CN103571956A - 采用特异性引物pcr检测柴胡和狭叶柴胡的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种采用特异性引物PCR检测柴胡(北柴胡)和狭叶柴胡(南柴胡或红柴胡)的方法,其是基于柴胡、狭叶柴胡的ITS序列,设计出可快速检测柴胡、狭叶柴胡的特异性引物,并在此基础上建立了PCR检测体系,分别扩增出336bp和407bp的PCR片段,为柴胡、狭叶柴胡的药材鉴别提供了分子鉴定依据,可从多种中成药(蜜丸、水蜜丸)及药材中快速、准确地检测出是否含有柴胡或狭叶柴胡。根据该方法构建的检测试剂盒具有操作简便、特异性好、灵敏度高、无需测序等优点,可实现对柴胡、狭叶柴胡的茎、叶或植物其它部位以及药材和中成药(蜜丸、水蜜丸)的检测。
Description
技术领域
本发明涉及柴胡和狭叶柴胡的分子生物学检测,具体地说,涉及一种采用特异性引物PCR检测柴胡和狭叶柴胡的方法。
背景技术
柴胡,为伞形科(Umbelliferae)芹亚科(Apioideae)柴胡属(Bupleurum L.)植物,始载于《神农本草经》,列为上品,是我国常用的大宗中药材。味辛、苦,性微寒,归肝、胆、肺经,具有疏散退热、疏肝结语、升举阳气的功效,用于治疗感冒发热、寒热往来、胸胁胀痛、月经不调、子宫脱垂,脱肛等症。《中国药典》(2010版)收载的柴胡为柴胡(Bupleurumchinense DC.)、狭叶柴胡(Bupleurum scorzonerifolium Willd.)的干燥根。现代药理研究表明,具有解热、抗炎、抗病毒、抗细菌内毒、抗肿瘤、保肝、降血脂、抗惊厥、提高免疫力等功效。柴胡在中药制药等方面有重要应用,其内含有皂苷、挥发油、多糖、黄酮类、柴胡醇等多种成分,在解热、抗病毒、提高免疫力等方面效果明显。但柴胡属植物种类繁多,全球有120种,我国有40种17变种,仅供药用的柴胡属植物就有近30种。而且遍布全国各地有很多的习用品以及混伪品,如西北地区已开发5种柴胡,云南也发展了8种柴胡属植物为药用。
由于柴胡及狭叶柴胡的近似种以及混伪品过多,针对柴胡的基源和药材进行过深入的研究。传统的鉴定方法包括:基源鉴定、性状鉴定、显微鉴定以及理化鉴定等,现代的鉴别方法包括色谱法、质谱法、核磁共振法、差热分析法、扫描电镜技术、电泳等。柴胡及狭叶柴胡与柴胡属内其它种性状相似,形态学以及一些理化方法很难准确的鉴别其基源。而随着现代分子生物学研究的深入和发展,一些分子标记技术如限制性片段长度多态性(RFLP)分析、随机扩增多态DNA(RAPD)分析、间断简单序列重复(ISSR)标记、扩增片段长度多态性(AFLP)分析等技术得到了广泛的应用,但它们也存在着很多的不足。RFLP技术稳定、重复性强,但探针制备繁琐;RAPD方法可以很好的解释亲缘物种间的演化关系,但不稳定,受实验条件限制较大;ISSR标记具有快速、简便、多态性高等优点,但其引物通用性差、扩增条件等需要针对性的设计;AFLP技术将RFLP和PCR技术完美结合,但其稳定性较差,且对操作者要求高、花费大。
本发明结合以上方法和技术的优点,依据分子标记技术的原理和原则,设计出一个特异性的引物,目的是提出一种特异性鉴定柴胡和狭叶柴胡的分子鉴别方法,为柴胡和狭叶柴胡的药材、中成药(蜜丸、水蜜丸)鉴定提供分子水平依据,并希望得到广泛的实际应用推广。
发明内容
本发明的目的是提供一种可快速、准确地检测柴胡和狭叶柴胡的特异性引物及含有该引物的试剂盒。
本发明的另一目的是提供采用上述特异性引物PCR检测柴胡和狭叶柴胡的方法。
为了实现本发明目的,本发明提供的一种柴胡(Bupleurum chinense DC.)的PCR检测特异性引物对,其包括上游引物上游引物F1:5’-ATGCCTCCGCCCCGTTTGG-3’和下游引物R1:5’-TGCGTTTTCC GATCTCCGGT-3’。
为了实现本发明目的,本发明提供的一种狭叶柴胡(Bupleurum scorzonerifolium Willd.)的PCR检测特异性引物对,其包括上游引物F2:5’-TGTCGTCGGCCTCGGCCTG-3’和下游引物R2:5’-ACGACGAGGCACGGGAGGT-3’。
本发明还提供含有上述PCR引物对的用于检测柴胡和狭叶柴胡的试剂盒。
前述试剂盒中还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液。
更优选地,前述试剂盒还包括标准阳性模板。
本发明还提供所述试剂盒在检测柴胡和狭叶柴胡中的应用。
本发明进一步采用上述特异性引物PCR检测柴胡(或狭叶柴胡)的方法,包括以下步骤:
1)提取样品中的DNA;
2)以步骤1)中提取的DNA为模板,使用上述引物F1-R1(或F2-R2),进行PCR扩增反应;
3)分析PCR产物,即对上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,根据电泳检测结果判定样品中是否含有柴胡(或狭叶柴胡)。
其中,PCR扩增反应体系以25μl计为:
PCR反应条件为:93℃5min;93℃30s,60℃30s,72℃30s,共35个循环;72℃5minn,10℃10min。
扩增反应结束后,若电泳检测结果分别出现约336bp(或407bp)的DNA条带,则该样品中分别含有柴胡(或狭叶柴胡)。
本发明基于柴胡和狭叶柴胡的ITS序列,设计出可快速检测柴胡和狭叶柴胡的特异性引物,并在此基础上建立了PCR检测体系,为柴胡和狭叶柴胡的鉴别提供了分子鉴定依据,可从多种药材、中成药(蜜丸、水蜜丸)中快速、准确地检测出柴胡和狭叶柴胡。根据该方法构建的检测试剂盒操作简便,特异性好,灵敏度高,可实现对柴胡、狭叶柴胡的茎、叶或植物其它部位,药材以及中成药的检测,适于广泛的推广使用。
附图说明
图1是利用柴胡和狭叶柴胡的ITS序列扩增条带的琼脂糖凝胶电泳图,其中:1为柴胡条带,336bp;2为狭叶柴胡条带,407bp;M为DNA marker,2000bp;K为阴性对照。
图2是利用柴胡F1-R1引物和狭叶柴胡F2-R2引物所扩增条带的琼脂糖凝胶电泳图,其中:1-5号是DNA稀释浓度为1.811、0.905、0.603、0.452、0.362ng/μl的柴胡条带,336bp;6-9号是DNA稀释浓度为0.993、0.496、0.331、0.248ng/μl的狭叶柴胡条带,407bp;M为DNA marker,2000bp;K为阴性对照。
图3是利用柴胡F1-R1引物所扩增条带的琼脂糖凝胶电泳图,其中:1-5号是对应表1中1-5号药材的柴胡DNA扩增条带,336bp;M为DNA marker,2000bp;K为阴性对照。
图4是利用柴胡F1-R1引物和狭叶柴胡F2-R2引物所扩增条带的琼脂糖凝胶电泳图,其中:1-5号是对应表2中成药的柴胡DNA扩增条带,336bp;6-10号是对应表2中成药的狭叶柴胡DNA扩增条带,没有扩增成功;M为DNA marker,2000bp;K为阴性对照。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
若未特别指明,以下实施例均按照常规实验条件,如Sambrook等分子克隆实验手册(NewYork:Gold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的操作技术规程,或按照制造厂商所建议的实验条件;所用原料均为市售商品。
实施例1用于检测柴胡和狭叶柴胡的PCR引物的合成
从GenBank中共获得柴胡、狭叶柴胡等柴胡属ITS序列12条,利用生物学软件DNAMANversion4.0对比上述序列,找出柴胡、狭叶柴胡所有不同于其他种的变异位点。根据变异位点的位置,分别在ITS序列的上、下游各设计约20个碱基的引物;利用生物学软件Primer5.0对设计的引物进行分析,最终分别确定柴胡合适的引物对,上游引物F1:5’-ATGCCTCCGCCCCGTTTGG-3’和下游引物R1:5’-TGCGTTTTCC GATCTCCGGT-3’;狭叶柴胡合适的引物对,上游引物F2:5’-TGTCGTCGGCCTCGGCCTG-3’和下游引物R2:5’-ACGACGAGGCACGGGAGGT-3’。
引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
实施例2利用PCR引物检测柴胡的特异性和灵敏度分析
1.1样本来源
本实施例中采用的药材样品有:柴胡,采自山西浑源。
1.2DNA提取
将上述样品,每个样品取约60mg,用液氮研磨成粉末,利用试剂盒法提取DNA。试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司,型号为:CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒(货号:DN14),50次。
1.3样品DNA的梯度稀释
检测上述提取的柴胡药材的DNA浓度,为181.1ng/μl。将DNA样品进行梯度稀释,稀释后的浓度为1.811、0.905、0.603、0.452、0.362ng/μl,于-20℃保存备用。
1.4PCR反应
反应体系(25μl):
PCR反应条件为:93℃5min;93℃30s,60℃30s,72℃30s,共35个循环;72℃5minn,10℃10min。
1.5结果
取扩增产物5μl,在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳,电压为130V,23min后在紫外光下检测电泳结果,出现约336bp的条带,证明所检样品为柴胡或含有柴胡。电泳检测结果如图1所示。上述结果表明实施例1中设计的引物特异性强。
分别以上述稀释的DNA样品为模板进行PCR扩增反应。PCR扩增程序和扩增产物检测方法同上(点样量为5μl)。结果如图2所示,当柴胡DNA模板稀释至0.362ng/μl时,PCR扩增的条带不明显。因此,上述引物对对柴胡的检测灵敏度可达0.362ng/μl,即可检出样品中约1.8ng的柴胡,检测灵敏度高。
实施例3利用PCR引物检测狭叶柴胡的特异性和灵敏度分析
1.1样本来源
本实施例中采用的药材样品有:狭叶柴胡,采自黑龙江林甸。
1.2DNA提取
同实施例2的1.2。
1.3样品DNA的梯度稀释
检测上述提取的狭叶柴胡药材的DNA浓度,为99.3ng/μl。将DNA样品进行梯度稀释,稀释后的浓度为0.993、0.496、0.331、0.248ng/μl,于-20℃保存备用。
1.4PCR反应
除所用引物(F2-R2)不同外,余皆同实施例2的1.4。
1.5结果
检测方法同实施例2的1.5。
出现约407bp的条带,证明所检样品为狭叶柴胡或含有狭叶柴胡。电泳检测结果如图1所示。上述结果表明实施例1中设计的引物特异性强。
如图2所示,当狭叶柴胡DNA模板稀释至0.248ng/μl时,PCR扩增的条带不明显。因此,上述引物对对狭叶柴胡的检测灵敏度可达0.248ng/μl,即可检出样品中约1.2ng的狭叶柴胡,检测灵敏度高。
实施例4利用PCR引物检测不同产地的柴胡样品
1.1本实施例中采用的药材样分别采集不同产地的5种柴胡(见表1),每个样品取约100mg,用液氮研磨成粉末,利用试剂盒法提取DNA。试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司,型号为:CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒(货号:DN14),50次。
表1
1.2使用ITS通用引物ITS5F:5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’和ITS4R:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’分别进行PCR检测提取的各DNA样品的质量。
PCR反应体系:
PCR反应条件为:93℃5min;93℃30s,60℃30s,72℃30s,共35个循环;72℃5minn,10℃10min。
设置空白对照,DNA模板用等量ddH2O代替,证明DNA的质量达到检测的要求,并确定了合适的DNA模板量为5μL。
1.3利用实施例1设计的特异性引物F1-R1,对5个样品的总DNA进行PCR扩增,PCR反应体系和扩增条件如下:
PCR反应体系(25μL):
PCR反应条件为:93℃5min;93℃30s,60℃30s,72℃30s,共35个循环;72℃5minn,10℃10min。
1.4取PCR扩增产物,进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,电泳结束后在凝胶成像仪上检测结果。结果如图3所示。
实施例5利用PCR引物检测市售的含柴胡或狭叶柴胡的中成药样品
1.1从同仁堂(山西省太原市长风店)购买不同厂家生产的3种含柴胡或狭叶柴胡的中成药样品(见表2),每个样品取约100mg,用液氮研磨成粉末,利用试剂盒法提取DNA。试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司,型号为:CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒(货号:DN14),50次。
表2
1.2使用ITS通用引物ITS5F:5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’和ITS4R:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’分别进行PCR检测提取的各DNA样品的质量。
PCR反应体系:
PCR反应条件为:93℃5min;93℃30s,60℃30s,72℃30s,共35个循环;72℃5minn,10℃10min。
设置空白对照,DNA模板用等量ddH2O代替,证明DNA的质量达到检测的要求,并确定了合适的DNA模板量为5μL。
1.3利用实施例1设计的特异性引物F1-R1,对5个样品的总DNA进行PCR扩增,PCR反应体系和扩增条件如下:
PCR反应体系(25μL):
PCR反应条件为:93℃5min;93℃30s,60℃30s,72℃30s,共35个循环;72℃5minn,10℃10min。
1.4利用实施例1设计的特异性引物F2-R2,对5个样品的总DNA进行PCR扩增,PCR反应体系和扩增条件,除所用引物(F2-R2)不同外,余皆同实施例5的1.3。
1.5取PCR扩增产物,进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,电泳结束后在凝胶成像仪上检测结果。结果如图4所示。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.柴胡(Bupleurum chinense DC.)的PCR检测特异性引物对,特征在于其是:
上游引物F1:5’-ATGCCTCCGC CCCGTTTGG-3’和
下游引物R1:5’-TGCGTTTTCC GATCTCCGGT-3’。
2.狭叶柴胡(Bupleurum scorzonerifolium Willd.)的PCR检测特异性引物对,特征在于其是:
上游引物F2:5’-TGTCGTCGGC CTCGGCCTG-3’和
下游引物R2:5’-ACGACGAGGC ACGGGAGGT-3’。
3.含有权利要求1所述引物对的用于检测柴胡的试剂盒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+和PCR反应缓冲液。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括标准阳性模板。
6.采用权利要求1所述的特异性引物PCR检测柴胡的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)提取样品中的DNA;
2)以步骤1)中提取的DNA为模板,使用权利要求1所述的引物F1和R1,进行PCR扩增反应;
3)用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物,确认是否为柴胡。
8.根据权利要求6或7所述的方法,其特征在于,PCR反应条件为:93℃5min;93℃30s,60℃30s,72℃30s,共35个循环;72℃5minn,10℃10min。
9.权利要求3-5任一项所述的试剂盒在检测柴胡中的应用。
10.含有权利要求2所述引物对的用于检测柴胡的试剂盒。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C05 | Deemed withdrawal (patent law before 1993) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140212 |