CN111676309B - 一种鉴定细胞核雄性不育系ms6基因型的分子标记及其鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定细胞核雄性不育系ms6基因型的分子标记及其鉴定方法，鉴定细胞核雄性不育系ms6(包括T295H及其衍生系)基因型的分子标记，包括特异性引物序列，一对所述特异性引物序列为：上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2；鉴定方法，包括如下步骤：以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为引物，以待检测基因组DNA为模板进行PCR扩增，以MseI对扩增产物进行酶切，PCR产物和酶切产物再进行琼脂糖凝胶电泳分离检测；野生型可以被切开变成99bp，不育系不能被切开为129bp；杂合子会有两条带，且99bp的小条带会比不能被切开的129bp的大条带弱。测试可以在大豆任何发育时期进行，为细胞核雄性不育系ms6的分子鉴定提供了操作简单、准确高效的新方法。
Description
技术领域
本发明属于基因型的分子标记技术领域，具体涉及一种鉴定细胞核雄性不育系ms6基因型的分子标记及其鉴定方法。
背景技术
大豆是我国重要的粮食作物，为人类提供丰富的蛋白质。但是由于大豆的种植单产较低，面积较少，导致总产量较低，大量依赖进口。因此选育大豆高产品种、提高大豆种植产量是目前育种工作中亟待解决的问题。品种选育中轮回选择的方法可以进行群体改良。由于大豆是自花授粉作物，花器官较小，人工去雄和授粉相对困难导致使用常规品种进行轮回群体的构建相对困难。雄性不育系的发现解决了人工去雄的问题，虫媒传粉解决了人工授粉的难题。因此育种工作中常应用雄性不育系来构建轮回群体进行作物遗传改良。
目前雄性不育系的鉴定方法主要是在花期对花药进行碘染进一步通过镜检来判断。前人的研究表明细胞核雄性不育系ms6的不育位点和白花性状有一定的连锁关系，因此在对不育系进行鉴定时可以利用ms6不育位点和花色的连锁关系进行判断。虽然ms6不育位点和白花性状有一定的连锁关系，但还是会出现一定程度上的交换而导致的不连锁，因此单纯通过幼苗时期茎秆颜色或者花色来对ms6的不育位点进行鉴定不够准确，为此，我们提出一种鉴定细胞核雄性不育系ms6基因型的分子标记及其鉴定方法，以解决上述背景技术中提到的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鉴定细胞核雄性不育系ms6基因型的分子标记及其鉴定方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种鉴定细胞核雄性不育系T295H(ms6)基因型的分子标记及其鉴定方法，细胞核雄性不育系ms6包括T295H及其衍生系，鉴定细胞核雄性不育系ms6基因型的分子标记，包括特异性引物序列，一对所述特异性引物序列为：上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2；
鉴定方法，包括如下步骤：
以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为引物，以待检测基因组DNA为模板进行PCR扩增，以MseI对扩增产物进行酶切，PCR产物和酶切产物再进行琼脂糖凝胶电泳分离检测；
野生型可以被切开变成99bp，不育系不能被切开为129bp；
杂合子会有两条带，且99bp的小条带会比不能被切开的129bp的大条带弱。
优化的PCR扩增的反应体系为：20-100ng的待测大豆基因组DNA、5U/μL的r-Taq酶0.2μL、10μmol/L的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2各0.5μL、2.5mmol/L的dNTP 2μL、10×PCR的Mg2+Plus缓冲液2μL以及无菌蒸馏水补至20μL；
PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min，随后94℃变性30sec,54℃条件下退火30sec,72℃延伸30sec，进行34个循环；最后72℃延伸5min；在4℃下保存；
酶切的反应体系为：5μLPCR产物、1μL CutSmart Buffer、10U/μl的MseI 0.1μL、补水至10μL；
酶切反应时间为：37℃，酶切1h。
优化的PCR产物和酶切产物再进行琼脂糖凝胶电泳分离检测指的是：将每个样品对应的5μL扩增产物和10μL酶切产物分别在含EB的3％的琼脂糖凝胶中电泳分离，比较酶切前后带型变化，若酶切前后条带大小不变为129bp的单一条带，则说明待测样本是ms6突变体；若酶切后条带为99bp的小条带，则说明待测样本是野生型；若酶切后为99bp和129bp的两条带，且小条带亮度比大条带亮度弱，则说明待测样本为ms6杂合子。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供的一种鉴定细胞核雄性不育系ms6基因型的分子标记及其鉴定方法，可以在任何时期对雄性不育突变体ms6的基因型进行高效准确的鉴定，为细胞核雄性不育系ms6的分子鉴定提供了新方法，具有操作简单、准确高效的优势，细胞核雄性不育系ms6包括T295H及其衍生系。
附图说明
图1为本发明利用琼脂糖电泳检测ms6的基因型的检测结果图。
图中：M：分子量标准DL2000；1-8为待测样本，两个相邻的泳道依次待测样本经MseI酶切前和酶切后的条带；经检测样本2、3、8是ms6突变体；1、4、7是ms6杂合子；5、6是野生型。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明提供了一种鉴定细胞核雄性不育系ms6基因型的分子标记及其鉴定方法：细胞核雄性不育系ms6包括T295H及其衍生系；
引物(委托上海生工生物科技有限公司合成)：
上游引物SEQ ID NO.1
5’-ggctcttttcttgaacttgtttgc-3’，
下游引物SEQ ID NO.2：
5’-ccaattagatcttcttcttgggg-3’。
材料：细胞核雄性不育系待测材料T295H。
检测方法：
以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为引物，以待测大豆基因组DNA为模板进行进行PCR扩增，PCR反应体系为：20-100ng的DNA，5U/μL的Taq酶0.1μL，10μmol/L的SEQ ID NO.1和SEQID NO.2各0.5μL，2.5mmol/L的dNTP 2μL，10×PCR的Mg2+Plus缓冲液2μL，然后用无菌蒸馏水补充反应体系至20μL；将反应体系在94℃预变性5min，随后94℃变性30sec,54℃条件下退火30sec,72℃延伸30sec，进行34个循环；最后72℃延伸5min；在4℃下保存。
酶切反应条件为：5μL PCR产物,1μLCutSmart Buffer,10U/μl的MseI0.1μL补水至10μL。37℃酶切1h。
每个样本分别取5μL扩增产物和全部10μL酶切产物，在3％的含EB染料的琼脂糖凝胶中电泳分离，获得的检测结果如图1。
结果：通过SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2对基因组DNA进行PCR扩增，并通过MseI对扩增产物进行酶切，通过琼脂糖电泳对酶切前后的产物大小进行检测。以酶切前后产物的条带大小是否发生变化来对待测植株的育性进行判断，若酶切前后条带大小不变为129bp，则待测植株为ms6雄性不育系；若酶切后条带大小变小为99bp，则待测植株为可育株；若酶切后为两条带且小条带亮度比大条带亮度弱，则待测植株为ms6杂合子。我们通过对花期检测测植株进行镜检可以看出此方法鉴定的样本2、3、8为不育株，确实是不能产生花粉的ms6。而通过对检测为杂合子和野生型的植株后代的育性进行统计，可以确认样本5、6是野生型和样本1、4、7是杂合子的检测结果也都正确。因此我们认为用本发明所述的方法和应用进行ms6基因型鉴定具有操作简单、准确高效的优势。
序列表
<110>西北大学
<120>一种鉴定细胞核雄性不育系ms6基因型的分子标记及其鉴定方法
<130>20200505
<160>2
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
ggctcttttcttgaacttgtttgc20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
ccaattagatcttcttcttgggg20
综上所述，与现有技术相比，本发明可以在任何时期对雄性不育突变体ms6的基因型进行高效准确的鉴定，为细胞核雄性不育系ms6的分子鉴定提供了新方法，具有操作简单、准确高效的优势。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施案例而已，并不用于限制本发明的技术参数。尽管参照前述实施案例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施案例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种鉴定细胞核雄性不育系ms6基因型分子标记的特异性引物序列，其特征在于，其特异性引物序列为上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2。
2.一种鉴定细胞核雄性不育系ms6基因型的方法，其特征在于，包括如下步骤：
以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为引物，以待检测基因组DNA为模板进行PCR扩增，以MseI对扩增产物进行酶切，PCR产物和酶切产物再进行琼脂糖凝胶电泳分离检测；
野生型可以被切开变成99bp，不育系不能被切开为129bp；
杂合子会有两条带，且99bp的小条带会比不能被切开的129bp的大条带弱。
3.根据权利要求2所述的一种鉴定细胞核雄性不育系ms6基因型的方法，其特征在于：
PCR扩增的反应体系为：20-100ng的待测大豆基因组DNA、5U/μL的r-Taq酶0.2μL、10μmol/L的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2各0.5μL、2.5mmol/L的dNTP 2μL、10×PCR的Mg2+Plus缓冲液2μL以及无菌蒸馏水补至20μL；
PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min，随后94℃变性30sec,54℃条件下退火30sec,72℃延伸30sec，进行34个循环；最后72℃延伸5min；在4℃下保存；
酶切的反应体系为：5μL PCR产物、1μL CutSmart Buffer、10U/μl的MseI 0.1μL、补水至10μL；
酶切反应时间为：37℃，酶切1h。
4.根据权利要求2所述的一种鉴定细胞核雄性不育系ms6基因型的方法，其特征在于：PCR产物和酶切产物再进行琼脂糖凝胶电泳分离检测指的是：将每个样品对应的5μL扩增产物和10μL酶切产物分别在含EB的3％的琼脂糖凝胶中电泳分离，比较酶切前后带型变化，若酶切前后条带大小不变为129bp的单一条带，则说明待测样本是ms6突变体；若酶切后条带为99bp的小条带，则说明待测样本是野生型；若酶切后为99bp和129bp的两条带，且小条带亮度比大条带亮度弱，则说明待测样本为ms6杂合子。
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