CN107227348A - 一种用于鉴定中药材五加皮的引物对及其应用 - Google Patents

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    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C12Q1/6876Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
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Abstract

本发明公开了一种用于鉴定中药材五加皮的引物对及其应用,所述引物对及其序列为:P1,SEQ ID NO.1~2;P2,SEQ ID NO.3~4;P3,SEQ ID NO.5~6。(1)本发明所述引物对能够特异性鉴定中药材五加皮,避免误服而产生身体伤害,保证五加皮临床安全用药;(2)所述引物对具有灵敏度高、稳定性强的优点。

Description

一种用于鉴定中药材五加皮的引物对及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域,涉及一种采用分子生物学手段鉴定中药的方法,具体为一种用于鉴定中药材五加皮的引物对及其应用。
背景技术
五加皮来源为五加科植物细柱五加的干燥根皮。五加皮用药历史悠久,首载于《神农本草经》。祛风除湿,补益肝肾,强筋壮骨,利水消肿。以五加皮为主制成的五加皮酒,具有祛风祛湿,舒筋活血的功能,常用来治疗风湿性疾病。根据现代研究表明,五加皮具有抗炎、抗肿瘤、抗应激、免疫调节、保护肝脏等作用。由于其临床疗效,五加皮的应用越来越广泛,越来越受到研究者的关注。
然而,各地药材市场中经常有伪品做五加皮出售,容易引起安全问题。我国有五加属18个种,分布在全国大部分地区,由于历史和地理因素,细柱五加的近缘种常被用作五加皮在地方中使用,可能会影响临床疗效,例如,红毛五加广泛分布于四川、甘肃、青海、宁夏等地,在四川、广东等地被作为五加皮应用已有很长的历史。无梗五加分布于黑龙江、吉林、辽宁等地,药材在产区做五加皮使用。
更为严重的是市场中经常发现香加皮作为五加皮出售的现象。香加皮来源于萝摩科植物杠柳的干燥根皮。香加皮作五加皮混用的历史很长,在药材销售渠道还习惯将五加皮成为“南五加皮”,把香加皮叫做“北五加皮”,二者形态和名字相似,但功效和化学成分不同,香加皮没有补益肝肾的功效,且含有毒的杠柳毒苷等强心苷类化合物,误用后轻者不达疗效,重者导致毒性反应,甚至发生可能发生因心肌收缩性停跳而死亡的严重事件。临床上也曾有误服香加皮致死的报道,因此准确鉴定五加皮很有必要。
发明内容
本发明的目的是:为了克服现有技术的缺陷,获得一种能够特异性鉴定中药材五加皮的方法,避免误服而产生身体伤害,保证五加皮临床安全用药,本发明提供了一种用于鉴定中药材五加皮的引物对及其应用。
技术方案:一种用于鉴定中药材五加皮的引物对,所述引物对及其序列为:P1,SEQID NO.1~2;P2,SEQ ID NO.3~4;P3,SEQ ID NO.5~6。
优选的,所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5,端加上特异性的GC发卡结构,所述发卡结构的长度为40bp,序列为SEQ ID NO.7。
表1引物对及发卡结构序列
名称 序列(5,-3,) SEQ ID NO.
P1-F GGCATGCAATACTAGCTAGCAGTCG 1
P1-R CATAGTGACTCTGAATGCTAACTGTCTAC 2
P2-F CACGACCACTGCACGACATCAGTACG 3
P2-R CTGCGTCGCCAAACGAGAGGTAGCCAC 4
P3-F CGGACAACTGCGAGTATGCTGGCAG 5
P3-R GGCATGGATTCAGCACTAGATGCACG 6
发卡结构 CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG 7
所述引物对在制备鉴定中药材五加皮试剂盒中的应用。
优选的,所述试剂盒的组分包括:引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
优选的,所述试剂盒鉴定中药材五加皮的步骤包括:
(1)提取五加皮样品的基因组DNA;
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板,以P1为特异性引物,进行第一轮PCR扩增;
(3)取步骤(2)的扩增产物,稀释100~1000倍后作为第二轮PCR的模板,以P2作为特异性引物,进行第二轮PCR扩增;
(4)取第二轮PCR扩增的产物,稀释10~100倍后作为第三轮PCR的模板,以P3作为特异性引物,进行第三轮PCR扩增;
(5)收集第三轮PCR扩增的产物,并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
优选的,所述五加皮样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
优选的,所述PCR扩增的程序为:95℃,2min;95℃,30s,52℃,30s,72℃,55s,35个循环;72℃,7min。
有益效果:(1)本发明所述引物对能够特异性鉴定中药材五加皮,避免误服而产生身体伤害,保证五加皮临床安全用药;(2)所述引物对具有灵敏度高、稳定性强的优点。
附图说明
图1是实施例1~3PCR鉴定结果电泳图;
其中M为分子量为2000的Maker;1为实施例1PCR产物鉴定结果;2为实施例2PCR产物鉴定结果;3为实施例3PCR产物鉴定结果。
具体实施方式
实施例1
一种用于鉴定中药材五加皮的引物对,所述引物对及其序列为:P1,SEQ ID NO.1~2;P2,SEQ ID NO.3~4;P3,SEQ ID NO.5~6。
所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5,端加上特异性的GC发卡结构,所述发卡结构的长度为40bp,序列为SEQ ID NO.7。
所述引物对在制备鉴定中药材五加皮试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括:引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
所述试剂盒鉴定中药材五加皮的步骤包括:
(1)提取五加皮样品的基因组DNA;
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板,以P1为特异性引物,进行第一轮PCR扩增;
(3)取步骤(2)的扩增产物,稀释100倍后作为第二轮PCR的模板,以P2作为特异性引物,进行第二轮PCR扩增;
(4)取第二轮PCR扩增的产物,稀释100倍后作为第三轮PCR的模板,以P3作为特异性引物,进行第三轮PCR扩增;
(5)收集第三轮PCR扩增的产物,并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述五加皮样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
所述PCR扩增的程序为:95℃,2min;95℃,30s,52℃,30s,72℃,55s,35个循环;72℃,7min。
实施例2
一种用于鉴定中药材五加皮的引物对,所述引物对及其序列为:P1,SEQ ID NO.1~2;P2,SEQ ID NO.3~4;P3,SEQ ID NO.5~6。
所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5,端加上特异性的GC发卡结构,所述发卡结构的长度为40bp,序列为SEQ ID NO.7。
所述引物对在制备鉴定中药材五加皮试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括:引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
所述试剂盒鉴定中药材五加皮的步骤包括:
(1)提取五加皮样品的基因组DNA;
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板,以P1为特异性引物,进行第一轮PCR扩增;
(3)取步骤(2)的扩增产物,稀释1000倍后作为第二轮PCR的模板,以P2作为特异性引物,进行第二轮PCR扩增;
(4)取第二轮PCR扩增的产物,稀释10倍后作为第三轮PCR的模板,以P3作为特异性引物,进行第三轮PCR扩增;
(5)收集第三轮PCR扩增的产物,并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述五加皮样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
所述PCR扩增的程序为:95℃,2min;95℃,30s,52℃,30s,72℃,55s,35个循环;72℃,7min。
实施例3
一种用于鉴定中药材五加皮的引物对,所述引物对及其序列为:P1,SEQ ID NO.1~2;P2,SEQ ID NO.3~4;P3,SEQ ID NO.5~6。
所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5,端加上特异性的GC发卡结构,所述发卡结构的长度为40bp,序列为SEQ ID NO.7。
所述引物对在制备鉴定中药材五加皮试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括:引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
所述试剂盒鉴定中药材五加皮的步骤包括:
(1)提取五加皮样品的基因组DNA;
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板,以P1为特异性引物,进行第一轮PCR扩增;
(3)取步骤(2)的扩增产物,稀释200倍后作为第二轮PCR的模板,以P2作为特异性引物,进行第二轮PCR扩增;
(4)取第二轮PCR扩增的产物,稀释20倍后作为第三轮PCR的模板,以P3作为特异性引物,进行第三轮PCR扩增;
(5)收集第三轮PCR扩增的产物,并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述五加皮样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
所述PCR扩增的程序为:95℃,2min;95℃,30s,52℃,30s,72℃,55s,35个循环;72℃,7min。
如图1所示,将实施例1~3的扩增产物进行电泳检测,条带清晰可见,产物单一。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州市李良济健康产业有限公司
<120> 一种用于鉴定中药材五加皮的引物对及其应用
<130>
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggcatgcaat actagctagc agtcg 25
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
catagtgact ctgaatgcta actgtctac 29
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cacgaccact gcacgacatc agtacg 26
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctgcgtcgcc aaacgagagg tagccac 27
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cggacaactg cgagtatgct ggcag 25
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggcatggatt cagcactaga tgcacg 26
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggg 40

Claims (7)

1.一种用于鉴定中药材五加皮的引物对,其特征在于,所述引物对及其序列为:P1,SEQID NO.1~2;P2,SEQ ID NO.3~4;P3,SEQ ID NO.5~6。
2.根据权利要求1所述的一种用于鉴定中药材五加皮的引物对,其特征在于,所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5,端加上特异性的GC发卡结构,所述发卡结构的长度为40bp,序列为SEQ ID NO.7。
3.权利要求1或2所述引物对在制备鉴定中药材五加皮试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述试剂盒的组分包括:引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
5.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述试剂盒鉴定中药材五加皮的步骤包括:
(1)提取五加皮样品的基因组DNA;
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板,以P1为特异性引物,进行第一轮PCR扩增;
(3)取步骤(2)的扩增产物,稀释100~1000倍后作为第二轮PCR的模板,以P2作为特异性引物,进行第二轮PCR扩增;
(4)取第二轮PCR扩增的产物,稀释10~100倍后作为第三轮PCR的模板,以P3作为特异性引物,进行第三轮PCR扩增;
(5)收集第三轮PCR扩增的产物,并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述五加皮样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
7.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述PCR扩增的程序为:95℃,2min;95℃,30s,52℃,30s,72℃,55s,35个循环;72℃,7min。
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CN105316325A (zh) * 2015-10-24 2016-02-10 甘肃农业大学 一种基于HMGR 3’-UTR和rRNA ITS的引物及其应用
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