CN103122381A

CN103122381A - 柴胡毛细管电泳dna指纹图谱及鉴定方法

Info

Publication number: CN103122381A
Application number: CN 201210593407
Authority: CN
Inventors: 苑广信; 李明成; 李洪宇; 王淼; 张丽华; 傅桂莲; 王冰梅
Original assignee: Beihua University
Current assignee: Beihua University
Priority date: 2012-12-22
Filing date: 2012-12-22
Publication date: 2013-05-29

Abstract

本发明涉及中药鉴定技术领域，具体为一种柴胡毛细管电泳DNA指纹图谱及鉴定方法。柴胡毛细管电泳DNA指纹图谱包括DNA的提取、PCR扩增、扩增产物的分析、柴胡毛细管电泳DNA指纹图谱的建立。柴胡DNA指纹鉴定方法包括柴胡DNA标准指纹图谱的建立、样品DNA指纹图谱的建立、利用相似度软件进行结果鉴定。该指纹图谱及鉴定方法可用于柴胡样品的鉴定。本发明能从遗传本质上对柴胡进行真伪鉴定，方法快速、准确、客观，可用于柴胡样品的鉴定。

Description

柴胡毛细管电泳DNA指纹图谱及鉴定方法

技术领域

本发明涉及中药材鉴定技术，具体地说是一种柴胡毛细管电泳DNA指纹图谱及鉴定方法。

背景技术

柴胡为伞形科多年生草本植物柴胡(Bupleurum chinense DC.)和狭叶柴胡(南柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd.)的根或全草，前者习称“北柴胡”，后者习称“南柴胡”。柴胡是我国传统名贵中药材，始载于《神农本草经》，列为上品。《本经》言：柴胡“主心腹肠胃结气，饮食积聚，寒热邪气，推陈致新。”现代用以疏散退热，疏肝解郁，升阳举陷。我国除海南省、香港澳门特别行政区外，其余地区均有柴胡属植物分布，已报道的柴胡属植物共有42种、17个变种及7变型，而《中国药典》(2010年版)中仅规定柴胡和狭叶柴胡两种为正品药用。柴胡药材的主要来源为野生资源，近年来由于临床需求不断增大，资源严重减少，使得大量伪品和混淆品出现，造成市场混乱。

目前，柴胡的鉴别主要依据外观性状，显微鉴别和理化性质等进行鉴别。性状鉴别和显微鉴别过于依赖鉴别人员的经验和感觉，主观性强，可信度较低。理化鉴别主要是柴胡皂苷a、d的检验，但是大部分柴胡的品种都含有柴胡皂苷，特征性不强，因而仅对柴胡皂苷a、d进行检验，也难以对柴胡进行准确鉴定。

DNA指纹鉴定技术是利用生物体内遗传信息载体(DNA)对物种进行鉴别的方法，近年来已被广泛的应用于中药材的鉴定，成为中药鉴定和质量标准研究的一个热点。目前广泛应用的构建DNA指纹图谱的分子标记方法有：限制性内切酶酶切片段长度多态性(RFLP)分析、随机扩增DNA多态性(RAPD)分析、小卫星DNA(VNTR)技术、微卫星(SSR)技术和扩增片段长度多态性(AFLP)分析。其中随机扩增DNA多态性(RAPD)分析技术是由美国科学家Wiliams和Welsh于1990年分别研究提出的，与其它分子标记技术相比，RAPD具有如下优点：

1.无需专门设计RAPD扩增反应引物，可以在没有任何分子生物学研究基础的情况下对某一物种进行DNA指纹图谱的构建和遗传多样性的研究；

2.多态性丰富，具有较高的检出率；

3.技术简便易行、省时省力，易于程序化；

4.所需的DNA样品量极少。

因而近年来RAPD技术目前运用相当广泛，但是RAPD技术目前还存在如下缺点：

1.重复性和稳定性较差；

2.虽然扩增结果多态性丰富但目前缺乏合适的检测手段；

3.大量的扩增条带使结果分析变得困难，目前常用的方法是在电泳图谱中选择代表性的扩增条带，根据这些条带的有、无进行鉴定。但人为的选择部分扩增条带而舍弃其它条带，降低了分析结果的客观性，增加了假阳性结果出现的几率。

高效毛细管电泳(CE)具有快速、灵敏、分辨率高、抗污染等优点。CE可以满足RAPD扩增产物对高分离度的要求，体现扩增结果的多态性；CE可明显缩短RAPD扩增产物分析时间，省时省力；CE分析结果可采用统计学方法处理，更适合RAPD扩增这种复杂结果的准确分析。本发明将高效毛细管电泳技术和随机扩增DNA多态性分析(RAPD)技术相结合，建立柴胡毛细管电泳DNA指纹图谱及鉴定方法，该方法快速、准确、客观，可用于柴胡样品的鉴定。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于药材真伪鉴别的柴胡毛细管电泳DNA指纹图谱及鉴定方法，以解决现有技术的缺陷。

本发明首先提供了柴胡毛细管电泳DNA指纹图谱(包括柴胡毛细管电泳DNA指纹图谱和狭叶柴胡毛细管电泳DNA指纹图谱)，该指纹图谱可用于柴胡的真伪鉴别，柴胡毛细管电泳DNA指纹图谱见附图1、附图2。

本发明还提供了上述柴胡毛细管电泳DNA指纹图谱的构建方法，本方法包括下述步骤：

1)柴胡DNA提取：将柴胡样品粉碎，按CTAB法提取其线粒体DNA；

2)柴胡DNA的RAPD扩增：以提取的柴胡DNA为模板进行RAPD扩增，采用的引物为引物1(GTTACTCGAG)，引物2(CCTGAATGCC)。

3)PCR扩增产物的分析：采用毛细管电泳法分析扩增产物，记录电泳图谱；

4)柴胡毛细管电泳DNA指纹图谱的建立：比较柴胡、狭叶柴胡和其它供试材料电泳图谱的区别，发现柴胡和狭叶柴胡均有其特异的电泳图谱，可以与其它供试材料区分。此电泳图谱即为柴胡毛细管电泳DNA指纹图谱。

本发明还提供了柴胡毛细管电泳DNA指纹鉴定方法，它包含下述步骤：

1)先建立柴胡毛细管电泳DNA标准指纹图谱，方法如下：

(a)柴胡DNA提取：取柴胡(柴胡或狭叶柴胡)对照药材，按CTAB法提取其线粒体DNA；

(b)柴胡DNA的PGR扩增：以提取的柴胡(柴胡或狭叶柴胡)DNA为模板进行RAPD扩增，采用的引物为GTTACTCGAG，CCTGAATGCC。

(c)PCR扩增产物的分析：采用毛细管电泳法分析扩增产物，记录电泳图谱；

(d)柴胡毛细管电泳DNA标准指纹图谱的建立：柴胡和狭叶柴胡均有其特异的电泳图谱，可以与其它供试材料区分，此电泳图谱即为柴胡(柴胡或狭叶柴胡)毛细管电泳DNA标准指纹图谱。

2)测定样品DNA指纹图谱：以上述相同的方法测定待测样品，得样品毛细管电泳DNA指纹图谱；

3)结果鉴定：利用相似度分析软件比较样品DNA指纹图谱与柴胡(柴胡或狭叶柴胡)DNA标准指纹图谱的相似度，根据相似度对样品进行真伪鉴定。

本发明使用毛细管电泳发对柴胡及其伪品的扩增产物进行分析并构建柴胡毛细管电泳DNA标准指纹图谱。该方法克服了RAPD法重复性和稳定性较差、缺乏合适的检测手段、结果分析困难等缺点；方法快速、灵敏、分辨率高，极大程度的体现了RAPD分析多态性丰富的特点；应用相似度分析软件对检测结果进行分析，保证了指纹图谱的完整性，结果更客观、准确，更容易实现自动化分析。

附图说明

图1柴胡(柴胡)毛细管电泳DNA标准指纹图谱

图2柴胡(狭叶柴胡)毛细管电泳DNA标准指纹图谱

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，下面实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。

实施例1

柴胡毛细管电泳DNA指纹图谱的建立

1.柴胡DNA提取

取柴胡(柴胡或狭叶柴胡)对照药材0.05～0.1g，充分研磨后转移至离心管中，加入2×CTAB(1.4mol/L NaCl，100mmol/L Tris pH 8.0，20mmol/L EDTA pH 8.0，2％ PVP，2％ CTAB，3％ β-巯基乙醇)200μL，混匀，65℃水浴保温1h，期间不断震荡。4℃下12000r/min离心10min。吸取上清液，加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)抽提2～3次，10000r/min离心5min。取上清液加2/3体积的无水乙醇，混匀后-20℃放置1h沉淀核酸。4℃下10000r/min离心5min，弃上清，得到DNA絮状沉淀。沉淀用80％乙醇和无水乙醇分别漂洗两次，室温晾干，加入适量的植物TE缓冲液溶解，加入0.5～1μL RNaseA于37℃水浴中反应1～2h，4℃保存。

2.PCR扩增

分别以柴胡、狭叶柴胡DNA为模板进行RAPD扩增，引物为GTTACTCGAG，CCTGAATGCC。

PCR反应体系为：10×PCR buffer(含Mg²⁺)3μL、dNTPs 2.4μL、上下游引物各1μL、0.2U Tap DNA聚合酶、0.5μg DNA模板。

循环参数设置为：95℃预变性5min，95℃变性60S，36℃退火30S，72℃延伸30S，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。

3.PCR产物鉴定

将步骤2中的PCR扩增产物进行毛细管电泳分析，具体步骤如下：

3.1仪器、试剂

安捷伦毛细管电泳系统(Agilent HP 3D/CE)；安捷伦DAD检测器(Agilent diode-arraydetector)；安捷伦化学工作站(Agilent ChemStation software package)。

羟丙基甲基纤维素(HPMC)、四丁基磷酸铵(TBAP)为色谱纯、乙二胺四乙酸(EDTA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、磷酸二氢钠、氢氧化钠为分析纯、去离子水。柴胡对照药材、狭叶柴胡对照药材(中国药品生物制品检定所)，柴胡，狭叶柴胡，银柴胡、大叶柴胡、黑柴胡及市售伪品。

3.2样品处理

取上述PCR扩增产物10μl，用电泳缓冲液稀释10倍，经0.45μm微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液。

3.3电泳条件

色谱柱：54cm×75μm，有效长度47.5cm的未涂层石英毛细管柱(河北永年锐沣色谱器件有限公司)；

电泳缓冲液：20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.3)-15mM TBAP-2mM EDTA-1.2％(w/v)HPMC；

分离电压：-8KV；温度：25℃；检测波长；260nm；

进样条件：电动进样，-10kV，15s。

4.柴胡DNA指纹图谱的建立

根据步骤3用毛细管电泳法分析扩增产物，记录电泳图谱，挑选具有代表性(稳定性和重复性良好、样品峰数量适中、分离度好、分析时间短且各样品彼此区别明显)的电泳图谱，构建柴胡DNA指纹图谱。柴胡、狭叶柴胡及常见伪品均有其特异的DNA指纹图谱，可以把它们彼此区分开。分别记录柴胡和狭叶柴胡的电泳图谱，作为柴胡毛细管电泳DNA标准指纹图谱，此标准指纹图谱可用于柴胡样品的鉴定(见图1、图2)。

实施例2

将本发明的柴胡(柴胡)DNA指纹鉴定方法用于某个柴胡样品的鉴定

假设现有一批柴胡样品不能确定是否是真正的柴胡，因此，按照如下方法对它进行鉴定。

柴胡DNA标准指纹图谱建立以后，要对某个样品进行鉴定时，首先用CTAB法提取其线粒体DNA；用提取的DNA作为模板，用引物GTTACTCGAG，CCTGAATGCC对其进行PCR扩增；扩增产物进行毛细管电泳分析并记录电泳图谱，即得该批待测样品的DNA指纹图谱；利用相似度分析软件比较待测样品DNA指纹图谱与柴胡(柴胡)DNA标准指纹图谱的相似度，根据相似度对待测样品进行鉴定。

鉴定结果：若二者相似度大于95％(含95％)，这批样品就是真正的柴胡；若二者相似度小于95％，那么这批样品就不是真正的柴胡。

实施例3

将本发明的柴胡(狭叶柴胡)DNA指纹鉴定方法用于某个狭叶柴胡样品的鉴定

假设现有一批狭叶柴胡样品不能确定是否是真正的狭叶柴胡，因此，按照本发明的方法构建这批样品的DNA指纹图谱，然后利用相似度分析软件比较待测样品DNA指纹图谱与柴胡(狭叶柴胡)DNA标准指纹图谱的相似度，根据相似度对待测样品进行鉴定。

鉴定结果：若二者相似度大于95％(含95％)，这批样品就是真正的狭叶柴胡；若二者相似度小于95％，那么这批样品就不是真正的狭叶柴胡。

Claims

1.一种柴胡毛细管电泳DNA指纹图谱的构建方法，其特征在于按如下步骤操作：柴胡DNA的提取；柴胡DNA的PCR扩增；PCR扩增产物的分析；柴胡毛细管电泳DNA指纹图谱的建立。

2.一种柴胡DNA指纹鉴定方法，其特征在于按如下步骤操作：柴胡DNA标准指纹图谱的建立；样品DNA指纹图谱的建立；利用相似度软件进行结果鉴定。

3.如权利要求1和权利要求2所述的柴胡毛细管电泳DNA指纹图谱及鉴定方法，其特征在于：所述柴胡DNA标准指纹图谱为柴胡DNA指纹图谱或狭叶柴胡DNA指纹图谱。

4.如权利要求2所述的柴胡DNA指纹鉴定方法，其特征在于：所述RAPD扩增中采用的引物为GTTACTCGAG，CCTGAATGCC。

5.如权利要求2所述的柴胡DNA指纹鉴定方法，其特征在于：结果鉴定是利用相似度分析软件比较样品DNA指纹图谱与柴胡DNA标准指纹图谱的相似度，根据相似度对柴胡样品进行真伪鉴定。

6.一种柴胡毛细管电泳DNA指纹图谱的应用，其特征在于：可应用于柴胡样品的真伪鉴定。