CN103571956A - 采用特异性引物pcr检测柴胡和狭叶柴胡的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种采用特异性引物PCR检测柴胡（北柴胡）和狭叶柴胡（南柴胡或红柴胡）的方法，其是基于柴胡、狭叶柴胡的ITS序列，设计出可快速检测柴胡、狭叶柴胡的特异性引物，并在此基础上建立了PCR检测体系，分别扩增出336bp和407bp的PCR片段，为柴胡、狭叶柴胡的药材鉴别提供了分子鉴定依据，可从多种中成药（蜜丸、水蜜丸）及药材中快速、准确地检测出是否含有柴胡或狭叶柴胡。根据该方法构建的检测试剂盒具有操作简便、特异性好、灵敏度高、无需测序等优点，可实现对柴胡、狭叶柴胡的茎、叶或植物其它部位以及药材和中成药（蜜丸、水蜜丸）的检测。

Description

采用特异性引物PCR检测柴胡和狭叶柴胡的方法

技术领域

本发明涉及柴胡和狭叶柴胡的分子生物学检测，具体地说，涉及一种采用特异性引物PCR检测柴胡和狭叶柴胡的方法。

背景技术

柴胡，为伞形科（Umbelliferae)芹亚科（Apioideae)柴胡属（Bupleurum L.）植物，始载于《神农本草经》，列为上品，是我国常用的大宗中药材。味辛、苦，性微寒，归肝、胆、肺经，具有疏散退热、疏肝结语、升举阳气的功效，用于治疗感冒发热、寒热往来、胸胁胀痛、月经不调、子宫脱垂，脱肛等症。《中国药典》（2010版）收载的柴胡为柴胡（Bupleurumchinense DC.）、狭叶柴胡（Bupleurum scorzonerifolium Willd.）的干燥根。现代药理研究表明，具有解热、抗炎、抗病毒、抗细菌内毒、抗肿瘤、保肝、降血脂、抗惊厥、提高免疫力等功效。柴胡在中药制药等方面有重要应用，其内含有皂苷、挥发油、多糖、黄酮类、柴胡醇等多种成分，在解热、抗病毒、提高免疫力等方面效果明显。但柴胡属植物种类繁多，全球有120种，我国有40种17变种，仅供药用的柴胡属植物就有近30种。而且遍布全国各地有很多的习用品以及混伪品，如西北地区已开发5种柴胡，云南也发展了8种柴胡属植物为药用。

由于柴胡及狭叶柴胡的近似种以及混伪品过多，针对柴胡的基源和药材进行过深入的研究。传统的鉴定方法包括：基源鉴定、性状鉴定、显微鉴定以及理化鉴定等，现代的鉴别方法包括色谱法、质谱法、核磁共振法、差热分析法、扫描电镜技术、电泳等。柴胡及狭叶柴胡与柴胡属内其它种性状相似，形态学以及一些理化方法很难准确的鉴别其基源。而随着现代分子生物学研究的深入和发展，一些分子标记技术如限制性片段长度多态性（RFLP）分析、随机扩增多态DNA（RAPD）分析、间断简单序列重复（ISSR）标记、扩增片段长度多态性（AFLP）分析等技术得到了广泛的应用，但它们也存在着很多的不足。RFLP技术稳定、重复性强，但探针制备繁琐；RAPD方法可以很好的解释亲缘物种间的演化关系，但不稳定，受实验条件限制较大；ISSR标记具有快速、简便、多态性高等优点，但其引物通用性差、扩增条件等需要针对性的设计；AFLP技术将RFLP和PCR技术完美结合，但其稳定性较差，且对操作者要求高、花费大。

本发明结合以上方法和技术的优点，依据分子标记技术的原理和原则，设计出一个特异性的引物，目的是提出一种特异性鉴定柴胡和狭叶柴胡的分子鉴别方法，为柴胡和狭叶柴胡的药材、中成药（蜜丸、水蜜丸）鉴定提供分子水平依据，并希望得到广泛的实际应用推广。

发明内容

本发明的目的是提供一种可快速、准确地检测柴胡和狭叶柴胡的特异性引物及含有该引物的试剂盒。

本发明的另一目的是提供采用上述特异性引物PCR检测柴胡和狭叶柴胡的方法。

为了实现本发明目的，本发明提供的一种柴胡（Bupleurum chinense DC.）的PCR检测特异性引物对，其包括上游引物上游引物F1:5’-ATGCCTCCGCCCCGTTTGG-3’和下游引物R1:5’-TGCGTTTTCC GATCTCCGGT-3’。

为了实现本发明目的，本发明提供的一种狭叶柴胡（Bupleurum scorzonerifolium Willd.）的PCR检测特异性引物对，其包括上游引物F2:5’-TGTCGTCGGCCTCGGCCTG-3’和下游引物R2:5’-ACGACGAGGCACGGGAGGT-3’。

本发明还提供含有上述PCR引物对的用于检测柴胡和狭叶柴胡的试剂盒。

前述试剂盒中还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液。

更优选地，前述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明还提供所述试剂盒在检测柴胡和狭叶柴胡中的应用。

本发明进一步采用上述特异性引物PCR检测柴胡（或狭叶柴胡）的方法，包括以下步骤：

1）提取样品中的DNA；

2）以步骤1）中提取的DNA为模板，使用上述引物F1-R1（或F2-R2），进行PCR扩增反应；

3）分析PCR产物，即对上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳检测结果判定样品中是否含有柴胡（或狭叶柴胡）。

其中，PCR扩增反应体系以25μl计为：

PCR反应条件为：93℃5min；93℃30s，60℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃5minn，10℃10min。

扩增反应结束后，若电泳检测结果分别出现约336bp（或407bp）的DNA条带，则该样品中分别含有柴胡（或狭叶柴胡）。

本发明基于柴胡和狭叶柴胡的ITS序列，设计出可快速检测柴胡和狭叶柴胡的特异性引物，并在此基础上建立了PCR检测体系，为柴胡和狭叶柴胡的鉴别提供了分子鉴定依据，可从多种药材、中成药（蜜丸、水蜜丸）中快速、准确地检测出柴胡和狭叶柴胡。根据该方法构建的检测试剂盒操作简便，特异性好，灵敏度高，可实现对柴胡、狭叶柴胡的茎、叶或植物其它部位，药材以及中成药的检测，适于广泛的推广使用。

附图说明

图1是利用柴胡和狭叶柴胡的ITS序列扩增条带的琼脂糖凝胶电泳图，其中：1为柴胡条带，336bp；2为狭叶柴胡条带，407bp；M为DNA marker，2000bp；K为阴性对照。

图2是利用柴胡F1-R1引物和狭叶柴胡F2-R2引物所扩增条带的琼脂糖凝胶电泳图，其中：1-5号是DNA稀释浓度为1.811、0.905、0.603、0.452、0.362ng/μl的柴胡条带，336bp；6-9号是DNA稀释浓度为0.993、0.496、0.331、0.248ng/μl的狭叶柴胡条带，407bp；M为DNA marker，2000bp；K为阴性对照。

图3是利用柴胡F1-R1引物所扩增条带的琼脂糖凝胶电泳图，其中：1-5号是对应表1中1-5号药材的柴胡DNA扩增条带，336bp；M为DNA marker，2000bp；K为阴性对照。

图4是利用柴胡F1-R1引物和狭叶柴胡F2-R2引物所扩增条带的琼脂糖凝胶电泳图，其中：1-5号是对应表2中成药的柴胡DNA扩增条带，336bp；6-10号是对应表2中成药的狭叶柴胡DNA扩增条带，没有扩增成功；M为DNA marker，2000bp；K为阴性对照。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

若未特别指明，以下实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（NewYork:Gold Spring Harbor Laboratory Press,1989）中所述的操作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验条件；所用原料均为市售商品。

实施例1用于检测柴胡和狭叶柴胡的PCR引物的合成

从GenBank中共获得柴胡、狭叶柴胡等柴胡属ITS序列12条，利用生物学软件DNAMANversion4.0对比上述序列，找出柴胡、狭叶柴胡所有不同于其他种的变异位点。根据变异位点的位置，分别在ITS序列的上、下游各设计约20个碱基的引物；利用生物学软件Primer5.0对设计的引物进行分析，最终分别确定柴胡合适的引物对，上游引物F1:5’-ATGCCTCCGCCCCGTTTGG-3’和下游引物R1:5’-TGCGTTTTCC GATCTCCGGT-3’；狭叶柴胡合适的引物对，上游引物F2:5’-TGTCGTCGGCCTCGGCCTG-3’和下游引物R2:5’-ACGACGAGGCACGGGAGGT-3’。

引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

实施例2利用PCR引物检测柴胡的特异性和灵敏度分析

1.1样本来源

本实施例中采用的药材样品有：柴胡，采自山西浑源。

1.2DNA提取

将上述样品，每个样品取约60mg，用液氮研磨成粉末，利用试剂盒法提取DNA。试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司，型号为：CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒（货号：DN14），50次。

1.3样品DNA的梯度稀释

检测上述提取的柴胡药材的DNA浓度，为181.1ng/μl。将DNA样品进行梯度稀释，稀释后的浓度为1.811、0.905、0.603、0.452、0.362ng/μl，于-20℃保存备用。

1.4PCR反应

反应体系（25μl）：

PCR反应条件为：93℃5min；93℃30s，60℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃5minn，10℃10min。

1.5结果

取扩增产物5μl，在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，电压为130V，23min后在紫外光下检测电泳结果，出现约336bp的条带，证明所检样品为柴胡或含有柴胡。电泳检测结果如图1所示。上述结果表明实施例1中设计的引物特异性强。

分别以上述稀释的DNA样品为模板进行PCR扩增反应。PCR扩增程序和扩增产物检测方法同上（点样量为5μl）。结果如图2所示，当柴胡DNA模板稀释至0.362ng/μl时，PCR扩增的条带不明显。因此，上述引物对对柴胡的检测灵敏度可达0.362ng/μl，即可检出样品中约1.8ng的柴胡，检测灵敏度高。

实施例3利用PCR引物检测狭叶柴胡的特异性和灵敏度分析

1.1样本来源

本实施例中采用的药材样品有：狭叶柴胡，采自黑龙江林甸。

1.2DNA提取

同实施例2的1.2。

1.3样品DNA的梯度稀释

检测上述提取的狭叶柴胡药材的DNA浓度，为99.3ng/μl。将DNA样品进行梯度稀释，稀释后的浓度为0.993、0.496、0.331、0.248ng/μl，于-20℃保存备用。

1.4PCR反应

除所用引物（F2-R2）不同外，余皆同实施例2的1.4。

1.5结果

检测方法同实施例2的1.5。

出现约407bp的条带，证明所检样品为狭叶柴胡或含有狭叶柴胡。电泳检测结果如图1所示。上述结果表明实施例1中设计的引物特异性强。

如图2所示，当狭叶柴胡DNA模板稀释至0.248ng/μl时，PCR扩增的条带不明显。因此，上述引物对对狭叶柴胡的检测灵敏度可达0.248ng/μl，即可检出样品中约1.2ng的狭叶柴胡，检测灵敏度高。

实施例4利用PCR引物检测不同产地的柴胡样品

1.1本实施例中采用的药材样分别采集不同产地的5种柴胡（见表1），每个样品取约100mg，用液氮研磨成粉末，利用试剂盒法提取DNA。试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司，型号为：CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒（货号：DN14），50次。

表1

1.2使用ITS通用引物ITS5F：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’和ITS4R：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’分别进行PCR检测提取的各DNA样品的质量。

PCR反应体系：

PCR反应条件为：93℃5min；93℃30s，60℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃5minn，10℃10min。

设置空白对照，DNA模板用等量ddH₂O代替，证明DNA的质量达到检测的要求，并确定了合适的DNA模板量为5μL。

1.3利用实施例1设计的特异性引物F1-R1，对5个样品的总DNA进行PCR扩增，PCR反应体系和扩增条件如下：

PCR反应体系（25μL）：

PCR反应条件为：93℃5min；93℃30s，60℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃5minn，10℃10min。

1.4取PCR扩增产物，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在凝胶成像仪上检测结果。结果如图3所示。

实施例5利用PCR引物检测市售的含柴胡或狭叶柴胡的中成药样品

1.1从同仁堂（山西省太原市长风店）购买不同厂家生产的3种含柴胡或狭叶柴胡的中成药样品（见表2），每个样品取约100mg，用液氮研磨成粉末，利用试剂盒法提取DNA。试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司，型号为：CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒（货号：DN14），50次。

表2

1.2使用ITS通用引物ITS5F：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’和ITS4R：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’分别进行PCR检测提取的各DNA样品的质量。

PCR反应体系：

PCR反应条件为：93℃5min；93℃30s，60℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃5minn，10℃10min。

设置空白对照，DNA模板用等量ddH₂O代替，证明DNA的质量达到检测的要求，并确定了合适的DNA模板量为5μL。

1.3利用实施例1设计的特异性引物F1-R1，对5个样品的总DNA进行PCR扩增，PCR反应体系和扩增条件如下：

PCR反应体系（25μL）：

PCR反应条件为：93℃5min；93℃30s，60℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃5minn，10℃10min。

1.4利用实施例1设计的特异性引物F2-R2，对5个样品的总DNA进行PCR扩增，PCR反应体系和扩增条件，除所用引物（F2-R2）不同外，余皆同实施例5的1.3。

1.5取PCR扩增产物，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在凝胶成像仪上检测结果。结果如图4所示。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.柴胡（Bupleurum chinense DC.）的PCR检测特异性引物对，特征在于其是：

上游引物F1:5’-ATGCCTCCGC CCCGTTTGG-3’和

下游引物R1:5’-TGCGTTTTCC GATCTCCGGT-3’。

2.狭叶柴胡（Bupleurum scorzonerifolium Willd.）的PCR检测特异性引物对，特征在于其是：

上游引物F2:5’-TGTCGTCGGC CTCGGCCTG-3’和

下游引物R2:5’-ACGACGAGGC ACGGGAGGT-3’。

3.含有权利要求1所述引物对的用于检测柴胡的试剂盒。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺和PCR反应缓冲液。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

6.采用权利要求1所述的特异性引物PCR检测柴胡的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）提取样品中的DNA；

2）以步骤1）中提取的DNA为模板，使用权利要求1所述的引物F1和R1，进行PCR扩增反应；

3）用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，确认是否为柴胡。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，PCR扩增反应体系以25μL计为：

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反应条件为：93℃5min；93℃30s，60℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃5minn，10℃10min。

9.权利要求3-5任一项所述的试剂盒在检测柴胡中的应用。

10.含有权利要求2所述引物对的用于检测柴胡的试剂盒。

Images