅有472bp，则为纯合不育植株。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20230615 Address after: Building A12, Phase II, Industrial Investment Liheng Industrial Plaza, intersection of Fanhua Avenue and Chuangxin Avenue, Economic Development Zone, Feixi County, Hefei City, Anhui Province, 230000 Patentee after: Anhui Douyue Agricultural Technology Co.,Ltd. Address before: 230036 No. 130 Changjiang West Road, Hefei, Anhui Patentee before: Anhui Agricultural University |
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| TR01 | Transfer of patent right |