CN111705156B - 与大麦籽粒β-葡聚糖含量相关的SNP分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与大麦籽粒β‑葡聚糖含量相关的SNP分子标记及其应用，该SNP分子标记的位点位于大麦六号染色体第566409962个碱基处；SNP碱基差异为C或T。本发明首次公开了一个与大麦籽粒β‑葡聚糖含量显著相关联的SNP分子标记，该分子标记检测准确高效、扩增方便稳定，可用于分子标记辅助选择，提高大麦β‑葡聚糖含量的鉴定效率和准确度。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学及遗传育种技术领域，尤其涉及一种与大麦籽粒β-葡聚糖含量相关的SNP分子标记及其应用。
背景技术
大麦(Hordeum vulgare L.)是全球种植面积和产量仅次于玉米、小麦和水稻的第四大谷类作物，其用途广泛，主要用于食品、饲料与啤酒酿造。与玉米、小麦和水稻等谷类作物相比，大麦籽粒的化学组分独特，其中富含β-葡聚糖是其主要特点之一。β-葡聚糖是禾谷类植物籽粒细胞壁中的多糖，是籽粒细胞壁的主要成分，无论在啤用大麦、饲用大麦还是食用大麦中都是一个重要的品质性状。在制麦芽和酿造啤酒时，葡聚糖是一种不良性状，它使麦芽汁粘度增加，导致过滤困难，并易使啤酒发生混浊或沉淀。大麦作为饲料原料，葡聚糖会增加非反刍畜禽动物肠液的粘度，影响食料的消化和吸收，故被认为是畜禽的一种抗营养因子。相反，大麦作为人类食粮，葡聚糖是一种有益于健康的成分，已知它具有降低胆固醇和低密度血脂含量的功能。因此，不同的利用方式对β-葡聚糖含量有着完全不同的要求，制麦芽及酿酒时要求较低的含量，而作为人类食粮时，则要求较高的含量。总之，β-葡聚糖是大麦品质的一个重要指标，可以通过筛选不同β-葡聚糖含量的大麦材料，满足不同产品利用的需求。
由于β-葡聚糖特殊的生理活性，近年来对其研究与开发逐步升温，但其研究与开发利用受到测定方法的制约。目前，β-葡聚糖含量测定主要有苯酚-硫酸法、刚果红法、双酶法、改良双酶法等。其中，苯酚-硫酸法由于多糖和寡糖被硫酸水解成单糖，对β-葡聚糖无专一性，测定结果误差较大；刚果红法多用于啤酒β-葡聚糖含量，测定结果过低；双酶法和改良双酶法虽有较高的专一性和准确性，但测定时间长，且所用的试剂盒价格高，测定成本大。
因此，准确、快速、简易地对大麦β-葡聚糖含量特性进行鉴定，有利于加快适用不同用途优质大麦的相关育种进程，也有利于麦芽、啤酒、饲用和食用对大麦原料的选择。
发明内容
本发明的目的是提供了一种与大麦β-葡聚糖含量相关的SNP分子标记，同时提供了该SNP分子标记在筛选大麦β-葡聚糖含量的应用，该分子标记S6H_566409962-SNP，应用于筛选不同β-葡聚糖含量的大麦原料，同时在大麦遗传育种领域可用于培育不同β-葡聚糖含量的大麦新品种。
具体技术方案如下：
一种与大麦籽粒β-葡聚糖含量相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记的位点位于大麦六号染色体第566409962个碱基处；SNP碱基差异为C或T。
进一步地，本发明根据上述SNP分子标记的位点设计了扩增引物，用于扩增所述SNP分子标记的引物对序列，如下所示：
上游引物F为：5’-CCGACTTCGTCTACGTGCTC-3’(SEQ ID NO.1)；
下游引物R为：5’-GGAGTTGCGGTACTTGTCGG-3’(SEQ ID NO.2)；
扩增产物为98bp，序列如SEQ ID NO.3所示(SEQ ID NO.3:CCGACTTCGTCTACGTGCTCGACGACGACATGATCCCCGGCACCCGC(/T)ATGCTCGAGATACTCTGCCACGTCGCCGGCACCGACAAGTACCGCAACTCC)，SNP位点位于扩增片段的第47bp处。
利用上述引物对对不同大麦基因型进行PCR扩增并结合高分辨率溶解曲线(HRM)分析，可有效筛选不同β-葡聚糖含量的大麦种质资源，具体为高β-葡聚糖含量的大麦材料在该SNP位点上为C类型，而低β-葡聚糖含量的大麦材料为T类型。
本发明还提供了所述SNP分子标记以及所述引物对在大麦分子标记辅助育种中的应用。
本发明还提供了所述SNP分子标记以及所述引物对在筛选不同β-葡聚糖含量的大麦种质资源中的应用。
具体地，所述应用包括以下步骤：
(1)提取待测大麦植株的基因组DNA；
(2)以步骤(1)所述基因组DNA为模板，利用所述引物对进行PCR扩增反应(使用EvaGreen qPCR Master Mix)；
(3)利用LightScanner对待测样本进行基于高分辨率溶解曲线的基因分型和分析；
若SNP位点上的碱基为C类型，则该待测大麦植株为高β-葡聚糖含量材料；若SNP位点上的碱基为T类型，则该待测大麦植株为低β-葡聚糖含量材料。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首次公开了一个与大麦籽粒β-葡聚糖含量显著相关联的SNP分子标记，该分子标记检测准确高效、扩增方便稳定，可用于分子标记辅助选择，提高大麦β-葡聚糖含量的鉴定效率和准确度。
附图说明
图1为实施例2中20份大麦基因型的基于HRM分析法的SNP分型结果图(a)和β-葡聚糖含量箱型图(b)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的分子标记和应用进行详细说明，但不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明所使用的大麦材料可从浙江大学作物所得到。本发明所使用生化试剂均为市售。
实施例1
(1)供试材料
利用100份全球核心大麦种质资源为材料，于2018-2019年分别在杭州、宁波两地进行种植并收获种子，干燥保存待用。
(2)性状测定
用磨样机将上述收获种子磨成粉末，并置于干燥器中干燥保存，用于后续含量测定，采用Megazyme公司的β-葡聚糖测定试剂盒测定100份大麦材料的籽粒β-葡聚糖含量。
(3)GWAS分析及SNP分子标记确定
结合上述测定的β-葡聚糖含量和该群体的279515个SNP标记，采用TASSEL软件进行GWAS分析，结果显示位于六号染色体上的一个SNP标记与大麦籽粒β-葡聚糖含量显著关联，该SNP位于六号染色体的第566409962个碱基处，可在两个环境中重复检测，-LOG10(P)值均大于4。所述SNP位点为碱基C/T的差异。
实施例2
(1)供试材料
利用20份全球核心种质资源为材料，分别进行籽粒β-葡聚糖含量的测定及S6H_566409962-SNP目标区域的分析。具体如表1所示，包括10份高β-葡聚糖材料及10份低β-葡聚糖材料。
表1 20份β-葡聚糖含量不同的大麦种质材料
(2)SNP标记的获得
根据上述SNP位点信息，结合大麦全基因组序列信息，开发SNP标记引物，上游引物F为：5’-CCGACTTCGTCTACGTGCTC-3’；下游引物R为：5’-GGAGTTGCGGTACTTGTCGG-3’，扩增大小为98bp，所述SNP位于扩增片段的第47bp处。
利用上述引物对，利用下述技术，对大麦六号染色体566409962处碱基的变异进行检测，以实现大麦籽粒β-葡聚糖含量高低的检测。
(3)DNA提取
以苗期新鲜叶片为材料，采用CTAB法提取DNA，详细步骤如下：
a)取大麦嫩叶3～5g左右，在液氮中研成粉末，取1g左右加入65℃保温的CTAB提取缓冲液中，65℃水浴30～60min，其间轻摇3～5次；
b)加等体积的氯仿：异戊醇(24:1)溶液，并充分摇匀；经10000rpm离心5min，将上清夜转入一个新的离心管中；
c)加入等体积冰异丙醇，上下摇匀，在-20℃下静置20min以沉淀DNA；
d)10000rpm离心5min，弃去上清夜；70％乙醇清洗两次，风干后溶于TE中。置于-20℃待用。
(4)EvaGreen qPCR
PCR扩增反应体系为：2×EvaGreen qPCR Master Mix Master Mix(TOROIVD天筛科技)10μl，10μmol/L Primer各0.8μl，100ng/μl模板DNA 1μl，无菌水7.4μl，反应总量20μl。
PCR反应在PCR仪上进行，反应程序包括：95℃预变性1min；95℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸45s，40个循环；72℃延伸5min，4℃保存。反应结束后将反应产物在LightScanner仪器(美国Idaho公司)上进行高分辨率溶解曲线分型。
(5)HRM分析
利用SNP标记对20份供试材料进行基因型检测，结果如图1(a)所示。其中，SNP分型分为两个组，灰色为TT型，黑色为CC型。结合β-葡聚糖表型数据，制作箱型图，如图1(b)所示，CC型大麦基因型的籽粒β-葡聚糖含量显著高于TT型大麦基因型。
以上结果说明我们制备的分子标记可以应用于大麦籽粒β-葡聚糖含量的分子标记辅助选择，从而提高选择的准确度和效率。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 与大麦籽粒β-葡聚糖含量相关的SNP分子标记及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccgacttcgt ctacgtgctc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggagttgcgg tacttgtcgg 20
<210> 3
<211> 98
<212> DNA
<213> 大麦(Hordeum vulgare L.)
<400> 3
ccgacttcgt ctacgtgctc gacgacgaca tgatccccgg cacccgyatg ctcgagatac 60
tctgccacgt cgccggcacc gacaagtacc gcaactcc 98
Claims (6)
1.一种与大麦籽粒β-葡聚糖含量相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的序列如SEQ ID NO.3所示，SNP位点位于扩增片段的第47bp处，SNP碱基差异为C或T。
2.如权利要求1所述的与大麦籽粒β-葡聚糖含量相关的SNP分子标记，其特征在于，用于扩增所述SNP分子标记的引物对序列，如下所示：
上游引物F为：5’-CCGACTTCGTCTACGTGCTC-3’；
下游引物R为：5’-GGAGTTGCGGTACTTGTCGG-3’；
扩增产物为98bp，序列如SEQ ID NO.3所示，SNP位点位于扩增片段的第47bp处。
3.一种用于扩增权利要求1所述SNP分子标记的引物对，其特征在于，序列如下所示：
上游引物F为：5’-CCGACTTCGTCTACGTGCTC-3’；
下游引物R为：5’-GGAGTTGCGGTACTTGTCGG-3’。
4.如权利要求3所述的引物对在大麦分子标记辅助育种中的应用。
5.如权利要求3所述的引物对在筛选不同β-葡聚糖含量的大麦种质资源中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测大麦植株的基因组DNA；
(2)以步骤(1)所述基因组DNA为模板，利用所述引物对进行PCR扩增反应；
(3)利用LightScanner对待测样本进行基于高分辨率溶解曲线的基因分型和分析；
若SNP位点上的碱基为C类型，则该待测大麦植株为高β-葡聚糖含量材料；若SNP位点上的碱基为T类型，则该待测大麦植株为低β-葡聚糖含量材料。
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