CN106822227B - 一种中药人中黄的制备方法 - Google Patents

一种中药人中黄的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及中药人中黄的制备方法，有效解决人中黄制备方法落后，不能保证饮片质量和用药安全有效的问题，方法是，取甘草饮片，打粉，过3号筛；再选取鲜青竹按节锯断成一端不通之竹筒，刮去青皮；将甘草粉装入竹筒内杵实，用橡胶皮塞堵住竹筒口，再用融化的石蜡封口，防水胶带包缠，密封；将装好甘草粉的竹筒置于反应槽内，加重物使竹筒不漂浮，倾倒复合氨化碱性液至没过竹筒，发酵40‑60天取出，清水冲净至无异味，破竹取出，晾晒至干、且无异味即可；本发明利用微生物大肠杆菌的培养环境、菌群浓度、发酵作用时间及其在中药人中黄的制备中应用，保证中药人中黄的质量，有利于工业化生产和开拓人中黄药用价值和经济价值，方法先进，质量稳定可靠。

Description

一种中药人中黄的制备方法
技术领域
本发明涉及医药，特别是一种中药人中黄的制备方法。
背景技术
中药人中黄又称“甘草黄”，“甘中黄”等，是由甘草粉末密闭于竹筒后置粪坑中浸渍一段时间后的制成品。其炮制方法最早见于元·朱震亨《丹溪心法》载曰：“人中黄，以竹筒入甘草末于内，竹木塞两头，冬月浸粪缸中，立春取出悬风处阴干，破竹取草，晒干用”。现《中华本草》收载人中黄，性寒凉，味甘、咸，归心、胃经；具有泻火解毒，清热凉血的作用。古代的医案或本草书籍中记载常用于治疗天行热、瘟毒、疫戾、痰火、痘疹等疾病。现仍然在流通使用。但是由于现流通使用的制备方法是在自然环境中，存在人为因素，制备方法落后，生产效率低，而且制备的饮片难以保证临床用药安全有效，满足不了医药上对人中黄的实际需要，不利于工作业生产和对传统中药人中黄进行保护，因此，在科学发展的今天，能否利用现代化学物质和微生物发酵技术，构建替代人中黄传统法制备的环境，而创新性的提供一种人中黄制备方法是亟待解决的技术问题。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种中药人中黄的制备方法，可有效解决人中黄制备方法落后，不能保证饮片质量和用药安全有效的问题。
本发明解决的技术方案是，依照2015版《中国药典》甘草项下所载甘草品种，取甘草饮片，打粉，过3号筛；再选取直径3-6cm粗的鲜青竹按节锯断成一端不通之竹筒，刮去青皮；将甘草粉装入竹筒内杵实，至离筒口0.2-0.4cm，用橡胶皮塞堵住竹筒口，再用融化的石蜡封口，防水胶带包缠，密封；将装好甘草粉的竹筒置于反应槽内，加重物使竹筒不漂浮，倾倒复合氨化碱性液至没过竹筒15-20cm，20-30℃条件发酵40-60天取出，清水冲净至无异味，破竹取出，晾晒至干、且无异味即可；
所述的复合氨化碱性液是由以体积百分比计的：组分A 92-95％和组分B 5-8％混合均匀制成，其中：
组分A是：由蛋白胨0.5-2g、牛肉膏1.5g、酵母浸粉1.5～5g、氯化钠2-5g和磷酸二氢钾 6～8g，加蒸馏水定容至1000mL，用氢氧化铵调节PH至7.2～8.0，121℃高压灭菌15分钟制成；
组分B是：由采购或者按照常规方法分离大肠杆菌，置于甘油中保存备用或置于牛肉汤增菌培养液扩增培养24小时，至稳定生长期制成；
所述的大肠杆菌的分离方法是，用20mL无菌的水为溶剂，加8g NaCl、0.12g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4，使PH 7.2～7.4，将10g新鲜的粪便，稀释成梯度为10-1、10-2、10-4、 10-6的悬液，取200μL悬液涂布伊红美兰平板培养基(EMB)，37℃培养24h，挑选菌落数在50～500之间的平板，选取有紫黑色金属光泽的菌落，在LB平板上进行纯化分离2～3次，挑选单菌落置于(或甘油中保存)牛肉汤增菌培养24小时，至稳定生长期，得分离的大肠杆菌菌株。
本发明方法新颖独特，利用微生物大肠杆菌的培养环境、菌群浓度、发酵作用时间及其在中药人中黄的制备中应用，既保证了传统的中药人中黄的质量，又开拓了制备人中黄的新途径，有利于工业化生产和开拓人中黄药用价值和经济价值，方法先进，生产效率高，产品质量稳定可靠，经济和社会效益显著。
附图说明
图1为本发明甘草苷、甘草素、异甘草素、甘草酸、甘草查尔酮A和甘草次酸混合对照品图谱图。
图2为本发明共有模式图谱图。
图3为本发明甘草与共有模式图镜像对比图。
图4为本发明甘草与复合环境制法样品镜像对比图。
图5为本发明复合样品与共有模式图镜像对比图。
图6为本发明人中黄样品、市售人中黄和甘草的聚类分析图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
实施例1
本发明在具体实施中，依照2015版《中国药典》甘草项下所载甘草品种，取甘草饮片，打粉，过3号筛；再选取直径4-5cm粗的鲜青竹按节锯断成一端不通之竹筒，刮去青皮；将甘草粉装入竹筒内杵实，至离筒口0.25-0.35cm，用橡胶皮塞堵住竹筒口，再用融化的石蜡封口，防水胶带包缠，密封；将装好甘草粉的竹筒置于反应槽内，加重物使竹筒不漂浮，倾倒复合氨化碱性液至没过竹筒16-19cm，22-28℃条件发酵45-55天取出，清水冲净至无异味，破竹取出，晾晒至干、且无异味即可。
实施例2
本发明在具体实施中，依照2015版《中国药典》甘草项下所载甘草品种，取甘草饮片，打粉，过3号筛；再选取直径5cm粗的鲜青竹按节锯断成一端不通之竹筒，刮去青皮；将甘草粉装入竹筒内杵实，至离筒口0.3cm，用橡胶皮塞堵住竹筒口，再用融化的石蜡封口，防水胶带包缠，密封；将装好甘草粉的竹筒置于反应槽内，加重物使竹筒不漂浮，倾倒复合氨化碱性液至没过竹筒18cm，25℃条件发酵50天取出，清水冲净至无异味，破竹取出，晾晒至干、且无异味即可。
实施例3
本发明在具体实施中，依照2015版《中国药典》甘草项下所载甘草品种，取甘草饮片，打粉，过3号筛；再选取直径3cm或6cm粗的鲜青竹按节锯断成一端不通之竹筒，刮去青皮；将甘草粉装入竹筒内杵实，至离筒口0.2-0.4cm，用橡胶皮塞堵住竹筒口，再用融化的石蜡封口，防水胶带包缠，密封；将装好甘草粉的竹筒置于反应槽内，加重物使竹筒不漂浮，倾倒复合氨化碱性液至没过竹筒15cm或20cm，20℃条件发酵60天，或30℃条件发酵40天取出，清水冲净至无异味，破竹取出，晾晒至干、且无异味即可。
本发明既保证了传统人中黄的质量和药用价值，而且大大提高了生产效率，开拓了人中黄的药用价值和商业价值，并经实验取得了很好的有益技术效果，有关试验资料如下：
1、本发明人中黄炮制前后的化学成分对比：
取甘草粉末样品，制备供试品溶液，测定并记录100min色谱图。采用MacromediaFireworks 8(8.0.0.777版)作图软件进行镜像对比图制作，分别将甘草指纹图谱与人中黄共有模式图、复合环境制法样品特征图谱进行镜像图对比。如图1-4。
从图1-4中可以清楚的看出，对比不同方法制备样品的指纹图谱，结果显示复合环境制法样品和市售人中黄的各个时间区域，均呈现较大的相关性和一致性，提示采用本研究用的制法对于甘草炮制成人中黄具有可行性。通过镜像图对比，表明炮制后甘草的化学成分发生较大的变化，化学成分及含量均有明显的改变，峰位对比确定人中黄发生改变的成分为：甘草素、异甘草素、甘草查尔酮A、甘草次酸呈现升高的趋势，甘草苷显著下降趋势，而且有多种新的成分产生。提示很有可能是此类成分及未识别的变化成分使得人中黄发生功效改变的内在物质基础。
2、不同方法制备的人中黄HPLC指纹图谱对比：
取6批本发明方法制备的样品，制备成供试品溶液，测定并记录100min色谱图，将该批样品的图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(A版)”软件A版软件，取5min～90min之间的色谱图，进行色谱峰匹配。以市售人中黄共有模式谱图(S7)为参照匹配，6批复合环境制法样品的相似度均大于0.82，与对照图谱的相似度均大于0.9，与S7的相似度为0.696～0.743，匹配数据中共有峰的保留时间RSD为0.04％～0.28％。将本发明方法制备的样品图谱与人中黄共有模式图谱进行全谱镜像对比(如图5所示)。
三种制备方法图谱对比和相似度比较结果显示，本发明方法制备的样品与标准人中黄的相似度最高，谱峰显示的相似区域最多，可达到0.74，空白无微生物制法与标准人中黄对比，谱峰显示的相似区域较少，相似度较低，为0.57。复合样品与共有模式图镜像对比显示，除 6号峰甘草次酸在复合环境制法样品中未见检出，复合环境制法样品具有人中黄所有共有峰，其中1号峰甘草苷、3号峰异甘草素、4号峰甘草酸峰面积未见明显改变，2号峰甘草素复合环境制法样品的峰面积的比例较大，5号峰甘草查尔酮A复合环境制法样品中相比升高不明显。
3、HPLC法测定人中黄炮制前后6种化学成分的含量变化
本发明实验时，在建立HPLC同时测定人中黄中6种成分(甘草苷、甘草素、异甘草素、甘草酸、甘草次酸、甘草查尔酮A)，通过对比含量化实验人中黄的制备方法。取市售12批人中黄样品，2批甘草样品，本发明方法制备的样品A和空白无微生物样品B各2批，制备供试品溶液测定。结果运用G检验法对12批市售人中黄样品相关数据进行分析，淘汰异常值，求平均值，见表1。
表1不同批次样品中6种成分的含量(n＝3)
Figure BDA0001260408720000041
注：*表示异常值。
结果12批市售人中黄样品中甘草苷，甘草素，异甘草素，甘草查尔酮A，甘草酸和甘草次酸的质量分数分别为0.04～0.23，0.25～0.66，0.17～0.37，0.33～3.42，1.54～15.21，0.03～0.95 mg·g-1。甘草中这6种成分的平均质量分数分别为1.64，0.32，0.17，0.50，22.46，0mg·g-1。相比甘草，市售人中黄中甘草苷含量下降了98.17％，甘草素升高了40.63％，异甘草素升高了17.65％，甘草酸下降了76.80％，甘草查尔酮A升高了68.00％。本发明方法制备的样品A 和空白无微生物样品B除甘草查尔酮A异常的变化外，其他成分的变化趋势与市售样品基本一致。
对市售12批人中黄样品，2批甘草样品，本发明方法制备的样品A和空白无微生物样品 B各2批中6种成分的含量数据进行聚类分析。采用组间连接法，以余弦距离法作为样品间距离计算方法进行系统聚类分析，见图6。
结果，当判别条件距离为20时，18批样品被分为2大类，即全部市售人中黄、甘草和空白无微生物的样品聚为一类，另一类为本发明方法制备的样品。当判别距离为15时，分为4大类，G1～G2甘草样品聚为一类；S1～S6、S8～S12、N1～N2聚为一类；H13～H14本发明方法制备的样品聚为一类；S7样品单独聚为一类；。当判别距离减小到5时，G1～G2甘草样品聚为一类，说明甘草转化人中黄前后变化极为显著；空白样品N1～N2、S5、S9～S12部分市售人中黄聚为一类，说明制备人中黄的氨化环境对促成人中黄有一定的作用；S1～S4和S6部分市售人中黄聚为一类，表明市售人中黄样品的质量存在较大差异；H13～H14本发明方法制备的样品聚为一类；2批甘草样品单独成为一类。综合得知，通过本发明方法制备的样品能够达到人中黄的制备条件，质量较好，且在某种程度上单一无微生物的氨化环境对于人中黄的形成具有积极作用。
4、人中黄的抗炎、解热作用对比试验：
本发明研究传统方法和本发明方法制备的两种样品的解热与抗炎作用试验：人中黄收载于《中华本草》·哺乳类中，其性寒凉，味甘、咸，归心、胃经，主要具有泻火解毒，清热凉血的作用，多用于治疗天行热、瘟毒、疫戾、痰火、痘疹、白喉等疾病，具有良好的解热、抗炎作用。本发明通过观察二甲苯致小鼠耳肿胀引起炎症反应，比较小鼠耳廓肿胀度的差异，计算小鼠耳廓伊文氏蓝染料渗出的抑制率，以地塞米松(0.5％，0.01ml/10g)作为阳性药，连续给药7d，研究不同制备方法的人中黄样品对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀及毛细血管通透性的影响。结果见表2。同时通过酵母发热大鼠模型，比较给药后1，2，3，4h大鼠体温升高差值ΔT，以阿司匹林为阳性药，研究不同制备方法的人中黄样品的解热作用。结果见表3。
实验数据以
Figure BDA0001260408720000051
表示，计量资料组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。
表2不同制备方法的人中黄样品对小鼠耳廓肿胀度、小鼠着色皮肤伊文思兰含量(OD) 的影响(
Figure BDA0001260408720000061
n＝10)
Figure BDA0001260408720000062
同模型组比较，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05
从表2可看出，与空白组比，模型组小鼠皮肤内伊文思兰含量显著增高(P<0.01)，说明造局部炎症渗出模型成功；小鼠耳廓肿胀症状明显、耳廓肿胀度(P<0.01)，说明造模成功；与模型组比，传统组、本发明方法组、地塞米松组均能显著降低伊文思兰渗出量(P<0.01)，甘草组可明显降低伊文思兰渗出量(P<0.05)；传统组、本发明方法组和地塞米松组均显著降低小鼠的耳廓肿胀度(P<0.01)，甘草组可明显降低小鼠的耳廓肿胀度(P<0.05)。说明传统组和本发明方法组的样品均具有较好的抑制炎症的作用，而且抗炎活性都高于甘草组，初步说明了本发明方法制备的样品在抗炎活性方面与传统方法制备的人中黄样品差异不大。
表3不同制备方法的人中黄样品对酵母致热大鼠体温的影响(
Figure BDA0001260408720000063
n＝10)
Figure BDA0001260408720000064
同模型组比较，**P<0.01，*P<0.05
由表2可知，不同制备方法的人中黄样品组在给药后2h后与模型对照组比较，显著抑制酵母发热模型大鼠体温的升高(P<0.01)，多个时间点有统计学意义，表明不同制备方法的人中黄样品均具有有一定的解热功效，能延缓酵母发热大鼠的体温升高过程。
因此，综合内在化学成分含量和定性指纹图谱数据结果，以及人中黄的解热、抗炎的主要药理作用实验对比试验，综合说明本发明方法制备的样品具有和传统制法的人中黄相同的内在化学成分物质变化和抗炎、解热功效作用，有效保护了中药人中黄不至于被遗忘废弃。
由上述可知，本发明构建替代人中黄制备的环境，创新发明制备方法，规范其饮片质量标准，促进新药的开发研究，使现代医家认识到其药用价值，保护古代医家之精粹，不至于被遗忘废弃，为人中黄的临床用药提供依据，保证其临床用药安全有效，特别是利用现代化学物质和微生物发酵技术，构建替代人中黄传统法制备的环境，可有效解决人中黄传统制法的落后性，炮制机理不明，过程参数难以测定，过程控制困难，工艺技术不稳定，重复性相对较低，使用过程具有卫生学隐患，质量不稳定等问题，可进行工业化生产，生产效率提高 5倍以上，经济效益提高10倍以上，满足对中药人中黄的需要，商业上取得巨大成功。

Claims (4)

1.一种中药人中黄的制备方法，其特征在于，取甘草饮片，打粉，过3号筛；再选取直径3-6cm粗的鲜青竹按节锯断成一端不通之竹筒，刮去青皮；将甘草粉装入竹筒内杵实，至离筒口0.2-0.4cm，用橡胶皮塞堵住竹筒口，再用融化的石蜡封口，防水胶带包缠，密封；将装好甘草粉的竹筒置于反应槽内，加重物使竹筒不漂浮，倾倒复合氨化碱性液至没过竹筒15-20cm，20-30℃条件发酵40-60天取出，清水冲净至无异味，破竹取出，晾晒至干、且无异味即可；
所述的复合氨化碱性液是由以体积百分比计的：组分A 92-95%和组分B 5-8%混合均匀制成，其中：
组分A是：由蛋白胨0.5-2g、牛肉膏1.5g、酵母浸粉1.5~5g、氯化钠2-5g和磷酸二氢钾6~8g，加蒸馏水定容至1000mL，用氢氧化铵调节PH至7.2~8.0，121℃高压灭菌15分钟制成；
组分B是：由采购或者按照常规方法分离大肠杆菌，置于甘油中保存备用或置于牛肉汤增菌培养液扩增培养 24小时，至稳定生长期制成；
所述的大肠杆菌的分离方法是，用20 mL无菌的水为溶剂，加8g NaCl、0.12g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4，使PH 7.2~7.4，将10g新鲜的粪便，稀释成梯度为10-1、10-2、10-4、10-6的悬液，取200μL悬液涂布伊红美兰平板培养基（EMB），37℃培养24h，挑选菌落数在50~500之间的平板，选取有紫黑色金属光泽的菌落，在LB平板上进行纯化分离2~3次，挑选单菌落置于牛肉汤增菌培养24小时，至稳定生长期，得分离的大肠杆菌菌株。
2.根据权利要求1所述的中药人中黄的制备方法，其特征在于，取甘草饮片，打粉，过3号筛；再选取直径4-5cm粗的鲜青竹按节锯断成一端不通之竹筒，刮去青皮；将甘草粉装入竹筒内杵实，至离筒口0.25-0.35cm，用橡胶皮塞堵住竹筒口，再用融化的石蜡封口，防水胶带包缠，密封；将装好甘草粉的竹筒置于反应槽内，加重物使竹筒不漂浮，倾倒复合氨化碱性液至没过竹筒16-19cm，22-28℃条件发酵45-55天取出，清水冲净至无异味，破竹取出，晾晒至干、且无异味即可。
3.根据权利要求1所述的中药人中黄的制备方法，其特征在于，取甘草饮片，打粉，过3号筛；再选取直径5cm粗的鲜青竹按节锯断成一端不通之竹筒，刮去青皮；将甘草粉装入竹筒内杵实，至离筒口0.3cm，用橡胶皮塞堵住竹筒口，再用融化的石蜡封口，防水胶带包缠，密封；将装好甘草粉的竹筒置于反应槽内，加重物使竹筒不漂浮，倾倒复合氨化碱性液至没过竹筒18cm，25℃条件发酵50天取出，清水冲净至无异味，破竹取出，晾晒至干、且无异味即可。
4.根据权利要求1所述的中药人中黄的制备方法，其特征在于，取甘草饮片，打粉，过3号筛；再选取直径3cm或6cm粗的鲜青竹按节锯断成一端不通之竹筒，刮去青皮；将甘草粉装入竹筒内杵实，至离筒口0.2-0.4cm，用橡胶皮塞堵住竹筒口，再用融化的石蜡封口，防水胶带包缠，密封；将装好甘草粉的竹筒置于反应槽内，加重物使竹筒不漂浮，倾倒复合氨化碱性液至没过竹筒15cm或20cm，20℃条件发酵60天，或30℃条件发酵40天取出，清水冲净至无异味，破竹取出，晾晒至干、且无异味即可。
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