CN104846101B

CN104846101B - 一种鉴定三七的特异引物对及方法

Info

Publication number: CN104846101B
Application number: CN201510270247.XA
Authority: CN
Inventors: 李文莉; 肖炳燚; 罗晖明; 聂平; 刘丽; 舒毕琼; 丁野; 孙辉
Original assignee: HUNAN INSTITUTE FOR FOOD AND DRUG CONTROL
Current assignee: HUNAN INSTITUTE FOR FOOD AND DRUG CONTROL
Priority date: 2015-05-25
Filing date: 2015-05-25
Publication date: 2017-08-25
Anticipated expiration: 2035-05-25
Also published as: CN104846101A

Abstract

本发明公开了一种鉴定三七的特异引物对及方法。使用此方法鉴别三七的真伪，只需通过简单的DNA提取、PCR特异性扩增、电泳检测即可完成对样品的鉴别。具有操作简单、特异性强、重复性好等优点。主要用于三七药材的快速鉴定。

Description

一种鉴定三七的特异引物对及方法

技术领域

本发明属于中药材鉴定技术领域，具体涉及一种鉴定三七的特异引物对及方法。

背景技术

五加科人参属Panax主要药用植物为：人参Panax ginseng C.A.Mey.、西洋参Panax quinquefolium L.和三七Panax notoginseng(Burkill)F.H.Chen ex C.Chow&W.G.Huang；人参主要产于我国东北三省和朝鲜，被誉为“百药之王”；西洋参原产于美国威斯康辛州和加拿大安大略省；我国市场上的西洋参为进口与引进种植两种。三七主产于云南、广西，为五加科(Araliaceae)人参属(Panax)植物三七Panax notoginseng(Burkill)F.H.Chen的干燥根，是常用名贵中药材，性温，味甘、微苦，具有止血散痪、消肿定痛的功能，其提取物三七皂苷具有强心、活血、促进血液循环等作用，临床用于出血、跌打损伤、胸腹刺痛及痈疽肿毒等，在中医骨伤科、外科、妇科等具有广泛的用途和独特的疗效，加之其价格昂贵。市场上经常出现与其形态相似的伪品充作三七，不仅造成了药材市场的混乱，而且伪品不仅不具有药理作用，甚至可能产生毒副作用，对临床用药安全带来危害。

三者都是我国常用的珍贵药材，人参、三七自1963年起历版《中国药典》均有收载，西洋参自《中国药典2000年版一部》起有收载。上述三者由于来源于同科同属不同种植物的相同部位，因而其内部组织构造、所含化学成分均有很大相似之处，给实际工作中的鉴定增加了难度，对于鉴别单味及成方制剂，难度就更大。目前HPLC法是最常用的鉴别方法，但常出现基线漂移较大、峰分布不均、分离度差或分离出的峰数较少等问题，难以达到理想的鉴定效果。且市场存在相互混用的情况，由于三者药性和药效有很大区别，而传统的分析鉴别方法，是根据形态和组织结构特征和化学成分上鉴别，王贺等采用溶血实验的方法进行鉴别；崔秀明等采用HPLC指纹图谱鉴定；而这些传统的鉴别方法干扰因素较多，易受环境和植物本身的影响和限制；故要求采用先进的鉴定技术进行区分，从而保证患者的用药安全，建立一种用于鉴别三七的方法就具有非常重要的意义。

现代分子生物学技术能从分子水平上客观地反映物种的基因片段差异，克服了传统鉴别方法主观性大、易受干扰等缺点，具有操作简单、特异性强、重复性好、所需检样量小等优点。对传统中药鉴别方法进行补充，将先进的分子生物学技术与传统研究结合起来,是中药研究现代化的重要手段，现行《中国药典》2010年版一部采用聚合酶链式反应法，作为乌梢蛇、蕲蛇炮制品的质量评定方法，标志着分子生物学技术已经作为法定的中药鉴定方法之一，扩充了中药鉴定的科学内涵。本发明通过特异性PCR的方法实现了三七的快速、准确鉴别。目前，尚未有任何公开或报道过本发明所提及的引物对及方法。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种鉴定三七的特异引物对及方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述引物对包括引物F1和引物F2：

引物F1的序列为5’-TTTTTTTAAATAAATTAAATAAATTTAAAG-3’(SEQ ID NO.1)，

引物F2的序列为5’-TTCATCATTATTTCTTTCTTATCTT-3’(SEQ ID NO.2)。

所述鉴定三七的方法包括如下步骤：

(1)采用常规方法提取待测样品的DNA，然后采用本发明所述的引物对对待测样品的DNA进行PCR扩增反应，得扩增产物；

5×Primer STAR Buffer(Mg²⁺plus)5.0μL，dNTPs mixture(2.5mM)2.5μL，鉴别引物F1(10μM)0.75μL，引物F2(10μM)0.75μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase(Takara，2.5U/μL)0.25μL，DNA模板1.0μL，无菌双蒸水补充体系至25μL。

PCR扩增反应参数如下:95℃预变性3min，98℃变性10s，47℃退火15s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃延伸7min。

(2)电泳所述扩增产物，若存在分子量约为241bp的特异条带，则确定待测样品为三七。

关于本发明特异引物对设计的说明：

一、三七、人参、西洋参鉴别引物所锚定的序列具有种内高度保守的特点，且三者之间存在较小的差异，因此设计出一对能鉴别三七的特异性引物的难度相当大：

1.人参、西洋参和三七分别在NCBI进行Blast相似度比较，具有95％以上的相似度，差别极小：人参与西洋参序列Blast比较，相似度98％；人参和三七序列Blast比较，相似度96％；西洋参和三七序列Blast比较，相似度95％。

2.采用DNAMAN软件对三者进行相似度比较，一致性98.82％。

二、发明人在三七、人参、西洋参鉴别引物设计的前后过程长达2年，前期一共设计了30余对引物试图能将三七、人参、西洋参鉴别出来，现略举数例以说明引物设计的艰难筛选过程：

1、UP 5’-TCGGCGATAGTCACATTG-3’(SEQ ID NO.3)

LO 5’-TCGGCGATAGATGCAGTATA-3’(SEQ ID NO.4)

采用普通Taq酶做的温度梯度，人参、西洋参、三七各2个样本，无特异条带。采用Takara(PrimeSTAR HS DNA Polymerase)热启动酶，人参、西洋参、三七各2个样本，退火温度46℃，无特异条带。

2、UP 5’-CGCCCTTCTCATAAGATGTTG-3’(SEQ ID NO.5)

LO 5’-CCCTTCATCGAAAGAGTAGGC-3’(SEQ ID NO.6)

采用普通Taq酶做的温度梯度，人参、西洋参、三七各2个样本，无特异条带。采用Takara(PrimeSTAR HS DNA Polymerase)热启动酶，人参4个样本、西洋参4个样本、三七10个样本，退火温度56℃，从图中可知，西洋参也出现相同的条带，所以，不能鉴别三七。

3、UP 5’-AGCAGGTCAAGAAGTGGATTG-3’(SEQ ID NO.7)

LO 5’-GAAAGAGTAGGCGGTTGAAAG-3’(SEQ ID NO.8)

采用普通Taq酶做的温度梯度，人参、西洋参、三七各2个样本，无特异条带。

4、UP 5’-TTATTTGGATGCGGGATTAC-3’(SEQ ID NO.9)

LO 5’-ATGCAGTATAAGACGCCACA-3’(SEQ ID NO.10)

采用普通Taq酶做的温度梯度，人参、西洋参、三七各2个样本，无特异条带。采用Takara(PrimeSTAR HS DNA Polymerase)热启动酶，人参、西洋参、三七各2个样本，退火温度56℃，无特异条带。

5、UP 5’-AGAGACTGGCGGATTACCCT-3’(SEQ ID NO.11)

LO 5’-TAGGCGGTTGAAAGACCCAC-3’(SEQ ID NO.12)

采用普通Taq酶做的温度梯度，人参、西洋参、三七各2个样本，无特异条带。采用Takara(PrimeSTAR HS DNA Polymerase)热启动酶，人参5个样本、西洋参7个样本、三七5个样本，退火温度52℃，无特异条带。

6、UP 5’-TGCGCCCTTCTCATAAGATAT-3’(SEQ ID NO.13)

LO 5’-ATCGAAAGAGTAGGCGGTTGA-3’(SEQ ID NO.14)

采用普通Taq酶做的温度梯度，人参、西洋参、三七各2个样本，无特异条带。采用Takara(PrimeSTAR HS DNA Polymerase)热启动酶，人参6个样本、西洋参6个样本、三七5个样本，退火温度61℃，西洋参和三七出现一样的条带，无特异条带。

7、UP 5’-TCGGCGATAGTCACATTGCATG-3’(SEQ ID NO.15)

LO 5’-AGATGCAGTATAAGACGCCACA-3’(SEQ ID NO.16)

8、UP 5’-TTTTTTTAAATAAATTAAATAAATTTAAAG-3’(SEQ ID NO.17)

LO 5’-TTCATCATTATTTCTTTCTTATCTT-3’(SEQ ID NO.18)

采用普通Taq酶做的温度梯度，人参、西洋参、三七各2个样本，三七在241bp左右有特异条带。采用普通Taq酶扩大三七样本扩增，部分三七样本无法扩增出条带。采用Takara(PrimeSTAR HS DNA Polymerase)热启动酶，三七样本14份，三七稳定重复出现特异性条带，可以鉴别三七。

由上可知，发明人经过大量探索和实验才得以确定本发明所述的特异引物对。本发明提供了一种能够特异鉴定三七的特异引物对及方法。该方法操作简单、特异性强、样品量少，能快速、准确鉴定三七，为三七鉴定提供了一种实用的检测技术。

附图说明

图1：引物对扩增人参、西洋参及三七PCR鉴别结果

样品编号：1-14为人参，15-28为西洋参，29-42为三七，空白对照(标为“-”)。

M：为DNA分子大小标记(Marker)DNA ladder(50bp),从上至下依次为：500bp、400bp、350bp、300bp、250bp、200bp、150bp、100bp、50bp；

图2：引物对扩增14个药材样本的PCR鉴别结果

样品编号：43为黄精，44为厚朴，45为杜仲，46为牡丹，47为鸢尾，48为枳壳，49为鱼腥草，50为玄参，51为白花前胡，52为紫花前胡，53为陈皮，54为苍术，55为何首乌，56为川贝母，空白对照(标为“-”)。

M：为DNA分子大小标记(Marker)D2000，从上至下依次为：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；

图3：采用通用引物ITS2对所有样本扩增的结果

样品编号：1-14为人参，15-28为西洋参，29-42为三七，43为黄精，44为厚朴，45为杜仲，46为牡丹，47为鸢尾，48为枳壳，49为鱼腥草，50为玄参，51为白花前胡，52为紫花前胡，53为陈皮，54为苍术，55为何首乌，56为川贝母，空白对照(标为“-”)。

具体实施方式

1材料

从不同产地和市场收集人参不同的品种样品共14分，西洋参样品共14份，三七样品共14份，其它药材样品共14份。材料如表1所示：

表1本发明所有样品来源表

2鉴别引物对设计

引物的设计是根据搜索Genbank中人参、西洋参、三七的psbA-trnH基因序列(登录号：HQ112864；HQ112888；HQ112884)，根据其变异区设计出一对特异引物，引物对序列如下：

F1：5’-TTTTTTTAAATAAATTAAATAAATTTAAAG-3’(SEQ ID NO.1),

F2：5’-TTCATCATTATTTCTTTCTTATCTT-3’(SEQ ID NO.2)。

3 DNA提取

用70％乙醇对样本表面擦试消毒，洁净通风处挥干，使用研磨罐进行样本粉碎，各样本称取粉末30mg置于离心管中，采用原平皓生物技术有限公司的新型广谱植物组DNA快速提取试剂盒法提取各种材料的DNA。

(1)取30mg细粉转移到一个1.5mL离心管中，加入400μL缓冲液AP1和4μL RNase A(10mg/ml)，涡旋振荡，充分混匀帮助裂解。

(2)65℃水浴10min，并不时摇动。

(3)加入130μL缓冲液AP2，充分混匀，冰上放置5min，12000rpm离心10min，小心吸取上清到一个新的1.5mL离心管，注意不要吸入界面物质。

(4)计算上清量，加入1.5倍体积的AP3，立即吹打混匀。

(5)将上一步所得混合物(包括可能出现的沉淀)加入到一个吸附柱AC中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30～60s，倒掉收集管中的废液。

(6)加入700μL漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃掉废液。

(7)加入500μL漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃掉废液。

(8)将吸附柱AC放回空收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液残留乙醇抑制下游反应。

(9)取出吸附柱AC，放入到一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加入50μL洗脱缓冲液EB，室温放置3～5min，12000rpm离心1min，将得到的溶液重新加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min。-20℃保存备用。

4 PCR扩增

PCR反应在200μL PCR反应管中进行，反应总体积25μL，反应体系包括：5×PrimerSTAR Buffer(Mg²⁺plus)5.0μL，dNTPs mixture(2.5mM)2.5μL，鉴别引物F1(10μM)0.75μL，引物F2(10μM)0.75μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase(Takara，2.5U/μL)0.25μL，DNA模板1.0μL，无菌双蒸水补充体系至25μL。

为了防止污染和误差的产生，建立阳性对照和空白对照，阳性对照采用通用引物ITS2进行扩增，空白对照为无菌双蒸水。

ITS2引物序列为：

ITS2F:5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’(SEQ ID NO.19)；

ITS3R:5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’(SEQ ID NO.20)。

PCR反应液配制完成后，轻拔反应管底部混匀再离心10s，将PCR管放入PCR仪中，进行如下反应：95℃预变性3min，98℃变性10s，47℃退火15s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃延伸7min。取5μL扩增产物加1μL 6×Loading Buffer混匀，采用1.5％的琼脂糖凝胶，在100V电压下电泳40分钟，在凝胶成像系统下观察并拍照保存。

电泳结果如图1，图2，结果可见，三七能够扩增出241bp的特异条带，而人参，西洋参等其它药材样本均无该条带，表明该方法能够将三七准确的鉴别出来。

Claims

1.一种鉴定三七的特异引物对，其特征在于，所述引物对包括引物F1和引物F2，所述引物F1的序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物F2的序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种鉴定三七的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)采用权利要求1所述的引物对对待测样品的DNA进行PCR扩增反应，得扩增产物；

(2)电泳所述扩增产物，若存在241bp的单一条带，则确定待测样品为三七。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述PCR扩增的反应体系如下：5×，Mg²⁺plus的Primer STAR Buffer 5.0μL，2.5mM的dNTPs mixture 2.5μL，10μM的鉴别引物F10.75μL，10μM的引物F2 0.75μL，2.5U/μL的Takara PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.25μL，DNA模板1.0μL，无菌双蒸水补充体系至25μL，所述PCR扩增反应的参数如下:95℃预变性3min，98℃变性10s，47℃退火15s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃延伸7min。