CN113637727A - 用于构建半糯型粳稻品种dna指纹图谱库的成套引物对及其筛选方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对，包括18对SNP四引物对和36对InDel引物对，18对SNP四引物对分别特异性检测18个水稻SNP位点SNPjs0001～SNPjs0018，36对InDel引物对分别特异性检测36个水稻InDel位点InDeljs0001～InDeljs0036。还提供了相关筛选方法和应用。本发明的用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对能够用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库，能够用于半糯型粳稻品种的真伪和纯度鉴定，设计巧妙，使用简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物信息学及分子遗传学技术领域，更具体地，涉及构建水稻DNA指纹图谱库的引物对技术领域，特别是指一种用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对及其筛选方法和应用。
背景技术
近些年，育种家们根据江淮地区人们喜爱偏软糯米饭的饮食习惯，通过降低稻米直链淀粉含量培育出了一系列优良食味粳稻品种(王才林、张亚东、赵春芳等，江苏省优良食味粳稻的遗传与育种研究，遗传，2021，43(5)：442-458)，如江苏省的南粳系列粳稻品种、宁粳 8号、苏香粳100、丰粳1606、武香粳113等，上海的沪软1212、松香粳1018等，浙江的嘉58、嘉农早香等。这些优良食味粳稻因稻米直链淀粉含量介于普通粳稻和糯稻之间而被称为半糯粳稻，其米饭质地柔软、粘性大、弹性好、冷饭不回生。这些半糯型粳稻品种近年来在我国江淮地区推广应用面积不断增加，据不完全统计，2019年仅江苏省推广面积就达1300多万亩；同时也成为了地产优质高档稻米品牌打造的主力种源。
由于食味品质优、稻米品牌名气大、销路好，在巨大经济利益的诱惑下，半糯型优良食味粳稻的种子和稻米品牌的造假事件层出不穷，一些不法商贩以假的、劣质的种子或稻米冒充优质品种，形成了以假乱真、真假难辨等现象，不仅给种植户、加工企业和消费者带来了严重的经济、利益损失，同时也给高档稻米的品牌形象造成严重的负面影响。另一方面，育种家们也发现优良食味稻米在生产上存在部分种性退化、口感下降现象，影响了稻米品质和品牌的市场竞争力。因此，研发品种真伪和纯度鉴定的准确高效的方法、实现目前主推半糯型优良食味粳稻品种原种种性的精准鉴定，已经成为育种单位、稻米加工企业、质量监管部分及消费者等多方密切关注的问题。
基于株系谱表型的田间繁种鉴定模式由于周期长、性状随环境变异大等诸多局限性，已不能满足对不同种质的准确快速地辨别。基于DNA序列变异的分子标记技术，现已在水稻资源鉴定、品种纯度检测和分类等方面得到了广泛应用(王明湖、张孝天、吴国林、蒋琪、施勇烽，SSR标记在宁波地区水稻品种DNA指纹图谱构建及纯度鉴定中的应用，中国稻米，2009，25(6)，50-54；李梓榕、袁雄、陈叶、郑兴飞、胡中立、李兰芝，基于全基因组SNP高效鉴定水稻种质资源并构建指纹图谱，分子植物育种，2020，18(18)， 6050-6057)。这些研究基本都是利用SSR分子标记，我国现行的水稻品种真实性分子检测的行业标准《NYT1433-2014-水稻品种鉴定技术规程SSR标记法》也是基于48对SSR标记进行的DNA分子鉴定，但是该标准选用遗传变异丰富的籼稻品种为参照品种，较多标记在栽培粳稻品种间的区分效果并不理想，仅有少数呈现多态性，主要原因可能是生产上主推粳稻品种往往来源于相同的骨干亲本品种或者在同一品种基础上仅改良少数甚至单个性状的派生品种，造成品种间的遗传差异越来越小，研究表明同一稻区内主推粳稻品种特别是半糯型粳稻品种间往往含有相同主效基因(赵春芳、岳红亮、田铮等，江苏和东北粳稻稻米理化特性及Wx和OsSSIIa基因序列分析，作物学报，2020，46(06)，75-85)。因此，常规的SSR分子标记已不能用于这些品种真伪和纯度的鉴定。
随着水稻功能基因组兴起，大量水稻品质、抗性、高产、株型等重要性状调控基因被陆续克隆，这些基因在水稻种质资源中存在多种等位变异形式(张昌泉、冯琳皓、顾铭洪、刘巧泉，江苏省水稻品质性状遗传和重要基因克隆研究进展，遗传，2021，43(5)， 17；万建民，水稻重要基因克隆及育种利用，中国作物学会学术年会，2019)。因此，为实现长江中下游地区主栽半糯型优良食味粳稻品种真实性的精准鉴定，构建单个品种的 DNA指纹数据库，更好地保持品种种性稳定遗传，维护种植户和稻米加工企业的合法权益，打造优良食味稻米品种品牌，有必要建立一套基于水稻核心基因功能标记的快速、精准的检测体系。
因此，希望提供一种用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对，其能够用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库，能够用于半糯型粳稻品种的真伪和纯度鉴定。
发明内容
为了克服上述现有技术中的缺点，本发明的一个目的在于提供一种用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对，其能够用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库，能够用于半糯型粳稻品种的真伪和纯度鉴定，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对，其设计巧妙，使用简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对的筛选方法，由其获得的用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对能够用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库，能够用于半糯型粳稻品种的真伪和纯度鉴定，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对的筛选方法，其设计巧妙，操作简便快捷，成本低，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对在构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库、鉴定水稻品种或分子育种中的应用，从而能够用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库，能够用于半糯型粳稻品种的真伪和纯度鉴定，能够用于分子育种，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对在构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库、鉴定水稻品种或分子育种中的应用，其设计巧妙，使用简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用。
为达到以上目的，在本发明的第一方面，提供了一种用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对，其特点是，所述的用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对包括18对SNP四引物对和36对InDel引物对，18对所述SNP四引物对分别特异性检测18个水稻SNP位点SNPjs0001～SNPjs0018，36对所述InDel引物对分别特异性检测 36个水稻InDel位点InDeljs0001～InDeljs0036。
较佳地，每对所述SNP四引物对分别包括SNP正向内引物、SNP反向内引物、SNP 正向外引物和SNP反向外引物，18对所述SNP四引物对的序列依次如SEQ ID NO：1～SEQ IDNO：72所示，每对所述InDel引物对分别包括InDel正向引物和InDel反向引物，36对所述InDel引物对的序列依次如SEQ ID NO:73～SEQ ID NO:144所示。
在本发明的第二方面，提供了一种用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对的筛选方法，其特点是，包括以下步骤：
(1)利用公共数据库中多个水稻品种基因组测序数据，针对水稻重要性状基因进行核心序列比较，筛选SNP位点和InDel位点，针对所述SNP位点设计候选SNP四引物对，针对所述InDel位点设计候选InDel引物对；
(2)分别提取多个半糯型粳稻品种的叶片基因组DNA，利用所述候选SNP四引物对对每个所述半糯型粳稻品种的所述叶片基因组DNA进行PCR扩增获得PCR扩增产物，将所述PCR扩增产物进行电泳条带检测，获得PCR扩增谱带，对所述PCR扩增谱带的特异性、多态性以及带型的易区分程度进行初筛，筛选出在不同所述半糯型粳稻品种间特征谱带清晰、有多态性且能够稳定重复的SNP四引物对，以所述SNP四引物对扩增得到的所述特征谱带将多个所述半糯型粳稻品种进行类群区分获得初步区分结果；
(3)利用所述候选InDel引物对进一步对根据所述初步区分结果获得的每个初步类群的所述半糯型粳稻品种进行类群区分，直到把每个所述半糯型粳稻品种划分为一个类群为止，且最相似的两个所述半糯型粳稻品种间的差异引物对的数量占总引物对的数量的5％以上，在此过程中筛选出在不同所述半糯型粳稻品种间特征谱带清晰、有多态性且能够稳定重复的InDel引物对，所述SNP四引物对和所述InDel引物对构成所述的用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对。
较佳地，在所述步骤(1)中，所述公共数据库为NCBI基因组数据库和Rice GenomeAnnotation Project数据库；多个所述水稻品种是日本晴、9311、苏御糯、明恢63、桂朝2；所述水稻重要性状基因包括淀粉去分支酶基因II、淀粉合酶基因II、松散株型基因LPA1、抽穗期基因Hd6、水稻抗胁迫基因OsLecRK1、籽粒体型控制基因GIF1、水稻淀粉调节因子RSR1、G蛋白基因RGA1、抽穗期基因Hd1、千粒重基因TGW6、胚乳蛋白基因RAG2、抽穗期控制基因Ghd7、抽穗期基因Ghd8、淀粉合成酶基因III、颗粒型淀粉合酶基因GBSSI、抽穗期基因OsFCA、抽穗期基因Ehd2、低直链淀粉含量基因du3、类CO基因Ghd2、淀粉分支酶基因I、落粒性基因OsYABBY2、酪蛋白激酶CKI、MADS转录因子、水稻抗胁迫基因OsLecRK1、谷氨酰胺合成酶基因OsGS2、粒型基因GW5、直立型密穗基因DEP2、抽穗期控制基因DTH7、稻瘟病抗性基因Pita、早穗基因Ehd3、组蛋白甲基转移酶SDG724、早穗基因Ehd1、稻瘟病抗性基因Pib、粒型基因GW5、淀粉合成基因II、香味基因BADH2、淀粉合成酶基因I、淀粉合酶基因IIb、淀粉分支酶基因IV、ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因和淀粉分支酶基因III。
较佳地，在所述步骤(2)中，多个所述半糯型粳稻品种包括南粳46、南粳5055、南粳9108、南粳晶谷、南粳505、南粳58、南粳2728、南粳5718、南粳518、南粳3908、南粳56、南粳5713、中江粳9008、南粳5818、南粳9308、南粳7718、南粳9036、嘉58、苏香粳3号、宁粳8号、苏香粳100、松早香1号、沪早香软1号、嘉农早香、沪软1212、松香粳1018、嘉农粳6号、宁香粳9号、扬农香28、早香粳1号、金香玉1号、丰粳1606、常香粳1813、武香粳113和徐稻9号；所述SNP四引物对的数目为18对，每对所述SNP四引物对分别包括SNP正向内引物、SNP反向内引物、SNP正向外引物和SNP反向外引物，18对所述SNP四引物对的序列依次如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：72所示。
较佳地，在所述步骤(3)中，所述InDel引物对的数目为36对，每对所述InDel引物对分别包括InDel正向引物和InDel反向引物，36对所述InDel引物对的序列依次如SEQ IDNO:73～SEQ ID NO:144所示。
在本发明的第三方面，提供了一种半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的构建方法，其特点是，包括以下步骤：
(A)分别提取多个半糯型粳稻品种的叶片基因组DNA；
(B)采用上述的用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对对每个所述半糯型粳稻品种的所述叶片基因组DNA进行PCR扩增、电泳成像和扩增条带有效特征化，按照所述的用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对的顺序依次对特征化条带进行编号，对所述特征化条带按所述编号进行0/1记录，得到每个所述半糯型粳稻品种的DNA特征指纹图谱；
(C)对所述DNA特征指纹图谱进行汇总，获得所述半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库。
较佳地，在所述步骤(A)中，多个所述半糯型粳稻品种包括南粳46、南粳5055、南粳9108、南粳晶谷、南粳505、南粳58、南粳2728、南粳5718、南粳518、南粳3908、南粳56、南粳5713、中江粳9008、南粳5818、南粳9308、南粳7718、南粳9036、嘉58、苏香粳3号、宁粳8号、苏香粳100、松早香1号、沪早香软1号、嘉农早香、沪软1212、松香粳1018、嘉农粳6号、宁香粳9号、扬农香28、早香粳1号、金香玉1号、丰粳1606、常香粳1813、武香粳113和徐稻9号。
在本发明的第四方面，提供了一种对待测水稻品种进行半糯型粳稻品种鉴定的鉴定方法，其特点是，包括以下步骤：
(I)提取所述待测水稻品种的叶片基因组DNA；
(II)采用上述的用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对对所述待测水稻品种的所述叶片基因组DNA进行PCR扩增、电泳成像和扩增条带有效特征化，按照所述的用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对的顺序依次对特征化条带进行编号，对所述特征化条带按所述编号进行0/1记录，建立所述待测水稻品种的DNA 指纹图谱库；
(III)将所述的待测水稻品种的DNA指纹图谱库与上述的半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的构建方法构建而成的所述半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库合并，绘制聚类图，判定与所述待测水稻品种遗传相似性最高的所述目标半糯型粳稻品种；
(IV)当所述待测水稻品种与所述目标半糯型粳稻品种间的差异引物对的数量为3个以上时，则判定所述待测水稻品种与所述目标半糯型粳稻品种存在明显差异、属于不同品种；当所述待测水稻品种与所述目标半糯型粳稻品种间的差异引物对的数量为2个以下时，则判定所述待测水稻品种与所述目标半糯型粳稻品种为同一品种或近似品种。
在本发明的第五方面，提供了上述的用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对在构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库、鉴定水稻品种或分子育种中的应用。
本发明的有益效果在于：
a.本发明的用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对包括18对SNP四引物对和36对InDel引物对，18对SNP四引物对分别特异性检测18个水稻SNP位点SNPjs0001～SNPjs0018，36对InDel引物对分别特异性检测36个水稻InDel位点InDeljs0001～InDeljs0036，因此，其能够用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库，能够用于半糯型粳稻品种的真伪和纯度鉴定，适于大规模推广应用。
b.本发明的用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对包括18对SNP四引物对和36对InDel引物对，18对SNP四引物对分别特异性检测18个水稻SNP位点SNPjs0001～SNPjs0018，36对InDel引物对分别特异性检测36个水稻InDel位点InDeljs0001～InDeljs0036，因此，其设计巧妙，使用简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用。
c.本发明的用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对的筛选方法利用公共数据库中多个水稻品种基因组测序数据，针对水稻重要性状基因进行核心序列比较，筛选SNP位点和InDel位点，分别设计候选SNP四引物对和候选InDel引物对；利用候选SNP四引物对对半糯型粳稻品种进行PCR扩增，对PCR扩增谱带的特异性、多态性以及带型的易区分程度进行初筛，筛选出在不同半糯型粳稻品种间特征谱带清晰、有多态性且能够稳定重复的SNP四引物对，以SNP四引物对扩增得到的特征谱带将多个半糯型粳稻品种进行类群区分；利用候选InDel引物对进一步进行类群区分，直到把每个半糯型粳稻品种划分为一个类群为止，且最相似的两个半糯型粳稻品种间的差异引物对的数量占总引物对的数量的5％以上，在此过程中筛选出在不同半糯型粳稻品种间特征谱带清晰、有多态性且能够稳定重复的InDel引物对，SNP四引物对和InDel引物对构成用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对，因此，由其获得的用于构建半糯型粳稻品种 DNA指纹图谱库的成套引物对能够用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库，能够用于半糯型粳稻品种的真伪和纯度鉴定，适于大规模推广应用。
d.本发明的用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对的筛选方法利用公共数据库中多个水稻品种基因组测序数据，针对水稻重要性状基因进行核心序列比较，筛选SNP位点和InDel位点，分别设计候选SNP四引物对和候选InDel引物对；利用候选SNP四引物对对半糯型粳稻品种进行PCR扩增，对PCR扩增谱带的特异性、多态性以及带型的易区分程度进行初筛，筛选出在不同半糯型粳稻品种间特征谱带清晰、有多态性且能够稳定重复的SNP四引物对，以SNP四引物对扩增得到的特征谱带将多个半糯型粳稻品种进行类群区分；利用候选InDel引物对进一步进行类群区分，直到把每个半糯型粳稻品种划分为一个类群为止，且最相似的两个半糯型粳稻品种间的差异引物对的数量占总引物对的数量的5％以上，在此过程中筛选出在不同半糯型粳稻品种间特征谱带清晰、有多态性且能够稳定重复的InDel引物对，SNP四引物对和InDel引物对构成用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对，因此，其设计巧妙，操作简便快捷，成本低，适于大规模推广应用。
e.本发明的用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对在构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库、鉴定水稻品种或分子育种中的应用，从而能够用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库，能够用于半糯型粳稻品种的真伪和纯度鉴定，能够用于分子育种，适于大规模推广应用。
f.本发明的用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对在构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库、鉴定水稻品种或分子育种中的应用，其设计巧妙，使用简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用。
附图说明
图1是本发明的用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对的其中3对SNP四引物对在半糯型粳稻品种中的扩增图谱及有效特征化位点，其中M为DNA Marker，D1-D34分别对应不同半糯型粳稻品种，*为有效特征化位点，×为无效位点。
图2是本发明的用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对的其中4对InDel引物对在半糯型粳稻品种中的扩增图谱及有效特征化位点，其中M为DNA Marker，D1-D34分别对应不同半糯型粳稻品种，*为有效特征化位点，×为无效位点。
图3是采用本发明的用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对构建的待测水稻品种的DNA指纹图谱库与半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的聚类分析图，方框表示待测水稻品种和南粳9108属于相同类群，属于同一品种，待测水稻品种为南粳9108 疑似种。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。
本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。实施实例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
实施例1用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对的筛选以及半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的构建
一、试验材料
本发明选取34个半糯型粳稻品种，来源于目前江浙沪地域生产上的主推水稻品种，其食味品质优，已得到市场广泛认可，品种名称及选育单位信息详见表1。所有材料均为公知公用材料，江苏省农业种质资源中期库可免费提供。
表1本发明所述的34个半糯型粳稻品种及选育单位
二、引物对设计与筛选
(1)引物对序列来源与设计
基于公共数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/、http://rice.plantbiology.msu.edu/)中日本晴、9311、苏御糯、明恢63、桂朝2的水稻品种基因组测序数据，锚定水稻品质、产量、抗性、抽穗期等重要性状控制基因，对基因的核心区域(编码区域)进行多序列比较，筛选核苷酸插入缺失和单核苷酸替换的序列变异；在变异位点两侧合适位置分别设计引物对，针对单核苷酸替换变异类型设计SNP四引物对，具体是利用四引物扩增受阻突变体系PCR技术设计的SNP四引物对，针对插入缺失变异类型设计InDel引物对，其中部分淀粉合成酶基因的引物对设计还参考了文献资料(陈涛、骆名瑞、张亚东等，利用四引物扩增受阻突变体系PCR技术检测水稻低直链淀粉含量基因Wx-mq，中国水稻科学， 2013，27(5)，529-534；田志喜、严长杰、钱前等，水稻淀粉合成相关基因分子标记的建立，科学通报，2010，55(26)，2591-2601)中淀粉酶基因的分子标记开发信息，将引物对序列交由南京擎科生物有限公司进行引物合成。
(2)引物对筛选
首先将上述SNP四引物对在各个半糯型粳稻品种中PCR扩增谱带的特异性、多态性以及带型的易区分程度进行初筛，筛选出在不同半糯型粳稻品种间特征谱带清晰、有多态性且能够稳定重复的SNP四引物对，共计18对涉及水稻重要性状基因功能变异位点的SNP四引物对；然后，以这18对SNP四引物对作为指纹图谱库构建的核心引物，根据核心引物的特征谱带将各个半糯型粳稻品种进行类群区分；以核心引物的区分结果为基准，在各类群中增加InDel引物对进行进一步区分，以此类推，34个半糯型粳稻品种将会被划分为更多的类群，直到把各类群分到仅有一个半糯型粳稻品种为止，且保证最相似两个半糯型粳稻品种间的差异引物对(所谓差异引物对是指该引物对在二者间扩增的特征化条带存在差异)的数量占总引物对的数量的5％以上。最终筛选到扩增效果好、多态性高的来源于41个水稻重要性状调控基因的18对SNP四引物对和36对InDel引物对，组成了本发明的用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对，含54对引物对，54对引物对的序列信息见表2。
表2 54对引物对的序列及来源基因信息
54对引物对对应的54个位点信息请参见表3所示。
表3 54对引物对对应的54个位点信息
三、半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的构建
(1)叶片基因组DNA的提取
分别对34个半糯型粳稻品种进行叶片取样，取0.1g左右叶片装入2ml离心管，冷冻干燥后研磨成粉，加入500ul提前预热的CTAB缓冲液，65℃恒温箱内孵育30min，中间取出离心管上下颠倒充分摇匀，然后取出离心管加入500ul按24:1混合均匀得氯仿:异戊醇溶液，然后室温、12000rpm、离心10min，弃沉淀，将上清液转移至新的离心管中，加入2/3体积的异丙醇混匀后，-20℃静置1小时；最后4℃、10000rpm、离心5min，弃上清，保留沉淀，加入500ul75％乙醇洗涤沉淀2次，去除上清，获得DNA沉淀放于室温下晾干，加入 100ul去离子H2O溶解DNA，放入-20℃冰箱中保存备用。
(2)PCR扩增
分别以34个半糯型粳稻品种的叶片基因组DNA为模板、54对引物对组成的成套引物对为扩增引物对，根据各引物对的扩增条件分别进行PCR扩增。PCR反应采用15ul扩增体系，具体为：2×Taq Master Mix 7.5ul；Mix primers 2.0ul；Total DNA 1ul(50-200ng)；ddH2O 4.5ul。PCR扩增程序为：94℃预变性2min后进入循环，94℃变性30s，52～57℃退火45s， 72℃延伸1min，循环33次，72℃后延伸5min，10℃保存10min，获得各半糯型粳稻品种的叶片基因组DNA在不同引物对上的PCR扩增产物。
(3)PCR产物电泳检测
18对SNP四引物对的扩增产物在质量比浓度为2.0％琼脂糖凝胶上电泳，经核酸染料染色后在凝胶成像系统下观察、拍摄图像。336对InDel引物对的扩增产物根据特征谱带的长度及类型选择不同类型凝胶，差异碱基数在10bp以上的采用在2％琼脂糖凝胶上电泳，差异碱基数不足10bp的选择在9％聚丙烯酰胺凝胶上电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后，凝胶经银染、洗涤、甲醛显色后，拍摄图像。
(4)结果分析与半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的构建
根据琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳后的检测图像，挑选符合引物设计目标产物大小的特征带型进行凝胶回收、序列分析，以确证特征条带正确性。然后，以DNAMarker为对照，将电泳图谱上的PCR条带进行有效特征化，图1和图2显示了对部分引物对的PCR扩增条带进行有效特征化的示意图。最后，按照SNP1～18～InDel1～36的顺序依次对特征化条带进行编号，将各个半糯型粳稻品种在每对引物对上得到的特征化条带依次按编号进行0/1记录，0表示没有扩增出特征化条带，1表示扩增出特征化条带，得到每个半糯型粳稻品种的DNA特征指纹图谱，经汇总，建立了包含155个数据的半糯型粳稻品种 DNA指纹图谱库(表3)。
表3半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库(0/1数据库)
(5)基于155个数据的半糯型粳稻品种间的聚类分析
根据54对引物对所检测到的155个0/1数据，采用SLT_NT-sys_2.10软件中similarity程序计算34个半糯型粳稻品种的遗传相似性，以clustering程序中SHAN进行UPGMA(非加权组平均法)聚类分析，绘制各个品种间的亲缘关系聚类树状图。检测到各半糯型粳稻品种间遗传相似性的变异范围为0.471～0.897，遗传相似性系数最小值0.471在南粳7718和苏香粳100间检测到，表明二者亲缘关系最远；而在南粳9308和南粳9036间检测到遗传相似性最高值(0.897)，二者间存在5对引物对差异，差异引物对的数量占总引物对的数量的百分比在5％以上，高于相似品种的判定值。从聚类图上(图3)可以看出，34个半糯型粳稻品种间具有较大的遗传变异，54对引物对可以对本发明的34个半糯型粳稻品种进行明确地区分和辨别。
实施例2检测某一待测水稻品种是否为本发明的34个半糯型粳稻品种中的一种
一、试验材料
待测水稻品种DX为本发明的34个半糯型粳稻品种的一种或几种的疑似品种。
二、鉴定程序
(1)待测水稻品种DX的叶片基因组DNA提取
按照实施例1中的步骤三(1)的叶片基因组DNA的提取方法，将“34个半糯型粳稻品种的叶片”替换为“待测水稻品种DX的叶片”，其他步骤不变，得到待测水稻品种DX 的叶片基因组DNA。
(2)PCR扩增
按照实施例1中的步骤三(2)的PCR扩增方法，将“34个半糯型粳稻品种的叶片基因组DNA”替换为“待测水稻品种DX的叶片基因组DNA”，其他步骤不变，得到待测水稻品种DX在54对引物对上的PCR扩增产物。
(3)扩增条带分析、指纹图谱库构建
按照实施例1中的步骤三(3)和(4)的方法，对待测水稻品种DX的PCR扩增结果进行扩增条带电泳检测、有效特征化并进行0/1记录，获得待测水稻品种的DNA指纹图谱库。
(4)待测水稻品种与34个半糯型粳稻品种间的聚类分析
按照实施例1中的步骤三(5)的方法，将“34个半糯型粳稻品种”替换为“待测水稻品种DX和34个半糯型粳稻品种”，其他步骤不变，得到含有待测水稻品种DX的半糯型粳稻品种的聚类图，并根据聚类图找出与DX间遗传相似性最高的半糯型粳稻品种。
(5)待测水稻品种是否为真实半糯型粳稻品种的判断标准确定
根据农业行业标准(NYT1433-2014)《水稻品种鉴定技术规程SSR标记法》，将48 个SSR标记中大于等于2个标记差异的品种认为是不同品种，按照标记比率计算约为5％差异。在玉米及其他研究领域中亦将差异标记百分比5％作为品种真实性检测结果的判断标准。按本发明所述选用54对引物对，差异引物对的数量应为3作为待测水稻品种是否与遗传相似性最高的半糯型粳稻品种为同一品种的判定标准。
(a)如待测水稻品种DX与遗传相似性最高的半糯型粳稻品种间的差异引物对的数量为3对以上(包括3对)时，结论为待测水稻品种DX不属于本发明的34个半糯型粳稻品种中的任何一种，或者为待测水稻品种DX与本发明的遗传相似性最高的半糯型粳稻品种存在明显差异、属于不同品种；
(b)如待测水稻品种DX与遗传相似性最高的半糯型粳稻品种间的差异引物对的数量为2对以下(包括2对)时，结论为待测水稻品种DX与遗传相似性最高的半糯型粳稻品种为同一品种，或者为待测水稻品种DX与遗传相似性最高的半糯型粳稻品种间未检测到明显差异、属于同一品种。
请参见图3所示，待测水稻品种DX与半糯型粳稻品种南粳9108遗传相似性最高，二者存在的差异引物对的数量为2对以下，表明待测水稻品种DX与南粳9108没有明显差异，属于同一品种。
相比现有技术，本发明具有以下有益效果：
1、目前水稻品种真实性的分子鉴定大多是依据我国2014年发行的行业标准《NYT1433-2014-水稻品种鉴定技术规程SSR标记法》中的48个SSR标记，但是该套SSR 标记在籼、粳稻亚种间或籼稻品种间较适用，而在亲缘关系较近的栽培粳稻品种间表现出多态性差、干扰条带多、区分度低、重复性低等缺点。因此，对不同粳稻栽培品种进行准确分子鉴定和指纹图谱构建，需要寻找一条新途径。
2、本发明中筛选获得的54对引物对来自41个水稻重要性状控制基因的核心序列，41 个基因关联了品质(淀粉合成相关基因、分支酶基因、去分支酶基因)、香味、抗胁迫 (抗病、抗胁迫)、株型、粒性等多方位的水稻关键性状。因此在构建DNA指纹图谱库的同时，也链接了水稻重要性状的表型特征。并且引物对序列主要来自于基因的编码区，与基因组其他位置序列同源性低，因此具有低错配率、低成本、高稳定性、高重复性、高区分能力、高通量、操作简单等特点，不仅满足了半糯型粳稻品种的DNA指纹图谱库的构建，也可以满足其他类型水稻品种的指纹图谱数据构建的要求。
3、本发明中用于构建DNA指纹图谱库的半糯型粳稻品种均为目前长江中下游稻区生产上的主推优良食味品种，因此，构建的DNA指纹图谱库可直接用于指导生产上水稻品种和市场上品种品牌稻米的真实性鉴定。
4、本发明提供的由54对引物对组成的成套引物对可应用于水稻品种DNA指纹图谱构建、品种真实性鉴定、水稻种质资源区分以及水稻分子育种中，为水稻品种管理、种子和稻米市场监测、企业维权等提供科技支撑，确保粮食生产安全；同时为水稻分子育种中亲本重要基因资源分析奠定技术基础，通过标记辅助选择加快优质高产高抗水稻新品种的选育进程。
因此，本发明利用公共数据库中多个水稻品种基因组测序数据，针对水稻重要性状基因进行核心序列比较，筛选SNP位点和InDel位点，分别设计候选SNP四引物对和候选InDel引物对；利用候选SNP四引物对对半糯型粳稻品种进行PCR扩增，对PCR扩增谱带的特异性、多态性以及带型的易区分程度进行初筛，筛选出在不同半糯型粳稻品种间特征谱带清晰、有多态性且能够稳定重复的SNP四引物对，以SNP四引物对扩增得到的特征谱带将多个半糯型粳稻品种进行类群区分；利用候选InDel引物对进一步进行类群区分，直到把每个半糯型粳稻品种划分为一个类群为止，且最相似的两个半糯型粳稻品种间的差异引物对的数量占总引物对的数量的5％以上，在此过程中筛选出在不同半糯型粳稻品种间特征谱带清晰、有多态性且能够稳定重复的InDel引物对，SNP四引物对和InDel引物对构成用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对，可用于水稻品种DNA指纹图谱库构建、品种真实性鉴定、种质资源类群划分、水稻分子育种及其他相关研究中，为水稻种质资源和新品种保护提供技术支持。
综上所述，本发明的用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对能够用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库，能够用于半糯型粳稻品种的真伪和纯度鉴定，设计巧妙，使用简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对及其筛选方法和应用
<160> 144
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(26)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-1的正向引物IF
<400> 1
ggcattcggt ctaaccgaaa attgca 26
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(28)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-1的反向引物IR
<400> 2
cggtcttcac ttttcaaaga ccgaaccc 28
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(28)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-1的正向引物OF
<400> 3
acttgacacc gaatccgttt atcctccc 28
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(29)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-1的反向引物OR
<400> 4
tgttgaattt cagtcaagac cgagaccga 29
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(29)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-2的正向引物IF
<400> 5
cacggctcga accgcgacgg catcagtag 29
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(22)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-2的反向引物IR
<400> 6
atcacggcgg gcgccgacgg ct 22
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(26)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-2的正向引物OF
<400> 7
gcccgagcgc gtcgatcatc cggttc 26
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(28)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-2的反向引物OR
<400> 8
cggacctgga ggagatgctg cggcggtt 28
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(24)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-3的正向引物IF
<400> 9
ctcgcgcgcc cgctcccgcg ctga 24
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(28)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-3的反向引物IR
<400> 10
gcgctggagg agaagaccgc ggcgggcg 28
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(28)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-3的正向引物OF
<400> 11
gccttctcga gctccccgcg cgcccggt 28
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(28)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-3的反向引物OR
<400> 12
cgccgcggcg gcaggagggg aggaggag 28
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(33)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-4的正向引物IF
<400> 13
agaatgttga tctctgacaa tatcaagaag gta 33
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(25)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-4的反向引物IR
<400> 14
ctttgtggag gtccaaacat tgaga 25
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(28)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-4的正向引物OF
<400> 15
atgaaggctc aatgaagacc ttgagtag 28
<210> 16
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(28)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-4的反向引物OR
<400> 16
tcatcaagat actcaagcct gtgaagaa 28
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(28)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-5的正向引物IF
<400> 17
tttggcaata ccagacaact gtcttctt 28
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(25)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-5的反向引物IR
<400> 18
gccgtctggt tcaacaagat tatcg 25
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(25)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-5的正向引物OF
<400> 19
gaccagaccg gtctttcagt gagag 25
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(27)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-5的反向引物OR
<400> 20
aactcagaag aacatcacat tgggctc 27
<210> 21
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(33)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-6的正向引物IF
<400> 21
ggtaggggta ttgagattct ttacagttga ctg 33
<210> 22
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(29)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-6的反向引物IR
<400> 22
tccacatgta agtgacaaag gcattaggt 29
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(23)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-6的正向引物OF
<400> 23
ctcctaggcc tggttccact cgt 23
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(28)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-6的反向引物OR
<400> 24
gagtaggagg tgagtgaatg cttcaacc 28
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(22)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-7的正向引物IF
<400> 25
ccgcgggagg cggcggcgga ga 22
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(30)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-7的反向引物IR
<400> 26
cggaagaggg gtcgagctcg acgccgcagc 30
<210> 27
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(28)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-7的正向引物OF
<400> 27
agctgctggt gttggtggtg cggcggcg 28
<210> 28
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(28)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-7的反向引物OR
<400> 28
gagacggcgg cgaggagcga ctccggca 28
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(22)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-8的正向引物IF
<400> 29
gggaaaagct caacggcggc ga 22
<210> 30
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(26)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-8的反向引物IR
<400> 30
cattaggagc cacgtcagct ggctgc 26
<210> 31
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(28)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-8的正向引物OF
<400> 31
cacgtggaac ccacaagcca actagcaa 28
<210> 32
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(28)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-8的反向引物OR
<400> 32
gggtggggag aaggcgagca gttgtagt 28
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(23)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-9的正向引物IF
<400> 33
cgtggcgtgc gacgtgcagg ggt 23
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(23)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-9的反向引物IR
<400> 34
gccgggagcg ggttcgcgga ttg 23
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(25)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-9的正向引物OF
<400> 35
gtacctgtgc gcgtcgtgcg acgcg 25
<210> 36
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(28)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-9的反向引物OR
<400> 36
tccacctcct cgtccttgtc gccgagga 28
<210> 37
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(35)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-10的正向引物IF
<400> 37
ttattaatct acgtttaata ttttgaatgt gtttc 35
<210> 38
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(29)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-10的反向引物IR
<400> 38
agttttggtg tgtaacatca gatatagga 29
<210> 39
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(28)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-10的正向引物OF
<400> 39
aatcttttaa gcctaattgc tccataat 28
<210> 40
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(28)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-10的反向引物OR
<400> 40
aattgttcgt tttacatctt tatacgga 28
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(22)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-11的正向引物IF
<400> 41
ccgccgcgcg ctccaagtct cc 22
<210> 42
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(26)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-11的反向引物IR
<400> 42
cgaggtgttc cccggctgcc ggaaat 26
<210> 43
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(32)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-11的正向引物OF
<400> 43
ccagtagcag acaccacctg tcccattggg ga 32
<210> 44
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(28)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-11的反向引物OR
<400> 44
caggtgctcg gcgctcaacc acatggtt 28
<210> 45
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(30)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-12的正向引物IF
<400> 45
tttgacgaat ctagataagg agcctgtatg 30
<210> 46
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(32)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-12的反向引物IR
<400> 46
cctataatat aagggatttt ttagggaggg ct 32
<210> 47
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(30)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-12的正向引物OF
<400> 47
cgctataaag gttacgtaaa catatcgcag 30
<210> 48
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(28)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-12的反向引物OR
<400> 48
ttctttttgg aacggaggga gtaagtat 28
<210> 49
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(28)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-13的正向引物IF
<400> 49
atggcggacc aatctccggt gtgcaccc 28
<210> 50
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(25)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-13的反向引物IR
<400> 50
cgctcccagc agacctgcgg tgccc 25
<210> 51
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(28)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-13的正向引物OF
<400> 51
ccgctcatca caaccaaacc gccggctc 28
<210> 52
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(28)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-13的反向引物OR
<400> 52
gcagggcact gaccacctgc ctggtgga 28
<210> 53
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(33)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-14的正向引物IF
<400> 53
aaaaaaataa ttggagttac aatctaacat tac 33
<210> 54
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(29)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-14的反向引物IR
<400> 54
aagttctgca atttacagtg taaatacgt 29
<210> 55
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(28)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-14的正向引物OF
<400> 55
tacaaaatat ctggtatttg ttgaatgg 28
<210> 56
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(28)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-14的反向引物OR
<400> 56
cagcataaaa tgactgtaaa acgtaaac 28
<210> 57
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(22)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-15的正向引物IF
<400> 57
agtgccagcg gtggtggccg ca 22
<210> 58
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(34)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-15的反向引物IR
<400> 58
tcatgaactt cttgaaactg aatcatacct gagc 34
<210> 59
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(28)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-15的正向引物OF
<400> 59
aggaggcacc gctaggtggt gtgttcag 28
<210> 60
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(28)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-15的反向引物OR
<400> 60
aatcttgcat gccccttcag aaggacga 28
<210> 61
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(28)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-16的正向引物IF
<400> 61
atgttgtgtt cttgtgttct ttgcaggc 28
<210> 62
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(28)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-16的反向引物IR
<400> 62
gtagatcttc tcaccggtct ttccccaa 28
<210> 63
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(28)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-16的正向引物OF
<400> 63
gggtgaggtt tttccattgc tacaatcg 28
<210> 64
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(26)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-16的反向引物OR
<400> 64
gtcgatgaac acacggtcga ctcaat 26
<210> 65
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(29)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-17的正向引物IF
<400> 65
ttccctgttc aattgcagaa taatcaact 29
<210> 66
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(23)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-17的反向引物IR
<400> 66
aggaccctgc aagggttgtc tct 23
<210> 67
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(28)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-17的正向引物OF
<400> 67
accttttact ttgtagggca tgaaccct 28
<210> 68
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(28)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-17的反向引物OR
<400> 68
gaccagataa cctattctgg ccaaaaga 28
<210> 69
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(22)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-18的正向引物IF
<400> 69
cgcagcaggc ggcggtggtt gc 22
<210> 70
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(27)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-18的反向引物IR
<400> 70
cctgccaggg ttgcaacttc gccgaca 27
<210> 71
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(29)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-18的正向引物OF
<400> 71
tgacacatgc gatcgatgtg gcattggca 29
<210> 72
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(28)
<223> 水稻SNP四引物对SNP-18的反向引物OR
<400> 72
ggcgccggct cactagggac ttcctcgg 28
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(20)
<223> 水稻InDel引物对InDel-1的正向引物F
<400> 73
cgcggggtgg cgacgacaac 20
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(20)
<223> 水稻InDel引物对InDel-1的反向引物R
<400> 74
accgcctata gaccaacgac 20
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(21)
<223> 水稻InDel引物对InDel-2的正向引物F
<400> 75
ggaagggatc cgtaatacaa a 21
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(20)
<223> 水稻InDel引物对InDel-2的反向引物R
<400> 76
cccatatcta catgacggtt 20
<210> 77
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(16)
<223> 水稻InDel引物对InDel-3的正向引物F
<400> 77
ggaaatggga gtcgcc 16
<210> 78
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(17)
<223> 水稻InDel引物对InDel-3的反向引物R
<400> 78
cgaagaaacc acgctca 17
<210> 79
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(19)
<223> 水稻InDel引物对InDel-4的正向引物F
<400> 79
caatatgcct gaagtccac 19
<210> 80
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(19)
<223> 水稻InDel引物对InDel-4的反向引物R
<400> 80
tgtgctcaat tgctagctt 19
<210> 81
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(22)
<223> 水稻InDel引物对InDel-5的正向引物F
<400> 81
ccaaaacgac ttactttaga gc 22
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(21)
<223> 水稻InDel引物对InDel-5的反向引物R
<400> 82
ttcctccgta ctcataagag c 21
<210> 83
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(18)
<223> 水稻InDel引物对InDel-6的正向引物F
<400> 83
ctcgatcccc tagctctc 18
<210> 84
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(18)
<223> 水稻InDel引物对InDel-6的反向引物R
<400> 84
tcacctcgtt ctcgatcc 18
<210> 85
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(22)
<223> 水稻InDel引物对InDel-7的正向引物F
<400> 85
ccagtgtcgc cttctccggc tt 22
<210> 86
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(22)
<223> 水稻InDel引物对InDel-7的反向引物R
<400> 86
ggggaaacga gacggcggtc ca 22
<210> 87
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(22)
<223> 水稻InDel引物对InDel-8的正向引物F
<400> 87
tatgtgcagc gttcattgac ct 22
<210> 88
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(21)
<223> 水稻InDel引物对InDel-8的反向引物R
<400> 88
agggtcagtc ataacctcag t 21
<210> 89
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(21)
<223> 水稻InDel引物对InDel-9的正向引物F
<400> 89
agcagcaaac atccaaaggc a 21
<210> 90
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(21)
<223> 水稻InDel引物对InDel-9的反向引物R
<400> 90
gggtgtcaag tcgaatccag c 21
<210> 91
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(20)
<223> 水稻InDel引物对InDel-10的正向引物F
<400> 91
gataaccatc ggtaattgct 20
<210> 92
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(21)
<223> 水稻InDel引物对InDel-10的反向引物R
<400> 92
ggcaatcatg aagattcgaa g 21
<210> 93
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(23)
<223> 水稻InDel引物对InDel-11的正向引物F
<400> 93
ggaacaattg gttaaatact tca 23
<210> 94
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(22)
<223> 水稻InDel引物对InDel-11的反向引物R
<400> 94
agaaaaaatt ggatctttgt ca 22
<210> 95
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(23)
<223> 水稻InDel引物对InDel-12的正向引物F
<400> 95
tccgaatata tttctggatt gtg 23
<210> 96
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(20)
<223> 水稻InDel引物对InDel-12的反向引物R
<400> 96
ggaaaaataa taatggcttc 20
<210> 97
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(20)
<223> 水稻InDel引物对InDel-13的正向引物F
<400> 97
agcaggttat aagctaggcc 20
<210> 98
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(20)
<223> 水稻InDel引物对InDel-13的反向引物R
<400> 98
ctaccaacaa gttcatcaaa 20
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(20)
<223> 水稻InDel引物对InDel-14的正向引物F
<400> 99
gtgcgtgacc ctttgctgtt 20
<210> 100
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(22)
<223> 水稻InDel引物对InDel-14的反向引物R
<400> 100
atcttccagg ttccaattct tc 22
<210> 101
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(19)
<223> 水稻InDel引物对InDel-15的正向引物F
<400> 101
cggggcataa acttcacct 19
<210> 102
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(23)
<223> 水稻InDel引物对InDel-15的反向引物R
<400> 102
attactccca aatgtttgtc gat 23
<210> 103
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(19)
<223> 水稻InDel引物对InDel-16的正向引物F
<400> 103
taactgactc ctttggcta 19
<210> 104
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(21)
<223> 水稻InDel引物对InDel-16的反向引物R
<400> 104
tatatgcatg aagaacatgt c 21
<210> 105
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(21)
<223> 水稻InDel引物对InDel-17的正向引物F
<400> 105
gaacaatgcc caaacttgag a 21
<210> 106
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(20)
<223> 水稻InDel引物对InDel-17的反向引物R
<400> 106
gggtccacat gtcagtgagc 20
<210> 107
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(20)
<223> 水稻InDel引物对InDel-18的正向引物F
<400> 107
cgtcttgcaa ccaacgccga 20
<210> 108
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(22)
<223> 水稻InDel引物对InDel-18的反向引物R
<400> 108
gagcgtgtgt agggaaggag ct 22
<210> 109
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(22)
<223> 水稻InDel引物对InDel-19的正向引物F
<400> 109
aagcaatgta agttcaagta gc 22
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(20)
<223> 水稻InDel引物对InDel-19的反向引物R
<400> 110
gattagggat gatggttttc 20
<210> 111
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(18)
<223> 水稻InDel引物对InDel-20的正向引物F
<400> 111
gggaggcgct gaagagga 18
<210> 112
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(22)
<223> 水稻InDel引物对InDel-20的反向引物R
<400> 112
gggtagtcac caccctacct tg 22
<210> 113
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(19)
<223> 水稻InDel引物对InDel-21的正向引物F
<400> 113
ataccccatc aatcgaaat 19
<210> 114
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(20)
<223> 水稻InDel引物对InDel-21的反向引物R
<400> 114
gaaaaggaca acattgagaa 20
<210> 115
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(23)
<223> 水稻InDel引物对InDel-22的正向引物F
<400> 115
cttctatcca ttccttaatc cca 23
<210> 116
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(22)
<223> 水稻InDel引物对InDel-22的反向引物R
<400> 116
atgctattga tgttaagagg gc 22
<210> 117
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(24)
<223> 水稻InDel引物对InDel-23的正向引物F
<400> 117
tgctacataa cacgcataca aagt 24
<210> 118
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(23)
<223> 水稻InDel引物对InDel-23的反向引物R
<400> 118
agacaaaagc gaaaggtaat gag 23
<210> 119
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(22)
<223> 水稻InDel引物对InDel-24的正向引物F
<400> 119
gtggggaaaa caagtaagtc tg 22
<210> 120
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(22)
<223> 水稻InDel引物对InDel-24的反向引物R
<400> 120
agttccatca gaagaatcag gg 22
<210> 121
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(20)
<223> 水稻InDel引物对InDel-25的正向引物F
<400> 121
gtcgccgccg tcgtcagcac 20
<210> 122
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(19)
<223> 水稻InDel引物对InDel-25的反向引物R
<400> 122
agctctgcct ccgtccctt 19
<210> 123
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(23)
<223> 水稻InDel引物对InDel-26的正向引物F
<400> 123
ccatcacctc aaatacatca ctc 23
<210> 124
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(20)
<223> 水稻InDel引物对InDel-26的反向引物R
<400> 124
agactggaat gccccttagg 20
<210> 125
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(25)
<223> 水稻InDel引物对InDel-27的正向引物F
<400> 125
ccaataccgt aaactagcga ctatg 25
<210> 126
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(22)
<223> 水稻InDel引物对InDel-27的反向引物R
<400> 126
tacaggtaga atggcagtgg tg 22
<210> 127
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(24)
<223> 水稻InDel引物对InDel-28的正向引物F
<400> 127
gcactcctgc ctgtttatct gaag 24
<210> 128
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(24)
<223> 水稻InDel引物对InDel-28的反向引物R
<400> 128
gtcgtacagc ttgaagtgat ccag 24
<210> 129
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(19)
<223> 水稻InDel引物对InDel-29的正向引物F
<400> 129
ggttctcggt gaagatggc 19
<210> 130
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(19)
<223> 水稻InDel引物对InDel-29的反向引物R
<400> 130
gtggtcccag ctgaggtcc 19
<210> 131
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(20)
<223> 水稻InDel引物对InDel-30的正向引物F
<400> 131
ctttgatagt tcgaatggtt 20
<210> 132
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(20)
<223> 水稻InDel引物对InDel-30的反向引物R
<400> 132
caatgtttct ccgtgatgat 20
<210> 133
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(23)
<223> 水稻InDel引物对InDel-31的正向引物F
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gaacttgtgc cttaagctga ctg 23
<210> 134
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(22)
<223> 水稻InDel引物对InDel-31的反向引物R
<400> 134
ggaatagtaa gccgaaggac tt 22
<210> 135
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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<222> (1)...(22)
<223> 水稻InDel引物对InDel-32的正向引物F
<400> 135
aagtccttcg gcttactatt cc 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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<221> misc_feature
<222> (1)...(22)
<223> 水稻InDel引物对InDel-32的反向引物R
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ggagaaggaa cataacaggg ac 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<222> (1)...(20)
<223> 水稻InDel引物对InDel-33的正向引物F
<400> 137
gaccaaccga ttaccttctt 20
<210> 138
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<222> (1)...(20)
<223> 水稻InDel引物对InDel-33的反向引物R
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ttgctctttt ctcaacctgt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<222> (1)...(19)
<223> 水稻InDel引物对InDel-34的正向引物F
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tacgctatgc tcttgaaac 19
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<212> DNA
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<220>
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<222> (1)...(20)
<223> 水稻InDel引物对InDel-34的反向引物R
<400> 140
tatcttccca gtaaccatca 20
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<212> DNA
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<222> (1)...(22)
<223> 水稻InDel引物对InDel-35的正向引物F
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<220>
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<222> (1)...(20)
<223> 水稻InDel引物对InDel-35的反向引物R
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tctccttgaa cagcgacagc 20
<210> 143
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<222> (1)...(23)
<223> 水稻InDel引物对InDel-36的正向引物F
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caccaattat attagcgtgc tcc 23
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<212> DNA
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<223> 水稻InDel引物对InDel-36的反向引物R
<400> 144
cgtggctctt ggctctcttg 20
Claims (10)
1.一种用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对，其特征在于，所述的用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对包括18对SNP四引物对和36对InDel引物对，18对所述SNP四引物对分别特异性检测18个水稻SNP位点SNPjs0001～SNPjs0018，36对所述InDel引物对分别特异性检测36个水稻InDel位点InDeljs0001～InDeljs0036。
2.根据权利要求1所述的用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对，其特征在于，每对所述SNP四引物对分别包括SNP正向内引物、SNP反向内引物、SNP正向外引物和SNP反向外引物，18对所述SNP四引物对的序列依次如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：72所示，每对所述InDel引物对分别包括InDel正向引物和InDel反向引物，36对所述InDel引物对的序列依次如SEQ ID NO:73～SEQ ID NO:144所示。
3.一种用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)利用公共数据库中多个水稻品种基因组测序数据，针对水稻重要性状基因进行核心序列比较，筛选SNP位点和InDel位点，针对所述SNP位点设计候选SNP四引物对，针对所述InDel位点设计候选InDel引物对；
(2)分别提取多个半糯型粳稻品种的叶片基因组DNA，利用所述候选SNP四引物对对每个所述半糯型粳稻品种的所述叶片基因组DNA进行PCR扩增获得PCR扩增产物，将所述PCR扩增产物进行电泳条带检测，获得PCR扩增谱带，对所述PCR扩增谱带的特异性、多态性以及带型的易区分程度进行初筛，筛选出在不同所述半糯型粳稻品种间特征谱带清晰、有多态性且能够稳定重复的SNP四引物对，以所述SNP四引物对扩增得到的所述特征谱带将多个所述半糯型粳稻品种进行类群区分获得初步区分结果；
(3)利用所述候选InDel引物对进一步对根据所述初步区分结果获得的每个初步类群的所述半糯型粳稻品种进行类群区分，直到把每个所述半糯型粳稻品种划分为一个类群为止，且最相似的两个所述半糯型粳稻品种间的差异引物对的数量占总引物对的数量的5％以上，在此过程中筛选出在不同所述半糯型粳稻品种间特征谱带清晰、有多态性且能够稳定重复的InDel引物对，所述SNP四引物对和所述InDel引物对构成所述的用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对。
4.根据权利要求3所述的用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对的筛选方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述公共数据库为NCBI基因组数据库和RiceGenome Annotation Project数据库；多个所述水稻品种是日本晴、9311、苏御糯、明恢63、桂朝2；所述水稻重要性状基因包括淀粉去分支酶基因II、淀粉合酶基因II、松散株型基因LPA1、抽穗期基因Hd6、水稻抗胁迫基因OsLecRK1、籽粒体型控制基因GIF1、水稻淀粉调节因子RSR1、G蛋白基因RGA1、抽穗期基因Hd1、千粒重基因TGW6、胚乳蛋白基因RAG2、抽穗期控制基因Ghd7、抽穗期基因Ghd8、淀粉合成酶基因III、颗粒型淀粉合酶基因GBSSI、抽穗期基因OsFCA、抽穗期基因Ehd2、低直链淀粉含量基因du3、类CO基因Ghd2、淀粉分支酶基因I、落粒性基因OsYABBY2、酪蛋白激酶CKI、MADS转录因子、水稻抗胁迫基因OsLecRK1、谷氨酰胺合成酶基因OsGS2、粒型基因GW5、直立型密穗基因DEP2、抽穗期控制基因DTH7、稻瘟病抗性基因Pita、早穗基因Ehd3、组蛋白甲基转移酶SDG724、早穗基因Ehd1、稻瘟病抗性基因Pib、粒型基因GW5、淀粉合成基因II、香味基因BADH2、淀粉合成酶基因I、淀粉合酶基因IIb、淀粉分支酶基因IV、ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因和淀粉分支酶基因III。
5.根据权利要求3所述的用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对的筛选方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，多个所述半糯型粳稻品种包括南粳46、南粳5055、南粳9108、南粳晶谷、南粳505、南粳58、南粳2728、南粳5718、南粳518、南粳3908、南粳56、南粳5713、中江粳9008、南粳5818、南粳9308、南粳7718、南粳9036、嘉58、苏香粳3号、宁粳8号、苏香粳100、松早香1号、沪早香软1号、嘉农早香、沪软1212、松香粳1018、嘉农粳6号、宁香粳9号、扬农香28、早香粳1号、金香玉1号、丰粳1606、常香粳1813、武香粳113和徐稻9号；所述SNP四引物对的数目为18对，每对所述SNP四引物对分别包括SNP正向内引物、SNP反向内引物、SNP正向外引物和SNP反向外引物，18对所述SNP四引物对的序列依次如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：72所示。
6.根据权利要求3所述的用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对的筛选方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述InDel引物对的数目为36对，每对所述InDel引物对分别包括InDel正向引物和InDel反向引物，36对所述InDel引物对的序列依次如SEQID NO:73～SEQ ID NO:144所示。
7.一种半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(A)分别提取多个半糯型粳稻品种的叶片基因组DNA；
(B)采用根据权利要求1～权利要求2中任一项所述的用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对对每个所述半糯型粳稻品种的所述叶片基因组DNA进行PCR扩增、电泳成像和扩增条带有效特征化，按照所述的用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对的顺序依次对特征化条带进行编号，对所述特征化条带按所述编号进行0/1记录，得到每个所述半糯型粳稻品种的DNA特征指纹图谱；
(C)对所述DNA特征指纹图谱进行汇总，获得所述半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库。
8.根据权利要求7所述的半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的构建方法，其特征在于，在所述步骤(A)中，多个所述半糯型粳稻品种包括南粳46、南粳5055、南粳9108、南粳晶谷、南粳505、南粳58、南粳2728、南粳5718、南粳518、南粳3908、南粳56、南粳5713、中江粳9008、南粳5818、南粳9308、南粳7718、南粳9036、嘉58、苏香粳3号、宁粳8号、苏香粳100、松早香1号、沪早香软1号、嘉农早香、沪软1212、松香粳1018、嘉农粳6号、宁香粳9号、扬农香28、早香粳1号、金香玉1号、丰粳1606、常香粳1813、武香粳113和徐稻9号。
9.一种对待测水稻品种进行半糯型粳稻品种鉴定的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(I)提取所述待测水稻品种的叶片基因组DNA；
(II)采用根据权利要求1或权利要求2所述的用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对对所述待测水稻品种的所述叶片基因组DNA进行PCR扩增、电泳成像和扩增条带有效特征化，按照所述的用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对的顺序依次对特征化条带进行编号，对所述特征化条带按所述编号进行0/1记录，建立所述待测水稻品种的DNA指纹图谱库；
(III)将所述的待测水稻品种的DNA指纹图谱库与采用根据权利要求7或权利要求8所述的半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的构建方法构建而成的所述半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库合并，绘制聚类图，判定与所述待测水稻品种遗传相似性最高的所述目标半糯型粳稻品种；
(IV)当所述待测水稻品种与所述目标半糯型粳稻品种间的差异引物对的数量为3个以上时，则判定所述待测水稻品种与所述目标半糯型粳稻品种存在明显差异、属于不同品种；当所述待测水稻品种与所述目标半糯型粳稻品种间的差异引物对的数量为2个以下时，则判定所述待测水稻品种与所述目标半糯型粳稻品种为同一品种或近似品种。
10.根据权利要求1～权利要求2中任一项所述的用于构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库的成套引物对在构建半糯型粳稻品种DNA指纹图谱库、鉴定水稻品种或分子育种中的应用。
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