CN104131012B - 一种鉴定大豆细胞核雄性不育系的分子标记及其鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定大豆细胞核雄性不育系的分子标记及其鉴定方法，该分子标记具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，该鉴定方法以大豆植物组织基因组DNA为模板，所述分子标记为目的基因，进行PCR扩增，获得扩增片段，用以判断大豆细胞核的育性；该方法提供了一种新的大豆细胞核雄性不育系的鉴定途径，适合于大豆细胞核雄性不育系的早期鉴定，还提供了一对具有如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的特异性引物，该引物获得的扩增片段长度适中，与降解的小片段序列差异明显，避免了假阳性结果的出现，同时电泳条带清晰、亮度高，鉴定结果一目了然，大豆细胞核雄性不育系的检出率高。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种大豆的分子标记技术领域，尤其涉及的是一种鉴定大豆细胞核雄性不育系的分子标记及其鉴定方法。
背景技术
雄性不育系是作物杂种优势利用的极好材料，具有重要的理论价值和实际应用价值，其研究成果可为应用基因工程手段创新、改良不育系，解决育性稳定等问题提供有理的理论依据。1993年吉林省农科院孙寰等发现世界上第一个大豆细胞质雄性不育系，目前，我国已实现了大豆的“三系”配套栽培，并对大豆的遗传规律进行了深入的研究。大豆细胞质雄性不育“三系”包括不育系、保持系和恢复系构成，不育系做母本与恢复系父本杂交，可获得杂交种。其中，保持系和恢复系由于自身可育，种子可由自交繁殖获得，而不育系只能通过其作为母本，与同型的保持系父本杂交获得种子。在田间繁殖过程中，常常由于田间种植、收获脱粒等环节造成不育系中混杂保持系的后果，导致收获的杂交种总因混入了不育系而导致纯度下降，这样的种子在生产上种植，必然导致减产，因此，大豆雄性不育系的早期鉴定显得尤为重要。
中国专利文献“一种分子标记鉴定大豆细胞质雄性不育系种子纯度的方法”(CN103160599A)提供了一种利用分子标记法鉴定大豆RN型细胞质雄性不育系的方法，该方法以大豆RN型细胞质雄性不育系种子的基因组DNA为模板进行PCR扩增，其中扩增后的不育系片段长度为200bp，保持系扩增后的片段长度为212bp，最终通过片段长度差异将不育系和保持系区分开，但该发明中，不育系和保持系扩增后的片段长度差异只有12bp，利用常规的凝胶电泳并不能非常准确地将两者区分开来；此外，由于此方法针对的是大豆细胞质不育系，目前尚无关于大豆细胞核雄性不育分子鉴定的有效方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种鉴定大豆细胞核雄性不育系的分子标记及其鉴定方法，以提供一种简单精确的大豆细胞核雄性不育系的分子鉴定方法。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤：
一种鉴定大豆细胞核雄性不育系的分子标记，所述分子标记具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
一种利用上述分子标记鉴定大豆细胞核雄性不育系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取大豆植物组织基因组DNA，以所述分子标记的核苷酸序列为模板设计引物，进行PCR扩增，获得扩增片段；
(2)若上述步骤(1)中能够获得所述分子标记的核苷酸序列，则上述步骤(1)的大豆为细胞核雄性不育系大豆；若不能，则为细胞核雄性可育系大豆。
优选地，所述步骤(1)中，引物的核苷酸序列为：
上游引物：SEQ ID NO：2：5’GTTAGGTGGGTAGGTGAG 3’；
下游引物：SEQ ID NO：3：5’ACATAGTGTCGGAGTGG 3’；
利用上述优选的特异性引物，以大豆植物组织基因组DNA为模板，进行PCR扩增，若能够获得长度为1239bp的扩增片段，则所述大豆为细胞核雄性不育系大豆，若不能获得长度为1239bp的扩增片段，则为细胞核雄性可育系大豆，所述长度为1239bp的扩增片段即为所述分子标记的核苷酸片段。
优选地，所述步骤(1)的PCR扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，起始退火温度58℃，以后每循环降低0.3℃，退火时间为40s，72℃延伸90s，设38个循环，最后72℃继续延伸15min。
优选地，所述步骤(1)的大豆植物组织选自叶片、根尖、种子和种皮中的一种。
本发明的原理为：本发明首先利用QTL定位，将控制大豆细胞核雄性不育系育性的基因定位在一个很小的区间，根据QTL定位结果，该区间只有4个候选基因，通过对候选区间的4个候选基因进行遗传多样性的分析，最终开发出一条能够用于鉴定大豆细胞核雄性不育系的分子标记基因，并在该分子标记的基础上开发出一条可以用于检测大豆及其后代育性的早期鉴定的引物，利用该对引物可在大豆开花前的任何时期实现对育种材料的雄性不育性的判断，且准确率100％，因此可在育种早期剔除可育个体，提高了大豆杂交制种的效率，本发明为大豆杂种优势的利用提供了一种高效的检测方法。
本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种鉴定大豆细胞核雄性不育系的分子标记及其鉴定方法，提供了一种新的大豆细胞核雄性不育系的鉴定途径，适合于大豆细胞核雄性不育系的早期鉴定；本发明还提供了一对特异性引物，利用该引物能够获得长度为1239bp的扩增片段，即为所述的分子标记的核苷酸序列，其片段长度大小适中，与PCR过程中降解的小片段序列差异明显，避免了假阳性结果的出现，同时电泳条带清晰、亮度高，鉴定结果一目了然，大豆雄性不育系的检出率达100％。
附图说明
图1为实施例1的12种大豆细胞核雄性不育系的琼脂糖凝胶电泳结果图，其中，1-6为可育株，7-12为不育株。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的一种利用分子标记鉴定大豆细胞核雄性不育系的方法，包括以下步骤：
1、DNA提取：
选取中品661的细胞核雄性不育系品种ANMS-01(该细胞核雄性不育系品种是利用钴60辐照中品661筛选获得的)与中黄13大豆品种杂交后代F2分离群体，其中可育个体6株，不育个体6株，每株分别取3粒外观和饱满度较好的大豆种子，用打孔器磨出豆粉100mg左右放入1.5ml离心管中，加入0.7ml SDS提取缓冲液(配方为：NaCl 288mmol/L，Tris-HCl200mmol/L，EDTA 25mmol/L，质量百分比为0.5％的SDS)，用0.7ml酚：氯仿：异戊醇(体积比为25﹕24﹕1)抽提除去蛋白质，重复一次，经异丙醇和NaAc(pH5.2)沉淀，70％乙醇漂洗后，真空干燥。紫外分光光度检测DNA浓度，－20℃保存备用，获得12种大豆基因组DNA。
2、以上述提取的12种大豆基因组DNA为模板，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所述序列为特异性引物，进行PCR扩增，获得扩增片段；
上游引物：SEQ ID NO：2：5’GTTAGGTGGGTAGGTGAG 3’；
下游引物：SEQ ID NO：3：5’ACATAGTGTCGGAGTGG 3’；
PCR扩增的反应体系为：总反应体系为20μl，含ddH2O 12.8μl，10×PCR Ex Buffer2.0μl，2.5mM dNTP2.0μl，10μM如SEQ ID NO.1所示的引物序列0.5μl,10μM如SEQ IDNO.2所示的引物序列0.5μl，5U/μl的Takara Ex-Taq0.2μl，50ng/ul大豆基因组DNA2μl。
PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，起始退火温度58℃，以后每循环降低0.3℃，退火时间为40s，72℃延伸90s，设38个循环，最后72℃继续延伸15min。
3、琼脂糖凝胶电泳检测：
将上述PCR扩增获得的扩增片段用质量分数为1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳的缓冲体系为1倍的TAE溶液，在100V恒压下，电泳50分钟，紫外灯下拍照并保存；
若能够获得长度大小为1239bp的扩增片段，则上述大豆为细胞核雄性不育系大豆；若不能获得长度大小为1239bp的扩增片段，则为细胞核雄性可育系大豆。
4、结果
附图1为本实施例1琼脂糖凝胶电泳的具体实验结果图，其中M为Marker5000，泳道1-6为6株中黄13与ANMS-01杂交后代的F2分离群体中雄性可育个体PCR获得的片段的凝胶电泳结果，泳道7-12为相同分离群体中6株雄性不育个体PCR产物的凝胶电泳结果，由图1的检测结果可以看出，该分子标记对大豆雄性不育的检出率达100％。
实施例2
本实施例的一种鉴定大豆细胞核雄性不育系的分子标记的方法，包括以下步骤：
(1)选取ANMS-01与中黄13大豆品种杂交后代F2分离群体的种子和种皮组织，待该分离群体播种出苗后，采集叶片和根尖组织，分别提取上述4种组织的基因组DNA，然后以上述4种组织的DNA为模板，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所述序列为特异性引物，分别进行PCR扩增，获得扩增片段。
(2)鉴定结果：4种组织的DNA均扩增获得了长度为1239bp的片段，判定该4种组织对应的大豆品种均为细胞核雄性不育系大豆。
Claims (5)
1.一种鉴定大豆细胞核雄性不育系的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种利用如权利要求1所述的分子标记鉴定大豆细胞核雄性不育系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取大豆植物组织基因组DNA，以所述分子标记的核苷酸序列为模板设计引物，进行PCR扩增，获得扩增片段；
(2)若上述步骤(1)中能够获得所述分子标记的核苷酸序列，则上述步骤(1)的大豆为细胞核雄性不育系大豆；若不能，则为细胞核雄性可育系大豆。
3.根据权利要求2所述的一种利用分子标记鉴定大豆细胞核雄性不育系的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，引物的核苷酸序列为：
上游引物：SEQ ID NO：2：5’GTTAGGTGGGTAGGTGAG 3’；
下游引物：SEQ ID NO：3：5’ACATAGTGTCGGAGTGG 3’；
所述步骤(2)中，若能够获得长度为1239bp的扩增片段，则所述大豆为雄性不育系大豆，若不能获得长度为1239bp的扩增片段，则为雄性可育系大豆。
4.根据权利要求2所述的一种利用分子标记鉴定大豆细胞核雄性不育系的方法，其特征在于，所述步骤(1)的PCR扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，起始退火温度58℃，以后每循环降低0.3℃，退火时间为40s，72℃延伸90s，设38个循环，最后72℃继续延伸15min。
5.根据权利要求2所述的一种利用分子标记鉴定大豆细胞核雄性不育系的方法，其特征在于，所述步骤(1)的大豆植物组织选自叶片、根尖、种子和种皮中的一种。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Wang Xiaobo Inventor after: Qiu Lijuan Inventor after: Li Dongdong Inventor after: Ma Yuanshan Inventor after: Zhang Haowei Inventor after: Gao Yali Inventor after: Zhang Wenming Inventor before: Wang Xiaobo Inventor before: Zhang Haowei Inventor before: Gao Yali Inventor before: Zhang Wenming |
|
| COR | Change of bibliographic data | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |