CN107227348A - 一种用于鉴定中药材五加皮的引物对及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于鉴定中药材五加皮的引物对及其应用，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。(1)本发明所述引物对能够特异性鉴定中药材五加皮，避免误服而产生身体伤害，保证五加皮临床安全用药；(2)所述引物对具有灵敏度高、稳定性强的优点。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段鉴定中药的方法，具体为一种用于鉴定中药材五加皮的引物对及其应用。
背景技术
五加皮来源为五加科植物细柱五加的干燥根皮。五加皮用药历史悠久，首载于《神农本草经》。祛风除湿，补益肝肾，强筋壮骨，利水消肿。以五加皮为主制成的五加皮酒，具有祛风祛湿，舒筋活血的功能，常用来治疗风湿性疾病。根据现代研究表明，五加皮具有抗炎、抗肿瘤、抗应激、免疫调节、保护肝脏等作用。由于其临床疗效，五加皮的应用越来越广泛，越来越受到研究者的关注。
然而，各地药材市场中经常有伪品做五加皮出售，容易引起安全问题。我国有五加属18个种，分布在全国大部分地区，由于历史和地理因素，细柱五加的近缘种常被用作五加皮在地方中使用，可能会影响临床疗效，例如，红毛五加广泛分布于四川、甘肃、青海、宁夏等地，在四川、广东等地被作为五加皮应用已有很长的历史。无梗五加分布于黑龙江、吉林、辽宁等地，药材在产区做五加皮使用。
更为严重的是市场中经常发现香加皮作为五加皮出售的现象。香加皮来源于萝摩科植物杠柳的干燥根皮。香加皮作五加皮混用的历史很长，在药材销售渠道还习惯将五加皮成为“南五加皮”，把香加皮叫做“北五加皮”，二者形态和名字相似，但功效和化学成分不同，香加皮没有补益肝肾的功效，且含有毒的杠柳毒苷等强心苷类化合物，误用后轻者不达疗效，重者导致毒性反应，甚至发生可能发生因心肌收缩性停跳而死亡的严重事件。临床上也曾有误服香加皮致死的报道，因此准确鉴定五加皮很有必要。
发明内容
本发明的目的是：为了克服现有技术的缺陷，获得一种能够特异性鉴定中药材五加皮的方法，避免误服而产生身体伤害，保证五加皮临床安全用药，本发明提供了一种用于鉴定中药材五加皮的引物对及其应用。
技术方案：一种用于鉴定中药材五加皮的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
优选的，所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5，端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
表1引物对及发卡结构序列
| 名称 | 序列(5，-3，) | SEQ ID NO. |
| P1-F | GGCATGCAATACTAGCTAGCAGTCG | 1 |
| P1-R | CATAGTGACTCTGAATGCTAACTGTCTAC | 2 |
| P2-F | CACGACCACTGCACGACATCAGTACG | 3 |
| P2-R | CTGCGTCGCCAAACGAGAGGTAGCCAC | 4 |
| P3-F | CGGACAACTGCGAGTATGCTGGCAG | 5 |
| P3-R | GGCATGGATTCAGCACTAGATGCACG | 6 |
| 发卡结构 | CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG | 7 |
所述引物对在制备鉴定中药材五加皮试剂盒中的应用。
优选的，所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
优选的，所述试剂盒鉴定中药材五加皮的步骤包括：
(1)提取五加皮样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100～1000倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10～100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
优选的，所述五加皮样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
优选的，所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
有益效果：(1)本发明所述引物对能够特异性鉴定中药材五加皮，避免误服而产生身体伤害，保证五加皮临床安全用药；(2)所述引物对具有灵敏度高、稳定性强的优点。
附图说明
图1是实施例1～3PCR鉴定结果电泳图；
其中M为分子量为2000的Maker；1为实施例1PCR产物鉴定结果；2为实施例2PCR产物鉴定结果；3为实施例3PCR产物鉴定结果。
具体实施方式
实施例1
一种用于鉴定中药材五加皮的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5，端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
所述引物对在制备鉴定中药材五加皮试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
所述试剂盒鉴定中药材五加皮的步骤包括：
(1)提取五加皮样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述五加皮样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
实施例2
一种用于鉴定中药材五加皮的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5，端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
所述引物对在制备鉴定中药材五加皮试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
所述试剂盒鉴定中药材五加皮的步骤包括：
(1)提取五加皮样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释1000倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述五加皮样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
实施例3
一种用于鉴定中药材五加皮的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5，端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
所述引物对在制备鉴定中药材五加皮试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
所述试剂盒鉴定中药材五加皮的步骤包括：
(1)提取五加皮样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释200倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释20倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述五加皮样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
如图1所示，将实施例1～3的扩增产物进行电泳检测，条带清晰可见，产物单一。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州市李良济健康产业有限公司
<120> 一种用于鉴定中药材五加皮的引物对及其应用
<130>
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggcatgcaat actagctagc agtcg 25
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
catagtgact ctgaatgcta actgtctac 29
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cacgaccact gcacgacatc agtacg 26
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctgcgtcgcc aaacgagagg tagccac 27
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cggacaactg cgagtatgct ggcag 25
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggcatggatt cagcactaga tgcacg 26
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggg 40
Claims (7)
1.一种用于鉴定中药材五加皮的引物对，其特征在于，所述引物对及其序列为：P1，SEQID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
2.根据权利要求1所述的一种用于鉴定中药材五加皮的引物对，其特征在于，所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5，端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
3.权利要求1或2所述引物对在制备鉴定中药材五加皮试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒鉴定中药材五加皮的步骤包括：
(1)提取五加皮样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100～1000倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10～100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述五加皮样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
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| CN201710421462.4A CN107227348A (zh) | 2017-06-07 | 2017-06-07 | 一种用于鉴定中药材五加皮的引物对及其应用 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN201710421462.4A CN107227348A (zh) | 2017-06-07 | 2017-06-07 | 一种用于鉴定中药材五加皮的引物对及其应用 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105316325A (zh) * | 2015-10-24 | 2016-02-10 | 甘肃农业大学 | 一种基于HMGR 3’-UTR和rRNA ITS的引物及其应用 |
| CN105624291A (zh) * | 2016-01-19 | 2016-06-01 | 中国食品药品检定研究院 | 检测样品中是否存在五加科植物成分及是否掺伪的方法 |
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2017
- 2017-06-07 CN CN201710421462.4A patent/CN107227348A/zh not_active Withdrawn
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| CN105624291A (zh) * | 2016-01-19 | 2016-06-01 | 中国食品药品检定研究院 | 检测样品中是否存在五加科植物成分及是否掺伪的方法 |
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