CN107326069A - 一种用于鉴定柴胡的引物对及其应用 - Google Patents

一种用于鉴定柴胡的引物对及其应用 Download PDF

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本发明公开了一种用于鉴定柴胡的引物对及其应用，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。(1)本发明所述引物对及方法能够针对柴胡入药部位的药材干根，及其经过加工和炮制后的样品；(2)本发明所述引物对具有特异性及灵敏度高的优点；(3)本发明所述方法通过多次扩增的方法能够保证鉴定结果的准确度。

Description

一种用于鉴定柴胡的引物对及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段鉴定中药的方法，具体为一种用于鉴定柴胡的引物对及其应用。
背景技术
宫颈癌发生部位为女性宫颈部，是女性常见恶性肿瘤之一。肿瘤早期基本没有症状，后期会有阴道异常出血、盆骨疼痛、性交痛等。宫颈癌的主要诱因是人乳头状病毒感染，次要诱因包括吸烟、免疫力下降、避孕药的使用、过早开始性生活、多性伴侣等。世界范围内，宫颈癌是女性癌症死亡的最重要的四大诱因之一，70％的宫颈癌患者在发展中国家。
柴胡味辛、苦、具有保肝、热解、抗菌等作用。皂苷是柴胡中含量较高、研究深入的一类成分，皂苷主要是柴胡皂苷a、c和d。其中，a和d活性较为显著。
柴胡皂苷-D是一种中药柴胡提取物，具有多种中药的药理特征，如抗炎症、肝细胞损伤保护、血管新生抑制和抗肿瘤作用。肿瘤的研究多从肿瘤细胞的抑制增值、诱导凋亡探讨。
由于近年来柴胡资源严重减少，价格一直持上升趋势，使得一些伪品和混淆品大量出现，严重搅乱了正常的市场秩序，危害了患者的身体健康，甚至造成中毒事故的发生。
常用的柴胡鉴别方法有药材性状鉴别、显微鉴别和化学鉴别法。性状鉴别主要是指从柴胡的外形、大小、颜色、表皮特征、质地、断面特征、气味等宏观特征来判断品种。方法虽然简单，但经验在这种方法中的影响很大，主观性较强。即使进行了很详细的性状描述，再有其他人来判断也比较难。而且作为药材形态通常是不完整的，因此鉴别难度较大。
目前已有学者编制了柴胡组织及粉末检索表，为柴胡的显微鉴别提供了一定依据，但柴胡属植物的粉末没有太大的区别，只是纤维的形状、长短、壁的厚薄、淀粉粒的有无，孔纹导管的数量等，只有相对的鉴别意义，无法准确鉴定真伪。
目前虽已有研究者探索用DNA分子标记鉴别柴胡，但都未获得理想的结果。大部分是对柴胡幼嫩组织(多为新鲜或干燥叶片)进行研究，而其入药部位为含有大量次生代谢产物的药材干根，且通常经过加工和炮制，研究成果缺乏实用性；而部分针对柴胡药材干根的研究一方面没有获得柴胡特有的分子标记，并且方法也不稳定。
发明内容
本发明的目的是：为了克服现有技术的缺陷，获得一种特异性鉴定柴胡品类，且方法稳定，能够以药材干根为鉴定目标，本发明提供了一种用于鉴定柴胡的引物对及其应用。
技术方案：一种用于鉴定柴胡的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
优选的，所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5’端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
表1引物对及发卡结构序列
名称 序列(5’-3’) SEQ ID NO.
P1-F ATGACCAAACCTTCGTAAACTC 1
P1-R TCTTCATTTTAATACGTTATA 2
P2-F AGACACATTCGCGTAACTC 3
P2-R CTCATTTAATAGGCGTATA 4
P3-F GTCCTGGCTGAATGATATCATCG 5
P3-R GGGTATTAAGTTCAGACAACATCCG 6
发卡结构 CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG 7
所述引物对在制备鉴定中药柴胡试剂盒中的应用。
优选的，所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
优选的，所述试剂盒鉴定中药柴胡的步骤包括：
(1)提取柴胡样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100～1000倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10～100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
进一步的，所述柴胡样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
进一步的，所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
有益效果：(1)本发明所述引物对及方法能够针对柴胡入药部位的药材干根，及其经过加工和炮制后的样品；(2)本发明所述引物对具有特异性及灵敏度高的优点；(3)本发明所述方法通过多次扩增的方法能够保证鉴定结果的准确度。
附图说明
图1是实施例1～3PCR鉴定结果电泳图；
其中M为分子量为2000的Maker；1为实施例1PCR产物鉴定结果；2为实施例2PCR产物鉴定结果；3为实施例3PCR产物鉴定结果。
具体实施方式
实施例1
一种用于鉴定柴胡的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5’端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
所述引物对在制备鉴定中药柴胡试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
所述试剂盒鉴定中药柴胡的步骤包括：
(1)提取柴胡样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述柴胡样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
实施例2
一种用于鉴定柴胡的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5’端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
所述引物对在制备鉴定中药柴胡试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
所述试剂盒鉴定中药柴胡的步骤包括：
(1)提取柴胡样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释500倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述柴胡样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
实施例3
一种用于鉴定柴胡的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5’端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
所述引物对在制备鉴定中药柴胡试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
所述试剂盒鉴定中药柴胡的步骤包括：
(1)提取柴胡样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释1000倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述柴胡样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
如图1所示，将实施例1～3的扩增产物进行电泳检测，条带清晰可见，产物单一。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州市李良济健康产业有限公司
<120> 一种用于鉴定柴胡的引物对及其应用
<130>
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgaccaaac cttcgtaaac tc 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcttcatttt aatacgttat a 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agacacattc gcgtaactc 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctcatttaat aggcgtata 19
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gtcctggctg aatgatatca tcg 23
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gggtattaag ttcagacaac atccg 25
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggg 40

Claims (7)

1.一种用于鉴定柴胡的引物对，其特征在于，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
2.根据权利要求1所述的一种用于鉴定柴胡的引物对，其特征在于，所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5，端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQID NO.7。
3.权利要求1或2所述引物对在制备鉴定中药柴胡试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒鉴定中药柴胡的步骤包括：
(1)提取柴胡样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100～1000倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10～100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述柴胡样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
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