CN105147819B - 一种黄芪药物组合物在制备治疗乙型肝炎药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种黄芪药物组合物在制备治疗乙型肝炎药物中的用途,所述黄芪药物组合物包含黄芪提取物,所述黄芪药物组合物的联用药物为恩替卡韦。本发明属于医药技术领域,本发明提供了黄芪药物组合物在制备治疗乙型肝炎药物中的用途,通过黄芪药物组合物与恩替卡韦的联合用药,可显著增强抗乙肝病毒的疗效,停药后不易发生反跳现象。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,尤其涉及一种黄芪药物组合物在制备治疗乙型肝炎药物中的用途。
背景技术
乙型病毒性肝炎简称乙肝,是由乙肝病毒(HBV)引起的、以肝脏炎性病变为主,并可引起多器官损害的一种疾病。乙肝的危害巨大,长期的乙肝病毒复制可能导致患者肝脏纤维化、肝硬化、肝腹水、肝癌等严重后果。
乙肝治疗主要包括抗乙肝病毒治疗、提高免疫力和抗炎保肝等方式,其中抗乙肝病毒治疗是最主要的治疗措施。抗乙肝病毒治疗能抑制或清除HBV,防止肝脏功能失代偿、肝硬化、肝细胞癌及其并发症的发生,改善患者生活质量并延长其存活时间。目前临床抗病毒治疗药物的种类繁多,主要有干扰素类、核苷类药物和中药组合物等。干扰素在HBV清除方面的疗效有限,且存在价格昂贵、副作用较多、停药后容易反跳等缺点。核苷类药物包括拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦和替比夫定等,在临床上获得了广泛的应用,但不能从根本上清除病毒,并且长时间用药易引起病毒突变,导致耐药性的产生、停药后容易反跳等缺点。中药组合物由于具有促进肝脏细胞的修复、增强免疫功能和抑制病毒复制等功能,因此也被广泛应用于抗乙肝病毒治疗,且停药后的反跳情况较少,但现有的中药组合物往往起效较慢。
中国专利申请201310032574.2公开了一种取自鲜蒲公英的抗乙肝病毒有效组分组合物,其包括特定的多糖组分、酚酸组分和黄酮组分,该抗乙肝病毒有效组分组合物虽然具有一定的抗乙肝病毒效果,但其制备步骤包括过树脂柱、洗脱等步骤,比较繁琐,不利于产业化。
黄芪性甘,微温,归肺经,有补气升阳、益卫固表之功能。现代医学研究表明,黄芪具有增强机体免疫功能、利尿和抗衰老等作用。中国专利申请201010182249.0公开了一种增强免疫力或延缓衰老的中药组合物,包括黄芪、人参、枸杞子、女贞子、山药、茯苓、淫羊藿、桑葚、墨旱莲、灵芝、陈皮和甘草等制备原料。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题(核苷类药物停药后容易反跳,中药组合物起效较慢),本发明提供一种黄芪药物组合物在制备治疗乙型肝炎药物中的用途,通过黄芪药物组合物与恩替卡韦的联合用药,可显著增强抗乙肝病毒的疗效,停药后不易发生反跳现象。此外,本发明还提供一种含黄芪的中药组合物,单独使用该中药组合物可抗乙肝病毒,达到治疗乙肝的效果。
本发明提供一种黄芪药物组合物在制备治疗乙型肝炎药物中的用途,所述黄芪药物组合物包含黄芪提取物,所述黄芪药物组合物的联用药物为恩替卡韦。
优选地,所述黄芪药物组合物选自黄芪注射液或含黄芪的中药组合物。
优选地,所述含黄芪的中药组合物包括如下重量份数的制备原料:黄芪9~15份、黄连2~5份、丹参5~10份、陈皮2~5份和甘草2~5份。
优选地,所述含黄芪的中药组合物包括如下重量份数的制备原料:黄芪12份、黄连3份、丹参8份、陈皮3份和甘草4份。
优选地,所述含黄芪的中药组合物的制备方法包括如下步骤:
A)称取黄芪,切片,加入25~45%体积百分含量的乙醇溶液,加热回流提取2~3次,滤过,合并滤液,减压浓缩至相对密度1.10-1.25的浸膏,保留滤渣;
B)称取黄连、丹参、陈皮和甘草,与所述滤渣混匀后粉碎,加入50~75%体积百分含量的乙醇溶液浸泡1~3h,煎煮3~6h,滤过,收集滤液,减压浓缩至相对密度1.10-1.25的浸膏;
C)将步骤A)得到的浸膏与步骤B)得到的浸膏混匀,采用真空带式干燥机将浸膏制成干膏粉,即得含黄芪的中药组合物。
更优选地,所述步骤C)中还包括将干膏粉与药学上可接受的附加剂混匀的步骤。
此外,本发明还提供一种含黄芪的中药组合物,所述含黄芪的中药组合物包括如下重量份数的制备原料:黄芪9~15份、黄连2~5份、丹参5~10份、陈皮2~5份和甘草2~5份。
所述含黄芪的中药组合物包括如下重量份数的制备原料:黄芪12份、黄连3份、丹参8份、陈皮3份和甘草4份。
相应地,本发明还提供含黄芪的中药组合物的制备方法,包括如下步骤:
A)称取黄芪,切片,加入25~45%体积百分含量的乙醇溶液,加热回流提取2~3次,滤过,合并滤液,减压浓缩至相对密度1.10-1.25的浸膏,保留滤渣;
B)称取黄连、丹参、陈皮和甘草,与所述滤渣混匀后粉碎,加入50~75%体积百分含量的乙醇溶液浸泡1~3h,煎煮3~6h,滤过,收集滤液,减压浓缩至相对密度1.10-1.25的浸膏;
C)将步骤A)得到的浸膏与步骤B)得到的浸膏混匀,采用真空带式干燥机将浸膏制成干膏粉,即得含黄芪的中药组合物。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:本发明提供了黄芪药物组合物在制备治疗乙型肝炎药物中的用途,通过黄芪药物组合物与恩替卡韦的联合用药,可显著增强抗乙肝病毒的疗效,停药后不易发生反跳现象,防治复发。此外,本发明还提供一种含黄芪的中药组合物,单独使用该中药组合物可抗乙肝病毒,达到治疗乙肝的效果,且不会出现明显的反跳现象。
附图说明
图 1 为PCR筛选的部分凝胶电泳图。
图 2 为洗膜和放射自显影的操作流程图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例一含黄芪的中药组合物
含黄芪的中药组合物包括如下重量份数的制备原料:黄芪12份、黄连3份、丹参8份、陈皮3份和甘草4份。
制备方法包括如下步骤:
A)称取黄芪,切片,加入30%体积百分含量的乙醇溶液,加热回流提取2次,滤过,合并滤液,减压浓缩至相对密度1.20的浸膏,保留滤渣;
B)称取黄连、丹参、陈皮和甘草,与所述滤渣混匀后粉碎,加入60%体积百分含量的乙醇溶液浸泡2h,煎煮5h,滤过,收集滤液,减压浓缩至相对密度1.20的浸膏;
C)将步骤A)得到的浸膏与步骤B)得到的浸膏混匀,采用真空带式干燥机将浸膏制成干膏粉,干燥温度为55℃,即得含黄芪的中药组合物。
实施例二含黄芪的中药组合物
含黄芪的中药组合物包括如下重量份数的制备原料:黄芪15份、黄连5份、丹参6份、陈皮5份和甘草5份。
制备方法包括如下步骤:
A)称取黄芪,切片,加入40%体积百分含量的乙醇溶液,加热回流提取2次,滤过,合并滤液,减压浓缩至相对密度1.15的浸膏,保留滤渣;
B) 称取黄连、丹参、陈皮和甘草,与所述滤渣混匀后粉碎,加入75%体积百分含量的乙醇溶液浸泡1h,煎煮6h,滤过,收集滤液,减压浓缩至相对密度1.20的浸膏;
C) 将步骤A)得到的浸膏与步骤B)得到的浸膏混匀,采用真空带式干燥机将浸膏制成干膏粉,干燥温度为60℃,即得含黄芪的中药组合物。
实施例三含黄芪的中药组合物
含黄芪的中药组合物包括如下重量份数的制备原料:黄芪10份、黄连2份、丹参8份、陈皮3份和甘草3份。
制备方法包括如下步骤:
A)称取黄芪,切片,加入30%体积百分含量的乙醇溶液,加热回流提取2次,滤过,合并滤液,减压浓缩至相对密度1.20的浸膏,保留滤渣;
B)称取黄连、丹参、陈皮和甘草,与所述滤渣混匀后粉碎,加入60%体积百分含量的乙醇溶液浸泡2h,煎煮5h,滤过,收集滤液,减压浓缩至相对密度1.20的浸膏;
C)将步骤A)得到的浸膏与步骤B)得到的浸膏混匀,采用真空带式干燥机将浸膏制成干膏粉,干燥温度为55℃,即得含黄芪的中药组合物。
试验例一 黄芪注射液联合恩替卡韦抗鸭乙肝病毒作用
试验动物:雄性一日龄龙岩麻鸭,购自花都神山孵化场,体重约50克/只,常规饲养。饲养环境:SPF级,温度23℃~26℃,相对湿度60~80%,定时通风换气,每日约12小时光照。饲料:宝鼎501小鸭饲料,购自穗屏企业有限公司饲料厂,符合饲料卫生标准。
主要试剂及仪器:NC膜购自Amersham公司;DHBV质粒由广州中医药大学热带病研究所病毒室提取保存;缺口翻译试剂盒购自promega公司;α-32 p-dCTP由PerkinElmerBoston,MA 02118 USA提供,产品批号为20131101;SepHadex G-50购自pHarmacia公司;XZ-4型旋片式真空泵购自浙江临海市精工真空设备厂;酶联免疫检测仪购自国营华东电子管厂;96孔杂交点样器购自美国Bio-rad公司;盖革氏计数器购自美国S.E.International 公司;先天性引物:根据Genebank公布的DHBV全序列设计的特异性引物由英伟创津(上海)公司合成;PCR扩增Rit购自广州瑞真生物技术有限公司;其他试剂均为常规市售试剂。
、PCR筛选先天性感染DHBV雏鸭实验
将第一次采集的鸭血收集血清,用DNA提取液进行血清DNA提取,提取液组成:0.2mol/L NaOH,1%(w/v)SDS;取20µL血清,加入60µL提取液,混匀后室温放置10min;再加入80μL异丙醇,混匀后4℃,13000rpm离心7min,弃上清,再加入40%异丙醇,10000rpm离心5min洗1次,然后用20μL去离子水溶解沉淀。用PCR方法扩增检测DHBV,结果以1.5%琼脂电泳判断。
PCR引物序列:上游引物:5’gatccactcctgggaaacaa 3’,下游引物:5’cagacagcgtggctaattga3’。
反应体系:25 μL/管,DNA template 22μL,dNTP 2μL,(100pm)primers 0.5μL,10xbuffer 2.5μL,Taq酶 0.25μL,补H2O至25μL总体积。
扩增条件:阶段1:94℃ 5min;阶段2:94℃ 30s;阶段3:56℃ 45s;阶段4:72℃45min;阶段5:返回到阶段2,29个循环;阶段6:72℃ 10min。
反应产物大小约为:598bp。所有PCR产物均以1.5%琼脂糖电泳判断产,阳性为在接近600bp处有特异性条带。
PCR筛选结果:试验动物共有280只雏鸭,其中阳性DHBV雏鸭为105只,阳性率为37.5%,部分凝胶电泳图如图1所示。
、抗鸭乙肝病毒作用的体内实验
黄芪注射液购自正大青春宝药业有限公司;恩替卡韦片,购自中美上海施贵宝制药有限公司。选择对DHBV抑制作用较强的恩替卡韦片作为阳性对照药,剂量:0.1mg/kg。
受试药物:黄芪注射液联合恩替卡韦组分为黄芪注射液联合恩替卡韦高剂量组(简称联合高剂量组,黄芪注射液的剂量为20ml/kg)、黄芪注射液联合恩替卡韦中剂量组(简称联合中剂量组,黄芪注射液的剂量为10ml/kg)和黄芪注射液联合恩替卡韦低剂量组(简称联合低剂量组,黄芪注射液的剂量为5ml/kg)三个剂量组,恩替卡韦的剂量均为0.1mg/kg;恩替卡韦组的剂量为0.1mg/kg;恩替卡韦通过灌胃给药,黄芪注射液通过肌肉注射,每天一次。每周根据动物体重给药,动物体重增加,相应给药剂量亦相应增加。另设病毒对照组(DHBV),以蒸馏水代替药物。每组动物为8只,开始给药时鸭体重约85克/只,21天一疗程。
血样采集为7日龄即用药前(T0)、用药第7天(T7)、用药第14天(T14)、用药第21天(T21)及停药后第5天(P5)、停药后第10天(P10)、停药后第20天(P20),自鸭胫静脉取血,分离血清,-70℃冻存待检。
、DHBV-DNA的检测
3.1 按Promega缺口翻译药盒说明书标记探针
取1ug含DHBV-DNA质粒5μL(其中DHBV DNA为100ng/μL),加100uM dATP、dGTP、dTTP3.5μL,缓冲液5μL,DNA聚合酶和DNA酶5μL,同位素α-32P dCTP 50uci(100uci),加双蒸水(14.5μL)补足50μL。置于15℃水浴2-3小时;加EDTA终止反应。标记物加至用TE平衡液SepHaclex G-50柱(0.6cm×12cm),TE洗脱以上样开始计数,第6滴开始收集,4滴/管,共收集10管。用盖革氏计算器测定各管放射性强度cpm值,取第1峰(大分子峰),放铅盒内4℃冰箱保存。放射强度大于108cpm/ugDNA。结果:测定每分钟放射性强度CPM值。
3.2 膜的处理
(1)硝酸纤维素膜(孔径0.45uM,购自Amersham公司),用蒸馏水和10×SSC浸泡,各30分钟,室温下晾干。
(2)点膜 40μL/样;
(3)变性
变性I 0.5N NaOH 浸泡10分钟
变性Ⅱ 0.6M Nacl,1M Tris,加Hcl调pH7.5 浸泡10分钟
变性Ⅲ 1.5M Nacl 0.5M Tris, 加Hcl调pH7.5 浸泡10分钟
(4)烤膜
将变性后的膜室温晾干,然后放80℃烤箱中,2小时,烤干。
3.3 将烤好的膜杂交和放射自显影
膜杂交就是用变性的经同位素标记的已知病毒DNA片段,同经变性后固定于纤维素滤膜上的待检标本DNA片段进行的特异性结合反应。在进行杂交试验前,先将结合DNA样品的硝基纤维素膜装入可密封的耐温塑料袋内,进行预杂交,目的在于减少非特异性结合,接着才能进行杂交试验,倾去预杂交液,加入经变性的同位素标记的探针DNA于42℃作用48小时。
洗膜和放射自显影的操作流程如图2所示。根据胶片上放射自显影的结果,在酶标检测仪上测定OD值(滤光片波长为490nm),计算血清DHBV-DNA密度,结果如表1所示。对实验数据采用SPSS18.0软件包进行统计分析,多组计量资料分析采用One-way ANOVA,多重比较采用LSD;多组等级资料的分析采用Kruskal-Wallis检验,两两比较采用Nemenyi法。
注:药物组给药不同时间与给药前(T0)比较:**P<0.01,* P<0.05;药物组与病毒对照组相同时间比较:△△P<0.01,△P<0.05。
从表1可知,本次实验病毒对照组动物血清DHBV-DNA水平稳定;阳性药物恩替卡韦口服0.1mg/kg/d×21d可显著抑制血清DHBV-DNA,但停药5d(P5)的DHBV-DNA显著回升;联合高剂量组、联合中剂量组和联合低剂量组三个剂量组以及恩替卡韦组在治疗7天后的鸭血清DHBV-DNA均出现明显下降趋势,与相同时间的病毒对照组相比较具有显著性差异(P<0.01),联合高剂量组、联合中剂量组和联合低剂量组三个剂量组在停药5天、10天后都没有出现明显的反跳,与相同时间的病毒对照组和恩替卡韦组相比较具有显著性差异(P<0.01),而仅联合高剂量组在停药20天后才出现一定的反跳,说明黄芪注射液联合恩替卡韦组三个剂量组都可以显著延缓DHBV-DNA回升,其中联合低剂量组最为明显;而恩替卡韦组则在停药5天后就出现明显的反跳。
试验例二 含黄芪的中药组合物抗鸭乙肝病毒作用
以本发明实施例一制得的含黄芪的中药组合物单独作为试验药物,灌胃给药,高剂量组的剂量为0.1mg/kg,中剂量组的剂量为0.05mg/kg,低剂量组的剂量为0.025mg/kg,考察含黄芪的中药组合物的抗鸭乙肝病毒作用,具体试验方法如实施例一,结果如表2所示。
注:药物组给药不同时间与给药前(T0)比较:**P<0.01,* P<0.05;药物组与病毒对照组相同时间比较:△△P<0.01,△P<0.05。
从表2可知,本次实验病毒对照组动物血清DHBV-DNA水平稳定;阳性药物恩替卡韦口服0.1mg/kg/d×21d可显著抑制血清DHBV-DNA,但停药5d(P5)的DHBV-DNA显著回升;中药组合物高剂量组、中剂量组和低剂量组三个剂量组,恩替卡韦组以及黄芪注射液组在治疗7天后的鸭血清DHBV-DNA均出现明显下降趋势,与相同时间的病毒对照组相比较具有显著性差异(P<0.01);中药组合物高剂量组、中剂量组和低剂量组三个剂量组在停药5天、10天和20天后都没有出现明显的反跳,与相同时间的病毒对照组、恩替卡韦组和黄芪注射液组相比较具有显著性差异(P<0.01),说明本发明提供的黄芪中药组合物单独使用可以显著延缓DHBV-DNA回升,停药后不会出现明显的反跳,而恩替卡韦组和黄芪注射液组则在停药5天后就出现明显的反跳。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明,不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干简单推演或替换,都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种黄芪药物组合物在制备治疗乙型肝炎药物中的用途,其特征在于:所述黄芪药物组合物为黄芪的中药组合物,其由以下重量份数的制备原料组成:黄芪9~15份、黄连2~5份、丹参5~10份、陈皮2~5份和甘草2~5份。
2.根据权利要求 1 所述的黄芪药物组合物在制备治疗乙型肝炎药物中的用途,其特征在于 :所述黄芪的中药组合物包括如下重量份数的制备原料 :黄芪 12 份、黄连 3 份、丹参8 份、陈皮 3 份和甘草 4 份。
3.根据权利要求 1所述的黄芪药物组合物在制备治疗乙型肝炎药物中的用途,其特征在于 :所述黄芪的中药组合物的制备方法包括如下步骤 :
A)称取黄芪,切片,加入25~45%体积百分含量的乙醇溶液,加热回流提取2~3次,滤过,合并滤液,减压浓缩至相对密度 1.10-1.25 的浸膏,保留滤渣 ;
B)称取黄连、丹参、陈皮和甘草,与所述滤渣混匀后粉碎,加入 50~75% 体积百分含量的乙醇溶液浸泡 1~3h,煎煮 3~6h,滤过,收集滤液,减压浓缩至相对密度 1.10-1.25 的浸膏 ;
C)将步骤 A)得到的浸膏与步骤 B)得到的浸膏混匀,采用真空带式干燥机将浸膏制成干膏粉,即得黄芪的中药组合物。
4.根据权利要求 3 所述的黄芪药物组合物在制备治疗乙型肝炎药物中的用途,其特征在于 :所述步骤 C)中还包括将干膏粉与药学上可接受的附加剂混匀的步骤。
5.一种黄芪的中药组合物,其特征在于 :所述黄芪的中药组合物由如下重量份数的制备原料组成:黄芪 9~15 份、黄连 2~5 份、丹参 5~10 份、陈皮 2~5 份和甘草 2~5 份。
6.根据权利要求 5所述的黄芪的中药组合物,其特征在于 :所述黄芪的中药组合物由如下重量份数的制备原料组成 :黄芪 12 份、黄连 3 份、丹参 8 份、陈皮 3 份和甘草 4份。
7.根据权利要求 5 所述的黄芪的中药组合物的制备方法,其特征在于 :包括如下步骤 :
A)称取黄芪,切片,加入25~45%体积百分含量的乙醇溶液,加热回流提取2~3次,滤过,合并滤液,减压浓缩至相对密度 1.10-1.25 的浸膏,保留滤渣 ;
B)称取黄连、丹参、陈皮和甘草,与所述滤渣混匀后粉碎,加入 50~75% 体积百分含量的乙醇溶液浸泡 1~3h,煎煮 3~6h,滤过,收集滤液,减压浓缩至相对密度 1.10-1.25 的浸膏 ;
C)将步骤 A)得到的浸膏与步骤 B)得到的浸膏混匀,采用真空带式干燥机将浸膏制成干膏粉,即得黄芪的中药组合物。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
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