CN103301278B - 一种中药制剂及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中药制剂及应用，该中药制剂由黄连、黄芩、黄芪、枸杞、川芎、槟榔、绞股蓝、苦参和绿茶叶按比例配而成，原料易获得，制备方法简单，适于大规模生产，利用本发明所制得的中药制剂进行小鼠实验，通过分子生物学的方法检测胰岛素启动子因子1(IPF-1)和p53癌基因，发现其通过抑制癌基因过度表达，从而起到了治疗和预防糖尿病效果，在预防糖尿病并发疾病方面将能发挥重要作用。

Description

一种中药制剂及应用

技术领域

本发明涉及生物、医药技术领域，具体涉及一种中药制剂，还涉及一种中药制剂在制备治疗和预防糖尿病药物中的应用，还涉及一种中药制剂在下调p53癌基因mRNA表达中的应用。

背景技术

糖尿病(diabetes)是一种与胰岛素产生和作用异常相关、以高血糖症为主要特征的代谢性疾病，包括以胰岛素绝对缺乏为主的1型糖尿病及以胰岛素相对缺乏和胰岛素抵抗为主的2型糖尿病两种类型。目前，糖尿病在世界范围内已成为继心脑血管疾病、肿瘤之后严重危害人类健康的第三大慢性病。糖尿病是世界公认的顽症之一，人们得了糖尿病后很难治愈，通常需要长期服药；病症的持续期可以长达几十年。糖尿病的主要危害不是糖尿病本身，而是在糖尿病发展过程中出现的各种慢性并发症。虽然现代医学技术已能有效地控制大多数患者的血糖，但仍无法有效地预防和治疗糖尿病引发的慢性并发症。

糖尿病与肿瘤的发生发展及治疗等密切相关,糖尿病与恶性肿瘤的关系也逐渐被人们重视,除糖尿病本身,各种存在于糖尿病患者的代谢异常同样与恶性肿瘤的发生密切相关。胰岛素是一种生长因子,胰岛素通过与胰岛素受体结合(主要是A型胰岛素受体),调节细胞的生长、增殖,在胚胎发育过程中起着十分重要的作用，理论上认为,任何与细胞生长、增殖有关的因素都可能促进肿瘤的发生发展。研究发现,许多恶性肿瘤细胞,如乳腺癌、卵巢癌等,都存在A型胰岛素受体的过度表达,过度表达的受体促进了胰岛素介导的肿瘤细胞的分裂、增殖，积极防治2型糖尿病可以有效降低恶性肿瘤的发生风险。改善2型糖尿病及阻断糖尿病致恶性肿瘤的某些信号通路可有效防治恶性肿瘤发生。抑制肿瘤的中药协助治疗2型糖尿病即对控制恶性肿瘤发生发展，也对2型糖尿病的治疗皆有重大的现实意义。

胰岛素启动子因子1(IPF-1)是葡萄糖依赖的胰岛素基因转录调控因子,IPF-1基因突变可使其活性下降,B细胞功能缺陷,并与葡萄糖毒性作用有关。IPF-1基因63位脯氨酸密码子缺失C为年轻的成年发病型糖尿病的遗传学病因,而另一些突变,如D76N、C18R、Q59L、R197H、G212R、P239Q则与2型糖尿病关联,功能测试显示这些突变体在血糖升高时刺激B细胞合成、分泌胰岛素的功能受损。IPF-1基因突变与2型糖尿病呈现显著关联。中药组合物治疗糖尿病好转过程中也伴随着突变基因的修复。

美国外科医师学会(ACS)和美国牙科学会(ADA)总结与建议指出:糖尿病(主要是2型糖尿病)与某些癌症患病风险增加有关(肝癌、胰腺癌、子宫内膜癌、结肠癌/直肠癌、乳腺癌、胆囊癌)。已有证据显示糖尿病与癌症患病和死亡风险增高有关，二甲双胍可能降低癌症患病风险，而外源性胰岛素可能增加癌症的患病风险。

P53基因与人类50%的肿瘤有关，被认为是与人类肿瘤相关性最高的基因，目前发现的有肝癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、软组织肉瘤、卵巢癌、脑瘤、淋巴细胞肿瘤、食道癌、肺癌、成骨肉瘤等，人类肿瘤中P53突变主要在高度保守区内，以175、248、249、273、282位点突变最高。癌症的发生是一个长期、渐变的过程，从正常细胞到形成肿瘤细胞，通常需要十几年甚至更长的时间。所以显示糖尿病发生过程中癌症患病或可能发生的风险增加,在糖尿病治疗中,增加予防癌症发生的组合药物,对糖尿病治疗中予防癌症发生和增进糖尿病治疗效果是十分必要的。

p53基因可分为野生型和突变型，前者为肿瘤的抑制基因，后者为肿瘤的致癌基因，前者的缺失突变或者后者的过量表达与多种肿瘤发生有关。野生型P53蛋白T1/2短，极不稳定，而突变型P53t1/2延长，稳定性增强，表明突变型p53mRNA过度表达可能对肝细胞癌的发生发展起重要作用发现有突变型p53mRNA的高表达，提示突变型p53mRNA过度表达对肿瘤的发生发展起重要作用.

采用p53抑癌基因mRNA表达的实时荧光定量检测方法，可敏感的予示糖尿病发生过程中癌症可能发生的风险。

中草药及天然药物在用于治疗糖尿病已有上千年的历史，中草药及天然药物曾经是预防和治疗糖尿病的的主要手段。尽管近代科学的发展可以使人们通过合成的方法生产出治疗糖尿病的药物，但天然植物药对于预防和治疗糖尿病至今仍然占有重要的位置，有着合成药物无法取代的作用。近年来在研究开发和临床应用降糖天然药物方面作了大量的研究，发现不少中草药及天然药物，如天麻、决明子、丹参、川芎、生大黄、鬼箭羽、黄芪、山楂、黄芩、复方黄连降糖片、胰敏胶囊(黄连、防己、首乌、黄精、石菖蒲、川芎)等,具有降血糖，增加胰岛素敏感性,改善胰岛素抵抗的作用。

中药制剂对治疗癌症，控制肿瘤、肿瘤放化疗减毒增效、改善患者生存质量，甚至在肿瘤的癌前病变、预防复发转移等方面都发挥着不可忽视的作用。也因为中药制剂用于抗肿瘤的毒副作用较小，这类药物也倍受临床医生及癌症患者的青睐。临床应用研究发现中药制剂太平洋红豆杉树皮及树干中的紫杉醇,能有效诱导肿瘤细胞的凋亡。发现癌细胞在其作用过程中,端粒体酶活性逐渐下降,进而诱导细胞的凋亡。苦参碱除具有抗菌消炎、抗氧化、抗病毒等功效外,还有抗肿瘤的作用，证明苦参碱对于小鼠H22实体瘤的生长有明显抑制作用,其抑瘤率达到60%以上。茶叶中的主要成分茶多酚具有清除自由基、抗氧化等功能,并且可以有效地抑制多种肿瘤细胞.茶多酚抑制肿瘤细胞的主要途径之一就是诱导肿瘤细胞凋亡。中药莪术具有活血化淤、消积止痛的功效,其中所含的B-榄香烯是非细胞毒性的抗肿瘤药。

中草药及天然药物在用于治疗糖尿病中如何考虑抑制多种肿瘤细胞发生发展，以及使用与多种肿瘤细胞发生发展，相关的一些癌基因表达的具有明显抑制作用的中草药及天然药物组合到治疗糖尿病药物中，可能提高治疗糖尿病效果，开辟一条高效治疗糖尿病的新的途径。

发明内容

本发明的一个目的是提供了一种中药制剂，由黄连、黄芩、黄芪、枸杞、川芎、槟榔、绞股蓝、苦参和绿茶叶按比例配而成。该中药制剂原料易获得，制备方法简单，对于治疗和预防糖尿病有很好的疗效。

本发明还有一个目的是提供了一种中药制剂制备治疗和预防糖尿病药物中的应用。最新研究发现糖尿病与肿瘤的发生发展及治疗等密切相关,糖尿病发生发展引起癌基因的过度表达也已被证实，本发明提供的中药制剂通过抑制癌基因过度表达，从而起到了治疗和预防糖尿病效果，在预防糖尿病并发疾病方面将能发挥重要作用。

本发明最后一个目的是提供了一种中药制剂在下调p53癌基因mRNA表达中的应用。通过小鼠实验，经用药后p53癌基因mRNA可下调到正常范围。

一种中药制剂，由以下原料按重量份配制而成：

以上所述中药组分均为市售，所述的绿茶叶叶为市场上各种型号。本发明药物组合物的最佳给药方式是口服。

一种中药制剂，由以下原料按重量份配制而成：（优选范围）：

一种中药制剂，由以下原料按重量份配比而成（最佳值）：

一种中药制剂的制备方法，其步骤是：

本发明所提供的植物药组合物是由上述植物提取物来制备，具体制备过程是：按上述比例，称取黄连，黄芩，黄芪，枸杞，川芎，槟榔，绞股蓝，苦参，绿茶叶，粉碎(至50目-100目)，于搪瓷杯中，加所称取组合物重量10倍的水浸泡0.5小时，先用武火，煮沸后，文火煎煮0.5小时，四层纱布过滤，滤渣加所称取组合物重量5倍纯化水，重复上述步骤，合并两次滤液，烘箱50-60℃恒温浓缩至第一次所加纯化水重量的1/5，得一种水煎制剂，分装，-30℃低温保存备用。

一种中药制剂制备治疗和预防糖尿病药物中的应用，其应用过程是：

1）．建立四氧嘧啶小鼠糖尿病模型

小鼠选择：健康、成熟、体重24-26g、ICR种小鼠。

四氧嘧啶剂量：四氧嘧啶采用Sigma公司生产，小鼠禁食16h尾静脉注射四氧嘧啶生理盐水液40mg/kg，分别在注射四氧嘧啶后第4天各测空腹血糖1次，诱导糖尿病高血糖模型。

2）．药物试验设计

正常对照组：随机挑选20只小鼠未注射四氧嘧啶。

糖尿病对照组：随机挑选20只小鼠，注射四氧嘧啶诱导产生高血糖,而且未用药。

中药制剂治疗糖尿病组：随机挑选20只小鼠，注射四氧嘧啶的产生高血糖,而且用中药制剂，采用灌胃法，0.4mL/kg,每天1次治疗。

**正常组和糖尿病组每天灌胃等量的生理盐水,实验40d。

3）糖尿病常规检查

3.1药物对实验性糖尿病小鼠空腹血糖的影响。

3.2药物对小鼠糖耐量的影响。

4）.分子水平检查Insulin promoter factor 1(IPF1)

4.1胰岛素启动子因子1(IPF-1)基因突变检测

胰岛素启动子因子1(IPF-1)是葡萄糖依赖的胰岛素基因转录调控因子,IPF-1基因突变可使其活性下降,B细胞功能缺陷。一些突变,如D76N、C18R、Q59L、R197H、G212R、P239Q则与2型糖尿病关联。IPF-1基因突变与2型糖尿病呈现显著关联。中药制剂治疗糖尿病好转过程中也伴随着突变基因的修复。

具体方法是：

（1）根据胰岛素启动子因子1（insulin promoter factor-1 gene1(IPF1)）的核苷酸序列（GenBank HSU30329）设计胰岛素启动子因子1靶基因核苷酸序列如下：

atgaacggcg aggagcagta ctacgcggcc acgcagcttt acaaggaccc atgcgcgttc

cagcgaggcc cggcgccgga gttcagcgcc agcccccctg cgtgcctgta catgggccgc

cagcccccgc cgccgccgcc gcacccgttc cctggcgccc tgggcgcgct ggagcagggc

agccccccgg acatctcccc gtacgaggtg ccccccctcg ccgacgaccc cgcggtggcg

caccttcacc accacctccc ggctcagctc gcgctccccc acccgcccgc cgggcccttc

ccggagggag ccgagccggg cgtcctggag gagcccaacc gcgtccagct gcctttccca

tggatgaagt ctaccaaagc tcacgcgtgg aaaggccagt gggcaggcgg cgcctacgct

gcggagccgg aggagaacaa gcggacgcgc acggcctaca cgcgcgcaca gctgctagag

ctggagaagg agttcctatt caacaagtac atctcacggc cgcgccgggt ggagctggct

gtcatgttga acttgaccga gagacacatc aagatctggt tccaaaaccg ccgcatgaag

tggaaaaagg aggaggacaa gaagcgcggc ggcgggacag ctgtcggggg tggcggggtc

gcggagcctg agcaggactg cgccgtgacc tccggcgagg agcttctggc gctgccgccg

（2）设计和合成胰岛素基因素启动子因子1(IPF1)上游DNA引物ISPA和下游反义DNA引物ISPB，其核苷酸序列如下：

ISPA：5′-atgaa cggcg aggag cagta-3′

ISPB:5′-cggcg gcagc gccag aagct-3′

（3）配制PCR反应液，其成分如下：

DNA引物ISPA和ISPB、TaqDNA聚合酶、dNTP,PCR每次反应液合计25μl。

（4）PCR扩增：每次反应液25μl中各加入PCR扩增样本和靶基因的质粒DNA对照5μl，混匀。

PCR扩增条件为：94℃3分钟预变性，然后然后93℃30秒---55℃60秒循环40次。

(5)PCR扩增产物DNA测序分析:

以靶基因的质粒DNA测序为参照，检查测序结果的准确性，并以此校正样本测序结果。将校正后样本测序结果与靶基因的质粒DNA的核苷酸序列比较，分析突变位点和密码子变异。

4.2p53癌基因mRNA表达的相对定量检测

（1）根据p53癌基因mRNA序列设计186bp nt靶基因，其靶基因核苷酸序列为：

actgtaccac catccactac aactacatgt gtaacagttc ctgcatgggc

Ggcatgaacc ggaggcccat cctcaccatc atcacactgg aagactccag

tggtaatcta ctgggacgga acagctttga ggtgcgtgtt tgtgcctgtc

ctgggagaga ccggcgcaca gaggaagaga tctccg

（2）根据靶基因序列设计和合成1条上游DNA引物（TP-1）,1条反义下游DNA引物（TP-2）,1条TagMan荧光探针（TP-Y）。

DNA引物是：

TP-1：5′-actgt accac catcc actac-3′

TP-2：5′-cggag atctc ttcct ctgtg-3′

荧光探针是：

TP-Y：5′-FAM-tgtag gcata aattg gtctg tt-TAMARA-3′

(3)选内参基因β-actin（GenBank:BC002409.2）作内部检测基因的表达水平参照标准，

其靶基因核苷酸序列为：

cactggcatc gtgatggact ccggtgacgg ggtcacccac actgtgccca tctacgaggg

gtatgccctc ccccatgcca tcctgcgtct ggacctggct ggccgggacc tgactgacta

cctcatgaag atcctcaccg agcgcggcta cagcttcacc accacggccg agcgggaaat

cgtgcgtgac attaaggaga agctgt

DNA引物核苷酸序列为：

ACT-A(上游)：5′-cactg gcatc gtgat ggact-3′

ACT-B（下游）：5′-ctcct taatg tcacg cacga t-3′

荧光探针核苷酸序列为：

ACT-Y（荧光探针）：5′-FAM-tcacc cacac tgtgc ccatc tac-TAMARA-3′

（4）RNA抽提：在注射四氧嘧啶至高血糖产生，以及使用中药制剂完成治疗糖尿病试验后，取正常对照组、糖尿病对照组、中药制剂治疗糖尿病组的小鼠，处置并取出肝组织，应用RNA抽提试剂(Trizol)提取总RNA。

（5）使用总RNA提取液逆转录合成cDNA：

按p53癌基因mRNA序列逆转录合成cDNA：

设置反应体系，DNA引物TP-1和TP-2，2μg RNA、2.4μL 25mmol/L MgCl2、4μL 5×逆转录缓冲液、1μL 10mmol/L dNTP、20U RNase inhibitor(RN asin)、1μL逆转录酶（AMV）,加DEPC水至终体积为20μL。反应条件:RNA样品在70℃热变性10min,迅速冰浴3min,再依次加入2.4μL25mmol/L MgCl2、4μL5×逆转录缓冲液、1μL10mmol/L dNTP、20URNase inhibitor、1μL逆转录酶,加DEPC水至终体积为20μL.37℃水浴60min,然后95℃5min灭活逆转录酶。

按p53癌基因mRNA序列逆转录合成cDNA：

设置反应体系，DNA引物TP-1和TP-2，2μg RNA、2.4μL25mmol/L MgCl2、4μL5×逆转录缓冲液、1μL10mmol/L dNTP、20U RNase inhibitor(RN asin)、1μL逆转录酶（AMV）,加DEPC水至终体积为20μL。反应条件:RNA样品在70℃热变性10min,迅速冰浴3min,再依次加入2.4μL25mmol/L MgCl2、4μL5×逆转录缓冲液、1μL10mmol/L dNTP、20URNase inhibitor、1μL逆转录酶,加DEPC水至终体积为20μL.37℃水浴60min,然后95℃5min灭活逆转录酶，制备p53抑癌基因mRNA的cDNA备用。

按β-actin mRNA序列逆转录合成cDNA：

设置反应体系，DNA引物ACT-A和ACT-B，其它条件同按p53抑癌基因mRNA序列逆转录合成cDNA，制备β-actin mRNA序列的cDNA备用。

（6）实时定量PCR检测p53抑癌基因mRNA表达：

设置两套反应体系，分别加入p53抑癌基因mRNA及β-actin mRNA的cDNA样品5μl。

p53癌基因mRNA的cDNA反应体系为：

DNA引物TP-1和TP-2，、dNTP、Taq酶、TP-YhW-T(TaqMan探针)、MgCl₂、PCR缓冲液反应终体积为30μL。反应条件:RNA的cDNA样品95-98℃热变性5min,迅速冰浴3min,取5μl加入到25μL PCR反应液中进行PCR反应。扩增条件：93℃，预变性60S；93℃30S，55℃40S，40个循环。

β-actin mRNA的cDNA反应体系为：

DNA引物ACT-A和ACT-B，荧光探针ACT-Y、其它成分以及反应条件同p53抑癌基因mRNA的cDNA反应体系。

（7）实时定量PCR检测结果判断：

使用同一样本的RNA的cDNA PCR扩增CT值比较，参照β-actin mRNA的cDNAPCR扩增CT值进行相对定量测定和比较。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明的中药制剂含有中药制剂治疗糖尿病成功有效的中药成分，最新研究发现糖尿病与肿瘤的发生发展及治疗等密切相关,糖尿病发生发展引起癌基因的过度表达，在糖尿病治愈过程也伴随癌基因的过度表达的下降和基因突变的修复，本发明的药物可有效的抑制癌基因过度表达，提高了治疗和预防糖尿病效果，在预防糖尿病并发疾病方面将能发挥重要作用。

具体实施方式

实施例1

一种中药制剂，由以下组分按重量份配制而成：

该中药制剂的制备方法，其步骤是：

本发明所提供的植物药组合物是由上述植物提取物来制备，具体制备过程是：按上述比例，称取黄连16克，黄芩8克，黄芪18克，枸杞10克，川芎10克，槟榔10克，绞股蓝8克，苦参10克，绿茶叶10克，粉碎，于1000ml烧杯中，加10倍量的水（1000ml）浸泡0.5小时，先用武火，煮沸后，文火煎煮0.5小时，四层纱布过滤，滤渣加500ml纯化水，重复上述步骤，合并两次滤液，烘箱50-60℃恒温浓缩至200ml，得浓度为0.50g/ml的水煎制剂，分装，-30℃低温保存备用。

实施例2-8：

实施例2-8除了各组分配比不同，其制备方法与实施例1相同。

组分	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5	实施例6	实施例7	实施例8
								黄连	10	20	12	16	13	15	17
黄芩	10	15	10	12	11	12	10
								黄芪	18	25	18	20	19	20	20
枸杞	10	15	10	14	13	13	12
								川芎	10	20	10	15	13	15	10
槟榔	10	20	10	15	13	15	18
								绞股蓝	5	15	8	10	9	10	5
苦参	8	15	8	12	10	11	15
								绿茶叶	8	18	8	12	10	15	8

实施例9：一种中药制剂在制备治疗和预防糖尿病中的应用，其应用过程是：

本实施例中所用的中药制剂为实施例1中所制得的中药制剂。

在注射四氧嘧啶的诱导产生高血糖初期,即注射2天开始应用中药制剂治疗糖尿病，并跟踪进行糖尿病常规检查和分子水平检查。

（1）挑选健康、成熟、体重24-26g小鼠30只小鼠，设置正常组、糖尿病组、中药制剂治疗糖尿病组各20只，处理方法如下：

正常组：不注射四氧嘧啶。

糖尿病组：小鼠禁食16h，尾静脉注射四氧嘧啶生理盐水液140mg/kg，第4天各测空腹血糖1次，诱导糖尿病高血糖模型。

中药制剂治疗糖尿病组：小鼠禁食16h，尾静脉注射四氧嘧啶生理盐水液40mg/kg，第4天各测空腹血糖1次，诱导产生高血糖,在发生高血糖初期，使用中药制剂，采用灌胃法，0.4mL/kg,每天1次治疗。

正常组和糖尿病组用生理盐水代替中药制剂灌胃。

（2）小鼠空腹血糖的检查：

在规定时间取小鼠空腹静脉血，测定血糖浓度，给药与未给药血糖浓度测定如下表，反应给药对降血糖浓度有明显效果。

表1对糖尿病模型小鼠空腹血糖浓度的测定

（3）小鼠糖耐量的检查：

在给药实验40d后，小鼠按2g/kg体重的葡萄糖溶液灌胃,按0、30min、2h取尾血测定血

糖值,计算血糖曲线下面积，小鼠糖耐量的测定如下表，小鼠对糖耐量有明显提高。

表2对糖尿病模型小鼠糖耐量的测定

组别	0时（mmol/L)	30min（mmol/L)	120min（mmol/L)
				正常对照组	4.61±0.53	4.78±0.68	4.63±0.69
糖尿病对照组	16.38±2.23	27.51±3.62	22.48±3.27
				中药制剂治疗组	5.58±2.59	7.51±4.66	6.48±3.27

（4）胰岛素受体基因突变检测，具体检测步骤如下：

a.DNA提取液中抽提基因组DNA:中药制剂给药实验40d，采用淋巴分离液分离外周血的白细胞，使用DNA提取液中抽提基因组DNA。

b.设计和合成胰岛素基因素启动子因子1(IPF1)上游DNA引物ISPA和下游反义DNA引物ISPB，其核苷酸序列如下：

ISPA：5′-atgaa cggcg aggag cagta-3′

ISPB:5′-cggcg gcagc gccag aagct-3′

c.配制PCR反应液，其成分如下：

DNA引物ISPA和ISPB、TaqDNA聚合酶、dNTP,PCR每次反应液合计25μl。

d.PCR扩增：每次反应液25μl中各加入PCR扩增样本和靶基因的质粒DNA对照5μl，混匀。PCR扩增条件为：94℃3分钟预变性，然后然后93℃30秒---55℃60秒循环40次。。

e.PCR扩增产物DNA测序分析:

以靶基因的质粒DNA测序为参照，检查测序结果的准确性，并以此校正样本测序结果。将校正后样本测序结果与靶基因的质粒DNA的核苷酸序列比较，分析突变位点和密码子变异。

中药制剂治疗组与糖尿病对照组、正常对照组的IPF1基因与糖尿病关联基因突变发生状况比较如下：

表3IPF1基因与2型糖尿病关联基因突变发生状况

中药制剂治疗组的胰岛素基因素启动子因子1(IPF1)，在给药实验40d后其基因突变发生率明显低于糖尿病对照组，接近正常对照组。

（5）p53癌基因mRNA表达的相对定量检测

a.RNA抽提：在注射四氧嘧啶至高血糖产生，以及使用中药制剂完成治疗糖尿病试验40天后，随机取正常对照组、糖尿病对照组、中药制剂治疗糖尿病组的小鼠各10支，处置并取出肝组织0.5克，应用RNA抽提试剂(Trizol)提取总RNA。

b.使用各组小鼠总RNA提取液逆转录合成p53癌基因mRNA的cDNA,按合成p53抑癌基因mRNA的cDNA的反应体系进行，制备的p53癌基因mRNA的cDNA备用。

c.使用各组小鼠总RNA提取液逆转录合成β-actin mRNA的cDNA,按β-actin mRNA的cDNA的反应体系进行，制备的β-actin mRNA的cDNA备用。

d.实时定量PCR检测p53癌基因mRNA表达检测：

DNA引物TP-1和TP-2，、dNTP、Taq酶、TP-Y(TaqMan探针)、MgCl2、PCR缓冲液，反应终体积为30μL。反应条件:RNA的cDNA样品95-98℃热变性5min,迅速冰浴3min,取5μl加入到25μL PCR反应液中进行PCR反应。扩增条件：93℃，预变性60S；93℃30S，55℃40S，40个循环，记录检测CT值。

e.实时定量PCR检测β-actin mRNA表达检测：

DNA引物ACT-A和ACT-B，荧光探针ACT-Y、其它成分以及反应条件同p53抑癌基因mRNA的cDNA反应体系,记录检测CT值。

f.参照β-actin mRNA的cDNA PCR扩增CT值,对各个样本进行相对定量测定和比较。

小鼠肝组织RNA样本中β-actin mRNA测定值如表4：

表4鼠肝组织RNA样本β-actin mRNA测定值

*正常对照组CT值平均值22.1,糖尿病对照组CT22.7,组合药物治疗组CT22.8。

小鼠肝组织RNA样本中p53癌基因mRNA测定值与β-actin mRNA测定值比值如表5：

表5小鼠肝组织RNA样本p53癌基因mRNA测定值与β-actin mRNA测定值比值

*p53癌基因mRNA测定值与β-actin mRNA测定值比值，正常对照组CT值平均值1.48,糖尿病对照组CT1.015,组合药物治疗组CT1.45。PCR反应测定的CT值与测定的mRNA表达水平成反比关系，测定值结果说明糖尿病对照组的小鼠肝组织样本p53癌基因mRNA呈过度水平的表达，小鼠肝组织样本p53癌基因mRNA表达下调到正常对照组水平。

实施例10：一种中药制剂在制备治疗和预防糖尿病中的应用，其应用过程是：

本实施例中所用的中药制剂为实施例1中所制得的中药制剂。

在注射四氧嘧啶的诱导产生高血糖初期,即注射6天开始，应用组合药物治疗糖尿病，并跟踪进行糖尿病常规检查和分子水平检查。

其步骤是：

（1）步骤同实施例1。

（2）小鼠空腹血糖的检查：

在以下规定时间取小鼠空腹静脉血，测定血糖浓度，给药与未给药血糖浓度测定如下表，反应给药对降血糖浓度有明显效果。

表6对糖尿病模型小鼠空腹血糖浓度的测定

（3）小鼠糖耐量的检查：

在给药实验40d后，小鼠按2g/kg体重的葡萄糖溶液灌胃,按0、015、2h取尾血测定血糖值,计算血糖曲线下面积，小鼠糖耐量的测定如下表，小鼠对糖耐量有明显提高。

表6对糖尿病模型小鼠糖耐量的测定

组别	0时（mmol/L)	30min（mmol/L)	120min（mmol/L)
				正常对照组	4.61±0.61	4.75±0.72	4.68±0.73
糖尿病对照组	18.57±2.33	26.51±3.54	24.36±2.43
				中药制剂治疗组	6.72±2.59	8.16±2.37	6.71±3.38

（4）胰岛素受体基因突变检测

胰岛素受体基因突变检测方法同步骤同实施例1，取PCR扩增产物直接测序。

组合药物治疗组与糖尿病对照组、正常对照组的IPF1基因与糖尿病关联基因突变发生状况比较如下：

表7IPF1基因与2型糖尿病关联基因突变发生状况

中药制剂治疗组的胰岛素基因素启动子因子1(IPF1)，在给药实验40d后其基因突变发生率明显低于糖尿病对照组，接近正常对照组。

（5）p53癌基因mRNA表达的相对定量检测

RNA抽提、p53癌基因mRNA的cDNA合成、β-actin mRNA的cDNA合成、实时定量PCR检测p53癌基因mRNA表达检测、实时定量PCR检测β-actin mRNA表达检测方法同步骤同实施例1,记录检测CT值。

小鼠肝组织RNA样本β-actin mRNA相对定量测定，测定值如表8：

表8鼠肝组织RNA样本β-actin mRNA相对定量测定值

*正常对照组CT值平均值22.3,糖尿病对照组CT23.3,组合药物治疗组CT23.0。

参照β-actin mRNA的cDNA PCR扩增CT值,对各个样本进行相对定量测定和比较，小鼠肝组织RNA样本中p53癌基因mRNA测定值与β-actin mRNA测定值比值如表9：

表9小鼠肝组织RNA样本p53癌基因mRNA测定值与β-actin mRNA测定值比值

*p53癌基因mRNA测定值与β-actin mRNA测定值比值，正常对照组CT值平均值1.51,糖尿病对照组CT1.13,中药制剂治疗组CT1.30。PCR反应测定的CT值与测定的mRNA表达水平成反比关系，测定值结果说明糖尿病对照组的小鼠肝组织样本p53癌基因mRNA呈过度水平的表达，中药制剂治疗组小鼠肝组织样本p53癌基因mRNA表达下调。

实施例9中在注射四氧嘧啶的诱导产生高血糖初期,即注射2天开始应用组合药物治疗糖尿病，组合药物治疗组CT1.45。实施例10中在注射四氧嘧啶的诱导产生高血糖初期,即注射6天开始，中药制剂治疗组CT1.30。治疗组小鼠肝组织样本p53癌基因mRNA表达下调，但比实施例9mRNA表达下调小一些，说明提前使用药物治疗，对糖尿病治疗更好一些。

将实施例2-8中所制备的中药制剂用于相同实验，结果表明p53癌基因mRNA表达下调，可显著降低小鼠的血糖值，因此，本发明所述试剂均可用于制备治疗或预防糖尿病药物中。

Claims (1)

1.一种中药制剂在制备下调p53癌基因mRNA表达药物中的应用；

所述的中药制剂，由以下原料按重量份配制而成：