CN102181538B - 辅助鉴定锁阳属植物的方法及其专用引物 - Google Patents

辅助鉴定锁阳属植物的方法及其专用引物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了辅助鉴定锁阳属植物的方法及其专用引物。本发明所提供的用于鉴定锁阳属植物的引物对，由序列表中序列1所示的引物和序列表中序列2所示的引物组成。本发明所提供的辅助鉴定锁阳属植物的方法，包括以下步骤：以待鉴定植物的基因组DNA为模板，用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；测序检测所述PCR扩增产物，若所述PCR扩增产物为1064bp的片段，则确定所述待鉴定植物候选为锁阳属植物。该方法不仅可以弥补中药材的形态鉴别中的主观因素，同时具有用量少、效率高、稳定性高、准确可靠的特点，对于规范锁阳的药材使用有着重要的意义。

Description

辅助鉴定锁阳属植物的方法及其专用引物
技术领域
本发明涉及生物技术领域中辅助鉴定锁阳属植物的方法及其专用引物。
背景技术
锁阳为锁阳科(Cynomoriaceae)锁阳属(Cynomorium L.)植物锁阳(Cynomoriumsongaricum Rupr.)的肉质茎，植物锁阳又名乌兰高腰、不老药、金不换，为多年生全寄生草本植物，专一寄生于蒺藜科(Zygophyllaceae)白刺属(Nitraria L.)植物的根上，锁阳主产于内蒙古、新疆、甘肃、青海、宁夏等地的半荒漠或荒漠地带，是重要的中药和蒙药植物。
锁阳性温、味甘，《本草纲目》中记载：锁阳，大补阴气，益精血，利大便，润燥养筋，治痿弱。现代医学研究表明，锁阳中富含挥发性物质、鞣质类化合物、酚类化合物、三萜类化合物、微量元素和氨基酸等，具有提高免疫功能、清除自由基、抗氧化、防突变、抗癌等活性。锁阳中的熊果酸、熊果酸丙二酸半脂、乙酰熊果酸和缩合鞣质具有很强的抑制艾滋病毒蛋白酶的作用。由于锁阳的特殊药用价值，自古以来被广泛用于临床治疗。
锁阳药材来源于民间采挖，随着锁阳应用价值的提升，滥采乱挖现象愈发严重，野生锁阳资源日益减少。因此，市场上也出现了利用列当混淆使用，也有利用锁阳冒充肉苁蓉、草苁蓉的情况发生。
鉴于锁阳药材资源紧缺以及市场上存在伪品等问题，而传统的形态鉴别要求有一定的经验，对于破碎后的药材就更加难以准确鉴别。因此需要快速、准确鉴别药材真伪的方法。目前对人参、黄芪、管花肉苁蓉等重要药材的分子生物学鉴别方法已有报道，但尚未见到锁阳分子生物学鉴定方法的报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于鉴定锁阳属植物的引物对。
本发明所提供的用于鉴定锁阳属植物的引物对，由序列表中序列1所示的引物和序列表中序列2所示的引物组成。
本发明的另一个目的是提供一种辅助鉴定锁阳属植物的方法。
本发明所提供的辅助鉴定锁阳属植物的方法，包括以下步骤：
以待鉴定植物的基因组DNA为模板，用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；测序检测所述PCR扩增产物，若所述PCR扩增产物为1064bp的片段，则确定所述待鉴定植物候选为锁阳属植物。
以待鉴定植物的基因组DNA为模板，用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；琼脂糖凝胶电泳检测所述PCR扩增产物，若所述PCR扩增产物在凝胶上显示为1000bp-1100bp的条带，则确定所述待鉴定植物候选为锁阳属植物。
所述琼脂糖凝胶电泳是采用1.5％琼脂糖凝胶电泳，在电压为5v/cm下进行。
所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5分钟；然后按照下列参数进行循环反应：94℃变性45秒，58℃～62℃或58℃或60℃或62℃复性40秒，72℃延伸70秒；循环30次；循环反应结束后在72℃保持7分钟。
所述锁阳属植物为锁阳。
所述引物对在辅助鉴定锁阳属植物中的应用也属于本发明的保护范围。
所述锁阳属植物为锁阳。
本发明设计了可以鉴别锁阳的一对高效特异性引物，该引物在给定的反应条件下，能够特异性地鉴别锁阳，对于伪品锁阳不能扩增出相应的DNA片段。本专利所使用的方法直接分析生物基因型而非表现型，所以鉴定结果不受环境因素、样品形态和材料来源的影响。该方法不仅可以弥补中药材的形态鉴别中的主观因素，同时具有用量少、效率高、稳定性高、准确可靠的特点，对于规范锁阳的药材使用有着重要的意义。
附图说明
图1为实施例1中方法Ⅰ的PCR反应产物电泳检测结果。
图2为实施例1中方法Ⅱ的PCR反应产物电泳检测结果。
图3为实施例1中方法Ⅲ的PCR反应产物电泳检测结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
采用北京百泰克生物技术有限公司的新型快速植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)提取肉苁蓉、锁阳、黄花列当、草苁蓉等植物中提取总DNA，利用PCR方法扩增多个基因片段，得到的基因片段纯化后测序，根据锁阳与肉苁蓉、草苁蓉、黄花列当等列当科植物基因片段序列差异较大的区域及锁阳属植物特有的基因序列，设计出一对鉴别性的PCR引物：
引物1：ggagatgggattgcacatgt(序列表中序列1)，
引物2：ccgcagacttgtttcattac(序列表中序列2)。
利用全自动DNA合成仪按上述DNA序列进行合成，即可得到鉴定粉末的白色结晶。
实施例1、鉴定中药材锁阳
方法Ⅰ
一、提取不同样品的基因组DNA
分别以采集自新疆乌鲁木齐市的锁阳(Cynomorium songaricum Rupr.)(购自新疆华世万康连锁药店有限公司和田二街店)、采集自甘肃安西县的锁阳(Cynomoriumsongaricum Rupr.)(购自甘肃锁阳春保健饮品有限公司)、采集自青海海西的锁阳(Cynomorium songaricum Rupr.)(购自青海海西州德令哈市药材批发市场)、采集自内蒙古杭锦旗的锁阳(Cynomorium songaricum Rupr.)(公众可从内蒙古大学获得，记载过该材料的非专利文献是：Ma LJ，Chen GL，Jin SW，Wang CX，2008.The anti-aging effectand the chemical constituents of Cynomorium songaricum Rupr.ACTAHORTICULTURAE.765：23-30.内蒙古大学)和采集自宁夏陶乐的锁阳(Cynomoriumsongaricum Rupr.)(购自宁夏回族自治区平罗县陶乐镇当地药材批发市场)作为待鉴定的样品，同时以肉苁蓉(Cistanche deserticola Ma)(购自于内蒙古福瑞大药房)、草苁蓉(Boschniakia rossica)(购自于内蒙古福瑞大药房)和黄花列当(Orobanchepycnostachya Hance)(公众可从内蒙古大学获得，记载过该材料的非专利文献是：韩继新，杨九艳，邵红霞，鞠爱华，2011.蒙药黄花列当化学成分的研究.内蒙古大学学报(自然科学版).41(6)：669-672)为阴性对照，采用北京百泰克生物技术有限公司的新型快速植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)(产品目录号为DP3111)分别提取以上材料的基因组DNA，具体方法如下：
(1)取0.03g干燥植物茎段组织在研钵中，加入液氮充分碾磨成细粉。
(2)将步骤(1)得到的不同植物组织细粉(新鲜肉苁蓉组织100mg、不同产地干燥锁阳、草苁蓉和黄花列当各30mg)分别加入1.5ml离心管，不解冻，向离心管加入550μl 65℃预热的BufferP1(BufferP1加入0.2％(v/v)β-巯基乙醇)和4μl RNaseA，剧烈涡旋振荡混匀1分钟，室温放置10分钟。
(3)加入130μl BufferP2，充分混匀，12000rpm离心3分钟。
小心吸取上清到一个分离柱A，注意不要吸到界面物质，12000rpm离心1分钟，收集下液。
(4)加入1.5倍体积的BufferP3后，立刻轻柔涡旋，充分混匀。
(5)将上一步所得混合物(包括可能出现的沉淀)加入一个吸附柱AC中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。
(6)加入700μl漂洗液WB(第一次使用前请先在15ml漂洗液WB中加入60ml无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，弃掉废液。
(7)加入500μl漂洗液WB，12000rpm离心1分钟，弃掉废液。
(8)将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心3～5分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
(9)取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50μl洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65℃～70℃水浴中预热)，室温放置3～5分钟，12000rpm离心1分钟收集DNA。
(10)DNA放置在-20℃备用。
通过以上方法分别得到采集自新疆乌鲁木齐市的锁阳、采集自甘肃安西县的锁阳、采集自青海海西市的锁阳、采集自内蒙古杭锦旗的锁阳、采集自宁夏陶乐的锁阳、肉苁蓉、草苁蓉和黄花列当的基因组DNA。
二、聚合酶链式反应(PCR)
分别以步骤一得到的采集自新疆乌鲁木齐市的锁阳、采集自甘肃安西县的锁阳、采集自青海海西市的锁阳、采集自内蒙古杭锦旗的锁阳、采集自宁夏陶乐的锁阳、肉苁蓉、草苁蓉和黄花列当的基因组DNA为模板，以引物1(如序列表中序列1所示)和引物2(如序列表中序列2所示)组成引物对，采用大连宝生物的TaKaRa TaqTM试剂盒(购自大连宝生物公司，产品目录号为DR001AM)，进行PCR扩增，具体方法如下：
(1)反应体系：
该反应体系由待鉴定植物的基因组DNA模板20ng、序列表中序列1所示的引物、序列表中序列2所示的引物、PCR扩增缓冲液、Taq酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、MgCl2和去离子水组成；所述PCR扩增缓冲液由Tris-HCl、KCl和去离子水组成；
以上各成分在反应体系中的浓度分别为：待鉴定植物的基因组DNA模板0.8ng/μl、序列表中序列1所示的引物0.4μmol/L、序列表中序列2所示的引物0.4μmol/L、Tris-HCl(pH8.3)10mM、KCl 50mM、Taq酶0.1U/μl、dATP0.2mmol/L、dCTP0.2mmol/L、dGTP0.2mmol/L、dTTP 0.2mmol/L和MgCl21.0mmol/L。
以上各成分混匀后，瞬时离心。
(2)聚合酶链式反应条件：
该反应在PCR仪上进行，反应条件为：94℃预变性5分钟，然后按下列参数进行30次循环反应：
变性94℃        45秒，
复性58℃        40秒，
延伸72℃        70秒，
循环反应结束后在72℃保持7分钟，PCR反应结束，得到反应产物，将得到反应产物在4℃保存。
三、对PCR反应产物进行电泳检测
分别取步骤二得到的采集自新疆乌鲁木齐市的锁阳、采集自甘肃安西县的锁阳、采集自青海海西市的锁阳、采集自内蒙古杭锦旗的锁阳、采集自宁夏陶乐的锁阳、肉苁蓉、草苁蓉和黄花列当的PCR反应产物5μl，与1μl加样缓冲液混合均匀，用1.5％琼脂糖凝胶(含0.5％溴化乙锭)，在电压为5v/cm下进行检测。同时，以1μl加样缓冲液和5μl不添加DNA模板的PCR反应产物的混合溶液为空白对照。
电泳检测结果如图1所示，图1中，泳道M为1kbDNA分子量梯度，泳道1为采集自新疆乌鲁木齐市的锁阳，泳道2为采集自甘肃安西县的锁阳，泳道3为采集自青海海西市的锁阳，泳道4为采集自内蒙古杭锦旗的锁阳，泳道5为采集自宁夏陶乐的锁阳，泳道6为肉苁蓉，泳道7为草苁蓉，泳道8为黄花列当，泳道9为空白对照。从图1可见，泳道1、泳道2、泳道3、泳道4和泳道5的锁阳样品在琼脂糖凝胶电泳上显示为1000bp-2000bp(具体为1000bp-1100bp，实际上是1064bp)的条带，而泳道6、泳道7和泳道8的阴性对照以及泳道9的空白对照均为未出现1064bp的条带，此结果说明该鉴定方法准确可靠。
四、对PCR反应产物进行测序检测
分别将步骤二得到的PCR扩增产物进行测序，测序结果显示：采集自新疆乌鲁木齐市的锁阳、采集自甘肃安西县的锁阳、采集自青海海西市的锁阳、采集自内蒙古杭锦旗的锁阳、采集自宁夏陶乐的锁阳的扩增产物为1064bp的条带，肉苁蓉、草苁蓉、黄花列当和空白对照的扩增产物未得到1064bp的条带。此结果说明该鉴定方法准确可靠。
方法Ⅱ
一、提取不同样品的基因组DNA
与方法Ⅰ相同。
二、聚合酶链式反应(PCR)
除聚合酶链式反应条件中复性温度为60℃以外，其余方法均与方法Ⅰ相同。
三、对PCR反应产物进行电泳检测
电泳检测方法与方法Ⅰ相同。
电泳检测结果如图2所示，图2中，泳道M为1kbDNA分子量梯度，泳道1为采集自新疆乌鲁木齐市的锁阳，泳道2为采集自甘肃安西县的锁阳，泳道3为采集自青海海西市的锁阳，泳道4为采集自内蒙古杭锦旗的锁阳，泳道5为采集自宁夏陶乐的锁阳，泳道6为肉苁蓉，泳道7为草苁蓉，泳道8为黄花列当，泳道9为空白对照。从图2可见，泳道1、泳道2、泳道3、泳道4和泳道5的锁阳样品在琼脂糖凝胶电泳上显示为1064bp的条带，而泳道6、泳道7和泳道8的阴性对照以及泳道9的空白对照均为未出现1064bp的条带，此结果说明该鉴定方法准确可靠。
四、对PCR反应产物进行测序检测
测序检测结果与方法Ⅰ中无显著差异。
方法Ⅲ
一、提取不同样品的基因组DNA
与方法Ⅰ相同。
二、聚合酶链式反应(PCR)
除聚合酶链式反应条件中复性温度为62℃以外，其余方法均与方法Ⅰ相同。
三、对PCR反应产物进行电泳检测
电泳检测方法与方法Ⅰ相同。
电泳检测结果如图3所示，图3中，泳道M为1kbDNA分子量梯度，泳道1为采集自新疆乌鲁木齐市的锁阳，泳道2为采集自甘肃安西县的锁阳，泳道3为采集自青海海西市的锁阳，泳道4为采集自内蒙古杭锦旗的锁阳，泳道5为采集自宁夏陶乐的锁阳，泳道6为肉苁蓉，泳道7为草苁蓉，泳道8为黄花列当，泳道9为空白对照。从图3可见，泳道1、泳道2、泳道3、泳道4和泳道5的锁阳样品在琼脂糖凝胶电泳上显示为1064bp的条带，而泳道6、泳道7和泳道8的阴性对照以及泳道9的空白对照均为未出现1064bp的条带，此结果说明该鉴定方法准确可靠。
四、对PCR反应产物进行测序检测
测序检测结果与方法Ⅰ中无显著差异。
Figure IDA0000051615900000011

Claims (8)

1.一种用于鉴定锁阳属植物的引物对，由序列表中序列1所示的引物和序列表中序列2所示的引物组成。
2.一种辅助鉴定锁阳属植物的方法，包括以下步骤：
以待鉴定植物的基因组DNA为模板，用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；测序检测所述PCR扩增产物，若所述PCR扩增产物为1064bp的片段，则确定所述待鉴定植物候选为锁阳属植物。
3.一种辅助鉴定锁阳属植物的方法，包括以下步骤：
以待鉴定植物的基因组DNA为模板，用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；琼脂糖凝胶电泳检测所述PCR扩增产物，若所述PCR扩增产物在凝胶上显示为1000bp-1100bp的条带，则确定所述待鉴定植物候选为锁阳属植物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述琼脂糖凝胶电泳是采用1.5%琼脂糖凝胶电泳，在电压为5v/cm下进行。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：
所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5分钟；然后按照下列参数进行循环反应：94℃变性45秒，58℃～62℃复性40秒，72℃延伸70秒；循环30次；循环反应结束后在72℃保持7分钟。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述锁阳属植物为锁阳。
7.权利要求1所述的引物对在辅助鉴定锁阳属植物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述锁阳属植物为锁阳。
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