CN103146687A - Rapd-pcr试剂盒、扩增方法及其应用 - Google Patents

Rapd-pcr试剂盒、扩增方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及RAPD-PCR试剂盒、扩增方法及其应用。以成品卷烟烟丝总DNA为模板，该试剂盒通过二次RAPD-PCR获得的扩增产物电泳图谱清晰，为后续研究奠定了基础。

Description

RAPD-PCR试剂盒、扩增方法及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别涉及RAPD-PCR试剂盒、扩增方法及其应用。
背景技术
卷烟是一种特殊的深加工食品，而加工程度越深，DNA的提取难度就越大。成品烟丝与新鲜烟叶的不同在于其经过初烤、复烤、切丝、烘丝等工序高温、高压、高湿、机械加工剪切以及加香加料后制成烟丝，不但增加了DNA提取过程中的污染物，还使基因组DNA严重降解，成为小于1000bp的小片段。因而卷烟烟丝不能提取得到完整的基因组DNA。由于烟草植物中次生代谢产物多酚类化合物可介导DNA降解，而多糖的污染也是影响烟草DNA纯度最常见的问题。
1990年，美国Dr.Williams等人第一次建立了用任意顺序的10个碱基的寡核苷酸片段作为单引物，用未知序列的基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得一组不连续的DNA片段，此多态性检测技术被命名为随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNAs，RAPD）。RAPD可用来构建一系列的遗传图谱作基因连锁分析，以及品种鉴定等，RAPD是以孟德尔方式遗传。自从RAPD技术建立以来，在RAPD标记应用中，人们关注RAPD标记的核心是它的可重复性问题，其次是扩增产物量的问题，这两个问题都会影响分析的准确性。在RAPD技术中，DNA提取方法、反应体系实验操作技术和方法等因素都会影响RAPD结果稳定性。
目前，国内外关于烟草DNA的提取技术研究和RAPD分析都是基于新鲜烟叶或者复烤烟叶，而对成品卷烟烟丝的DNA提取技术研究，鲜见报道。而大部分DNA提取技术应用于成品烟烟丝时，得到的DNA浓度较小，一次RAPD扩增不能得到清晰稳定的图谱。因此，提供一种RAPD-PCR试剂盒、扩增方法及其应用具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种RAPD-PCR试剂盒、扩增方法及其应用。以成品卷烟烟丝总DNA为模板，该试剂盒通过二次RAPD-PCR获得的扩增产物电泳图谱清晰，为后续研究奠定了基础。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种RAPD-PCR试剂盒，包括Mg2+1.50mM～3.00mM、dNTP0.10mM～0.20mM、随机引物0.20μM～0.35μM、10×Buffer2μL、Taq酶0.5U～1.25U。
本发明还提供了上述试剂盒在扩增成品卷烟烟丝总DNA中的应用；本发明提供的RAPD-PCR试剂盒，包括Mg2+1.50mM～3.00mM、dNTP0.10mM～0.20mM、随机引物0.20μM～0.35μM、10×Buffer2μL、Taq酶0.5U～1.25U。
本发明还提供了一种成品卷烟中烟丝总DNA的扩增方法，包括如下步骤：
步骤1：获得成品卷烟烟丝总DNA；
步骤2：取成品卷烟烟丝总DNA经第一RAPD-PCR，获得第一扩增扩产物；
步骤3：取第一扩增产物稀释后经第二RAPD-PCR，获得第二扩增产物；
第一RAPD-PCR的反应体系为成品卷烟烟丝总DNA5ng～80ng、Mg2+1.50mM～3.00mM、dNTP0.10mM～0.20mM、随机引物0.20μM～0.35μM、10×Buffer2μL、Taq酶0.5U～1.25U；
第二RAPD-PCR的反应体系为第一扩增产物5ng～80ng、Mg2+1.50mM～3.00mM、dNTP0.10mM～0.20mM、随机引物0.20μM～0.35μM、10×Buffer2μL、Taq酶0.5U～1.25U。
在本发明的一些实施例中，第一RAPD-PCR或第二RAPD-PCR的扩增程序包括：
预变性94～95℃，5～7min；
变性94～95℃，45～65s；
退火37～40℃，30～40s；
延伸72℃，90～100s；
终延伸72℃，5～6min；
30～40个循环。
在本发明的一些实施例中，步骤2与步骤3之间还包括取第一扩增扩产物第一电泳的步骤。
作为优选，第一电泳采用的琼脂糖凝胶的浓度为2～3%。
作为优选，稀释的倍数为10～50倍。
在本发明的另一些实施例中，第二RAPD-PCR后还包括取第二扩增扩产物经第二电泳的步骤。
作为优选，第二电泳采用的琼脂糖凝胶的浓度为2～3%。
在本发明的一些实施例中，步骤1中成品卷烟烟丝总DNA的提取方法为取成品卷烟的烟丝取出，用70%的乙醇水溶液浸泡烟丝，室温放置8小时；吸出浸泡之后的溶液，40℃，30分钟烘干；转至研钵中，用液氮冷却研磨，将烟末分装置6个1.5mL离心管中。加入750μL65℃预热的2×CTAB提取缓冲液，充分混匀；于65℃温育30min，期间颠倒混匀离心管4-5次；冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒混匀后，12000r/min离心10min；取上清，加入等体积的2×CTAB提取缓冲液和氯仿/异戊醇，混匀，12000r/min离心10min；加入2.0倍体积CTAB沉淀缓冲液，颠倒混匀后，室温静置l h，使沉淀生成；10000r/min离心10min，弃去上清液；沉淀用800μL1.2mol/LNaCl溶液溶解；12000r/min离心10min，弃不溶物；转移上层水相至1.5mL离心管中，加入2倍体积的无水乙醇（-20℃预冷），颠倒混匀后，于20℃下静置30min；12000r/min离心20min，小心弃去上清液；沉淀溶于40μL超纯水中，4℃保存备用。
本发明提供一种RAPD-PCR试剂盒、扩增方法及其应用。以成品卷烟烟丝总DNA为模板，该试剂盒通过二次RAPD-PCR获得的扩增产物电泳图谱清晰，为后续研究奠定了基础。
附图说明
图1示成品卷烟烟丝总DNA电泳图；
图2示成品卷烟烟丝总DNA经第一次RAPD-PCR后的第一扩增产物电泳图；
图3示成品卷烟烟丝总DNA经第二次RAPD-PCR后的第二扩增产物电泳图。
具体实施方式
本发明公开了一种RAPD-PCR试剂盒、扩增方法及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的一种RAPD-PCR试剂盒、扩增方法及其应用中所用试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1成品卷烟烟丝总DNA的提取、扩增
将购于郑州品牌B卷烟一支成品烟的烟丝取出，用70%的乙醇水溶液浸泡烟丝，室温放置8小时；吸出浸泡之后的溶液，40℃，30分钟烘干；转至研钵中，用液氮冷却研磨，将烟末分装置6个1.5mL离心管中。加入750μL65℃预热的2×CTAB提取缓冲液，充分混匀；于65℃温育30min，期间颠倒混匀离心管4-5次；冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒混匀后，12000r/min离心10min；取上清，加入等体积的2×CTAB提取缓冲液和氯仿/异戊醇，混匀，12000r/min离心10min；加入2.0倍体积CTAB沉淀缓冲液，颠倒混匀后，室温静置lh，使沉淀生成；10000r/min离心10min，弃去上清液；沉淀用800μL1.2mol/L NaCl溶液溶解；12000r/min离心10min，弃不溶物；转移上层水相至1.5mL离心管中，加入2倍体积的无水乙醇（-20℃预冷），颠倒混匀后，于20℃下静置30min；12000r/min离心20min，小心弃去上清液；沉淀溶于40μL超纯水中，4℃保存备用，即为成品卷烟烟丝总DNA。经电泳获得电泳图，如图1所示。
取成品卷烟烟丝总DNA80ng、Mg2+1.50mM、dNTP0.15mM、随机引物0.28μM、10×Buffer2μL、Taq酶1.25U；按照上述反应体系进行第一RAPD-PCR扩增。
第一RAPD-PCR的扩增程序包括：
预变性95℃，5min；
变性95℃，60s；
退火37℃，30s；
延伸72℃，92s；
终延伸72℃，6min；
33个循环。
获得第一扩增产物，采用浓度为2～3%的琼脂糖凝胶经第一电泳，获得电泳图如图2所示。
取第一扩增产物稀释10～50倍后，取80ng、Mg2+1.50mM、dNTP0.15mM、随机引物0.28μM、10×Buffer2μL、Taq酶1.25U。
第二RAPD-PCR的扩增程序包括：
预变性95℃，5min；
变性95℃，60s；
退火37℃，30s；
延伸72℃，92s；
终延伸72℃，5min；
33个循环。
获得第二扩增产物，采用浓度为2～3%的琼脂糖凝胶经第二电泳，获得电泳图如图3所示。
图1中样品DNA在1000bp以下都出现亮带，说明图1中样品DNA最大片段为1000bp。由图3可知，成品卷烟均可通过二次RAPD-PCR获得了清晰、稳定的图谱。其中，1号在约950bp处有带，而其他样品没有，1号在300bp处没有带，而其他样品有带，因此1号可以从其他样品中鉴别出来。1号和5号在700bp处有带，其他样品在700bp处没有带，而1号已经鉴别出来，因此，5号可从剩余样品中鉴别出来。4号在约450bp处有带，其他样品无带，因此，4号也可以从2、3中鉴别出来。2号和3号在约650bp处有带，但是3号的650bp带属于亮带，2号650bp带亮度明显比3号的650bp带低，因此，借助这点差异，也能把2号和3号区分开。
实施例2成品卷烟烟丝总DNA的提取、扩增
将购于郑州品牌B卷烟一支成品烟的烟丝取出，用70%的乙醇水溶液浸泡烟丝，室温放置8小时；吸出浸泡之后的溶液，40℃，30分钟烘干；转至研钵中，用液氮冷却研磨，将烟末分装置6个1.5mL离心管中。加入750μL65℃预热的2×CTAB提取缓冲液，充分混匀；于65℃温育30min，期间颠倒混匀离心管4-5次；冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒混匀后，12000r/min离心10min；取上清，加入等体积的2×CTAB提取缓冲液和氯仿/异戊醇，混匀，12000r/min离心10min；加入2.0倍体积CTAB沉淀缓冲液，颠倒混匀后，室温静置lh，使沉淀生成；10000r/min离心10min，弃去上清液；沉淀用800μL1.2mol/LNaCl溶液溶解；12000r/min离心10min，弃不溶物；转移上层水相至1.5mL离心管中，加入2倍体积的无水乙醇（-20℃预冷），颠倒混匀后，于20℃下静置30min；12000r/min离心20min，小心弃去上清液；沉淀溶于40μL超纯水中，4℃保存备用，即为成品卷烟烟丝总DNA。
取成品卷烟烟丝总DNA5ng、Mg2+3.00mM、dNTP0.20mM、随机引物0.25μM、10×Buffer2μL、Taq酶0.75U；按照上述反应体系进行第一RAPD-PCR扩增。
第一RAPD-PCR的扩增程序包括：
预变性94℃，7min；
变性94℃，55s；
退火40℃，3s；
延伸72℃，97s；
终延伸72℃，6min；
35个循环。
获得第一扩增产物。
取第一扩增产物稀释10～50倍后，取5ng、Mg2+3.00mM、dNTP0.20mM、随机引物0.25μM、10×Buffer2μL、Taq酶0.75U。
第二RAPD-PCR的扩增程序包括：
预变性94℃，7min；
变性94℃，55s；
退火40℃，30s；
延伸72℃，97s；
终延伸72℃，6min；
35个循环。
获得第二扩增产物。
电泳检测结果同实施例1所示。
实施例3成品卷烟烟丝总DNA的提取、扩增
将购于郑州品牌B卷烟一支成品烟的烟丝取出，用70%的乙醇水溶液浸泡烟丝，室温放置8小时；吸出浸泡之后的溶液，40℃，30分钟烘干；转至研钵中，用液氮冷却研磨，将烟末分装置6个1.5mL离心管中。加入750μL65℃预热的2×CTAB提取缓冲液，充分混匀；于65℃温育30min，期间颠倒混匀离心管4-5次；冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒混匀后，12000r/min离心10min；取上清，加入等体积的2×CTAB提取缓冲液和氯仿/异戊醇，混匀，12000r/min离心10min；加入2.0倍体积CTAB沉淀缓冲液，颠倒混匀后，室温静置lh，使沉淀生成；10000r/min离心10min，弃去上清液；沉淀用800μL1.2mol/LNaCl溶液溶解；12000r/min离心10min，弃不溶物；转移上层水相至1.5mL离心管中，加入2倍体积的无水乙醇（-20℃预冷），颠倒混匀后，于20℃下静置30min；12000r/min离心20min，小心弃去上清液；沉淀溶于40μL超纯水中，4℃保存备用，即为成品卷烟烟丝总DNA。
取成品卷烟烟丝总DNA40ng、Mg2+2.50mM、dNTP0.10mM、随机引物0.30μM、10×Buffer2μL、Taq酶0.5U；按照上述反应体系进行第一RAPD-PCR扩增。
第一RAPD-PCR的扩增程序包括：
预变性95℃，6min；
变性95℃，50s；
退火38℃，35s；
延伸72℃，95s；
终延伸72℃，5min；
38个循环。
获得第一扩增产物。
取第一扩增产物稀释10～50倍后，取40ng、Mg2+2.50mM、dNTP0.10mM、随机引物0.30μM、10×Buffer2μL、Taq酶0.5U。
第二RAPD-PCR的扩增程序包括：
预变性95℃，6min；
变性95℃，50s；
退火38℃，35s；
延伸72℃，95s；
终延伸72℃，5min；
38个循环。
获得第二扩增产物。
电泳检测结果同实施例1所示。
实施例4成品卷烟烟丝总DNA的提取、扩增
将购于郑州品牌B卷烟一支成品烟的烟丝取出，用70%的乙醇水溶液浸泡烟丝，室温放置8小时；吸出浸泡之后的溶液，40℃，30分钟烘干；转至研钵中，用液氮冷却研磨，将烟末分装置6个1.5mL离心管中。加入750μL65℃预热的2×CTAB提取缓冲液，充分混匀；于65℃温育30min，期间颠倒混匀离心管4-5次；冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒混匀后，12000r/min离心10min；取上清，加入等体积的2×CTAB提取缓冲液和氯仿/异戊醇，混匀，12000r/min离心10min；加入2.0倍体积CTAB沉淀缓冲液，颠倒混匀后，室温静置lh，使沉淀生成；10000r/min离心10min，弃去上清液；沉淀用800μL1.2mol/LNaCl溶液溶解；12000r/min离心10min，弃不溶物；转移上层水相至1.5mL离心管中，加入2倍体积的无水乙醇（-20℃预冷），颠倒混匀后，于20℃下静置30min；12000r/min离心20min，小心弃去上清液；沉淀溶于40μL超纯水中，4℃保存备用，即为成品卷烟烟丝总DNA。
取成品卷烟烟丝总DNA20ng、Mg2+2.00mM、dNTP0.12mM、随机引物0.20μM、10×Buffer2μL、Taq酶1.0U；按照上述反应体系进行第一RAPD-PCR扩增。
第一RAPD-PCR的扩增程序包括：
预变性94℃，5min；
变性95℃，45s；
退火39℃，32s；
延伸72℃，100s；
终延伸72℃，6min；
40个循环。
获得第一扩增产物。
取第一扩增产物稀释10～50倍后，取20ng、Mg2+2.00mM、dNTP0.12mM、随机引物0.20μM、10×Buffer2μL、Taq酶1.0U。
第二RAPD-PCR的扩增程序包括：
预变性94℃，5min；
变性95℃，45s；
退火39℃，32s；
延伸72℃，100s；
终延伸72℃，6min；
40个循环。
获得第二扩增产物。
电泳检测结果同实施例1所示。
实施例5成品卷烟烟丝总DNA的提取、扩增
将购于郑州品牌B卷烟一支成品烟的烟丝取出，用70%的乙醇水溶液浸泡烟丝，室温放置8小时；吸出浸泡之后的溶液，40℃，30分钟烘干；转至研钵中，用液氮冷却研磨，将烟末分装置6个1.5mL离心管中。加入750μL65℃预热的2×CTAB提取缓冲液，充分混匀；于65℃温育30min，期间颠倒混匀离心管4-5次；冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒混匀后，12000r/min离心10min；取上清，加入等体积的2×CTAB提取缓冲液和氯仿/异戊醇，混匀，12000r/min离心10min；加入2.0倍体积CTAB沉淀缓冲液，颠倒混匀后，室温静置lh，使沉淀生成；10000r/min离心10min，弃去上清液；沉淀用800μL1.2mol/LNaCl溶液溶解；12000r/min离心10min，弃不溶物；转移上层水相至1.5mL离心管中，加入2倍体积的无水乙醇（-20℃预冷），颠倒混匀后，于20℃下静置30min；12000r/min离心20min，小心弃去上清液；沉淀溶于40μL超纯水中，4℃保存备用，即为成品卷烟烟丝总DNA。
取成品卷烟烟丝总DNA60ng、Mg2+1.80mM、dNTP0.18mM、随机引物0.35μM、10×Buffer2μL、Taq酶1.0U；按照上述反应体系进行第一RAPD-PCR扩增。
第一RAPD-PCR的扩增程序包括：
预变性95℃，7min；
变性95℃，65s；
退火37℃，38s；
延伸72℃，90s；
终延伸72℃，6min；
30个循环。
获得第一扩增产物。
取第一扩增产物稀释10～50倍后，取60ng、Mg2+1.80mM、dNTP0.18mM、随机引物0.35μM、10×Buffer2μL、Taq酶1.0U。
第二RAPD-PCR的扩增程序包括：
预变性95℃，7min；
变性95℃，65s；
退火37℃，38s；
延伸72℃，90s；
终延伸72℃，6min；
30个循环。
获得第二扩增产物。
电泳检测结果同实施例1所示。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种RAPD-PCR试剂盒，其特征在于，包括Mg2+1.50mM～3.00mM、dNTP0.10mM～0.20mM、随机引物0.20μM～0.35μM、10×Buffer2μL、Taq酶0.5U～1.25U。
2.根据权利要求1所述的试剂盒在扩增成品卷烟烟丝总DNA中的应用。
3.一种成品卷烟中烟丝总DNA的扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：获得成品卷烟烟丝总DNA；
步骤2：取所述成品卷烟烟丝总DNA经第一RAPD-PCR，获得第一扩增扩产物；
步骤3：取所述第一扩增产物稀释后经第二RAPD-PCR，获得第二扩增产物；
所述第一RAPD-PCR的反应体系为所述成品卷烟烟丝总DNA5ng～80ng、Mg2+1.50mM～3.00mM、dNTP0.10mM～0.20mM、随机引物0.20μM～0.35μM、10×Buffer2μL、Taq酶0.5U～1.25U；
所述第二RAPD-PCR的反应体系为所述第一扩增产物5ng～80ng、Mg2+1.50mM～3.00mM、dNTP0.10mM～0.20mM、随机引物0.20μM～0.35μM、10×Buffer2μL、Taq酶0.5U～1.25U。
4.根据权利要求3所述的扩增方法，其特征在于，所述第一RAPD-PCR或第二RAPD-PCR的扩增程序包括：
预变性94～95℃，5～7min；
变性94～95℃，45～65s；
退火37～40℃，30～40s；
延伸72℃，90～100s；
终延伸72℃，5～6min；
30～40个循环。
5.根据权利要求3所述的扩增方法，其特征在于，所述步骤2与所述步骤3之间还包括取所述第一扩增扩产物经第一电泳的步骤。
6.根据权利要求5所述的扩增方法，其特征在于，所述第一电泳采用的琼脂糖凝胶的浓度为2～3%。
7.根据权利要求3所述的扩增方法，其特征在于，步骤3中所述稀释的倍数为10～50倍。
8.根据权利要求3所述的扩增方法，其特征在于，所述第二RAPD-PCR后还包括取所述第二扩增扩产物经第二电泳的步骤。
9.根据权利要求8所述的扩增方法，其特征在于，所述第二电泳采用的琼脂糖凝胶的浓度为2～3%。
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