CN102068513A - 黄连黄芪黄芩组合物在制备防治糖尿病并发症药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种中药有效部位组合物在预防治疗糖尿病并发症的新用途，具体是黄连、黄芪、黄芩有效部位以重量百分比1∶1∶1或2∶2∶1或1∶2∶1的比例组成的组合物，在制备防治糖尿病并发症药物中的应用，特别是在抑制非酶化反应及其终产物药物中的应用。

Description

黄连黄芪黄芩组合物在制备防治糖尿病并发症药物中的应用

技术领域

本发明属中药领域，涉及防治糖尿病并发症的药物，具体的涉及黄连黄芪黄芩三味中药有效部位组合物及其在防治糖尿病并发症中的应用。

背景技术

糖尿病并发症是随糖尿病(diabetes mellitus，DM)病程的延长而导致的眼、肾、神经、血管及心脏等多组织的慢性病变，是糖尿病致死致残的主要原因。早期糖尿病肾病、早期糖尿病心脏病和糖尿病视网膜病变是糖尿病微血管病变的“三联征”，也是糖尿病最常见的并发症。

目前，防治糖尿病并发症主要从以下几个方面进行：1，消除胰岛素抵抗作用，血清胰岛素代偿性升高可促使血栓形成，促使动脉壁沉积和动脉平滑肌增殖，促使水钠潴留和血压升高，加速动脉硬化，造成糖尿病大血管病变；2，调整血脂，血脂紊乱是糖尿病大血管病变的重要危险因素之一；3，阻断蛋白质的非酶糖基化反应，糖尿病的每种慢性并发症都与蛋白质糖化密切相关。糖尿病个体体内蛋白质发生非酶糖基化反应(NEG)，致使终末糖基化产物(AGEs)增多，是导致糖尿病并发症的重要原因之一。AGEs存在于血管、肾脏和神经组织中，通过影响蛋白质的正常功能，从而导致这些脏器损伤，尤其是在糖尿病肾病的发生发展中起着至关重要的作用。抑制NEG发生，减少AGEs的产生是目前研究开发糖尿病并发症药物的热点；4，抗氧化反应，高葡萄糖血症伴有大量自由基产生，脂质氧化增加又反过来刺激糖的自身氧化，造成血管通透性增加，基底膜增厚以及组织器官的损伤；5，抑制多元醇途径的过度活化，糖尿病的高葡萄糖血症状态下，醛糖还原酶活性增加，合成大量山梨醇，山梨醇不能自由进出细胞，造成细胞水肿破裂，另外又

影响了对神经功能重要的肌醇。

目前西药化学合成制剂虽能较有效地控制血糖，但对糖尿病并发症的防治仍缺乏理想的药物和有效的措施。目前中成药中的消渴灵具有良好的纠正脂肪及蛋白质代谢紊乱的作用，糖肾安胶囊可改善血液流变性和坐骨神经内微血管状态。

黄连总生物碱、黄芪多糖和黄芩总黄酮，分别是中药黄连(Coptis chinensis Franch.)，黄芪(Astragalus membranaceus Bge.)和黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的主要有效成分，迄今为止，尚未见有将上述中药的有效联合应用于预防治疗糖尿病并发症的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种中药有效部位组合物在预防治疗糖尿病并发症的新用途，具体涉及黄连黄芪黄芩有效部位组合物在制备防治糖尿病并发症药物中的应用。

本发明所述的中药有效部位组合物由黄连黄芪黄芩提取物组成，制备方法见专利公开号CN101433607。所述的黄连总生物碱、黄芪多糖和黄芩总黄酮由原生药黄连、黄芪和黄芩提取所得，纯度分别为黄连总生物碱≥60％(HPLC检测)，黄芪多糖≥80％(UV检测)，黄芩总黄酮≥80％(UV检测)。

黄连、黄芪、黄芩有效部位组成的组合物重量百分比为：1∶1∶1或2∶2∶1或1∶2∶1。

本发明将黄连总生物碱、黄芪多糖和黄芩总黄酮联合应用，可按常规方法制成药物组合物临床常用制剂，所述药物组合物制剂的剂型可包括：颗粒剂、片剂和胶囊剂等口服固体制剂。

本发明所述药物组合物经体外酶学和动物模型试验，结果证实，组合物体外可显著抑制NEG的进行和糖化终产物AGEs的生成，且优于各自单用效果；体内可改善糖尿病动物糖脂代谢、肾功能相关指标，显著抑制糖尿病动物肾脏、晶状体、红细胞内的醛糖还原酶活性和山梨醇的生成，抑制肝、肾、晶状体组织内还原型谷胱甘肽(GSH)的含量，降低脂质过氧化产物丙二醛(MDA)，提高动物抗氧化能力。表明组合物具有预防和治疗糖尿病并发症的功效，能预防和治疗糖尿病肾病、心脏病和视网膜病变。

附图说明

附图是不同浓度DMF与OD值的线性关系。

具体实施方式

本发明中药组合物的有益效果通过下述实验证实：

实施例1制备药物组合物临床常用制剂

根据所述重量百分比，取黄连总生物碱，黄芪多糖和黄芩总黄酮，其配伍的重量百分比为1∶1∶1或2∶2∶1或1∶2∶1。按常规方法制成药物组合物临床常用制剂，所述药物组合物制剂的剂型，包括颗粒剂、片剂和胶囊剂等口服固体制剂。

实施例2

一、体外实验：黄连黄芪黄芩组合物对非酶化反应及其终产物的抑制作用

(一)材料

小牛血清白蛋白(BSA)购自上海伯奥生物科技有限公司，批号080325；D-葡萄糖，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，氯化钠，氯化硝基四氮唑蓝(NBT)，叠氮钠购自国药集团化学试剂有限公司，批号分别为F20050712，F20080619，F20070810，F20080114，F20080408；碳酸钠，碳酸氢钠购自上海虹光化工厂，批号分别为071014，080212；盐酸二甲双胍片购自上海华氏制药有限公司，批号071113；1-脱氧-1-吗啉果糖(DMF)购自Sigma公司，批号011H4030。

(二)方法

1体外蛋白NEG体系的建立及黄连黄芪黄芩组合物各组分干预实验

在PBS(pH7.4)中加入牛血清白蛋白和葡萄糖使其终浓度分别为40g/L、200mmol/L。上述体系中分别加入终浓度为0.01、0.1、1、5、10mg/mL浓度的氨基胍、二甲双胍、黄连总生物碱、黄芪多糖和黄芩总黄酮以及三者组合物(三种药浓度相等)，每个浓度设4管。另设不加药、不加糖、不加糖和药的对照组。反应体系中加入0.1％的叠氮钠防腐，37℃恒温水浴箱中孵育，于第4周测定非酶糖基化白蛋白的含量，第8周测定非酶糖基化终产物的含量。

2非酶糖基化白蛋白的测定

(1)试剂配制

3mg氯化硝基四氮唑蓝溶于0.1mol/L，pH 10.8碳酸盐缓冲液中，以新鲜配制为佳。精确称取DMF 9.96mg于10ml容量瓶中加小牛血清至刻度，配置成4mmol/L 1-脱氧-1-吗啉果糖标准液，分装保存于-20℃冰箱中。

(2)测定步骤

整个反应体系在96孔板上进行，每个测定孔加入250μl碳酸盐缓冲液，10μl待测定标本10μl，另设空白孔和标准孔分别以10μl小牛血清和4.0mmol/L DMF标准液取代测定标本。37℃预温10min，然后以加入NBT试剂20μl(终浓度为0.25mmol/L)，37℃下反应15min，反应后立即加入10％乙酸20μl终止反应。酶标仪波长530nm进行比色，记录吸光度。根据DMF浓度与相应吸光度标准曲线求得测定标本中糖化白蛋白含量。

(3)DMF标准曲线的确定

在96孔板上分别设定不同浓度的标准孔和相应对照孔。标准孔分别加入2μl、5μl、10μl、20μl、30μl、50μl的DMF标准液，每个浓度设3个复孔，取其平均值。空白孔分别加入相同量的小牛血清，多于10μl的孔减少相应量的碳酸盐缓冲液。37℃预温10min，然后以加入NBT试剂20μl(终浓度为0.25mmol/L)，37℃下反应15min，反应后立即加入10％乙酸20μl终止反应。酶标仪波长530nm进行比色，记录吸光度。根据吸光度和相应DMF的浓度绘制标准曲线。

(4)AGEs的测定

取200μl测定样本于96孔板上，用Biotek荧光酶标仪370nm/440nm检测各样本的荧光吸光值F。并按下式计算抑制率。抑制率＝1-[(F药物-F不加糖)/(F不加药-F不加药和糖)]×100％。

(三)结果

1黄连总生物碱、黄芪多糖和黄芩总黄酮不同浓度下NEG的抑制率

反应体系37℃恒温水浴箱中孵育4周后，各组对NEG的抑制率如表3-1所示，氨基胍和二甲双胍组对NEG的最高抑制率分别为33.9±2.7％和16.7±9.6％。黄芪多糖和黄芩总黄酮具有比较好的NEG抑制活性，最高抑制率分别达到了37.0±7.9％、44.1±7.8％，均超过了两组西药对照，且具有较好的剂量依赖关系。黄连总生物碱对NEG仅有微弱的抑制作用。但是当三者合用时，组合物对NEG的抑制率有较大的提高，最高抑制率达到了61.4±7.4％，超过了各单个组分的抑制作用。

表1黄连总生物碱、黄芪多糖和黄芩总黄酮不同浓度下NEG的抑制率(x±s％，n＝6)

2DMF标准曲线的绘制

不同浓度的DMF标准液与相应OD值之间的线性关系如图3-1所示。DMF浓度在2mg/ml～50mg/ml范围内时，浓度与OD值之间呈良好的线性关系。标准曲线方程为：Y＝46.105X-9.9947，R²＝0.9966。见说明书附图。

3黄连总生物碱、黄芪多糖和黄芩总黄酮不同浓度下AGEs的抑制率

反应体系37℃恒温水浴箱中孵育8周后，各组对AGEs生成的抑制率如表3-2所示，氨基胍浓度为0.01mg/ml对AGEs的抑制率已经达到了67.1±6.0％，高浓度时的抑制率已接近100％(96.0±8.0％)。证明此模型有效可靠。黄连总生物碱、黄芪多糖和黄芩总黄酮都具有比较好的AGEs抑制活性，最高抑制率分别达到了67.8.1±8.6％、72.1±5.1％和72.3±8.9％，且浓度与抑制率有较好的剂量依赖关系。二甲双胍对AGEs的生成仅有微弱的抑制作用。当黄连总生物碱、黄芪多糖和黄芩总黄酮三者合用时，组合物对AGEs的抑制率(86.6±8.5％)优于单个药的抑制活性。

表2黄连总生物碱、黄芪多糖和黄芩总黄酮不同浓度下AGEs的抑制率(x±s％，n＝6)

(四)体外实验小结

结果证实，三个成分中，黄芪多糖和黄芩总黄酮具有较好的抑制NEG的作用，合用具有协同作用；三个成分均有抑制AGEs生成的作用，组合物具有更高的抑制率。

二、体内实验：黄连总生物碱、黄芪多糖和黄芩总黄酮对db/db小鼠糖尿病并发症的防治作用

(一)材料与方法

1实验动物

db/db小鼠48只，体重38±2g，同周龄db/m小鼠10只，16±2g，由上海中医药大学动物中心提供，动物使用许可证号SYXK(沪)2004-0005。

2药物与试剂

罗格列酮购自葛兰素史克天津有限公司，批号07070061。牛血清白蛋白、考马斯亮兰购自南京建成生物工程研究所，批号20070717；尿蛋白试剂盒、GSH检测试剂盒、MDA检测试剂盒、肌酐检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，批号分别为20090327，20090317，20090317，20090327。

3实验仪器

7060全自动生化仪，日本日立公司产品；Synergy 2酶标仪，Biotek公司产品；OneTouch II血糖仪，强生公司产品；5415R、5702R离心机，德国eppendorf公司产品；超低温冰箱U410，英国NBS公司产品；T10basic组织匀浆机，德国IKA公司产品。

4实验方法

(1)动物分组及处理48只db/db小鼠根据血糖、体重随机分为6组，每组8只。阳性对照组、黄连总生物碱组、黄芪多糖组、黄芩总黄酮组和组合物组，模型对照组给予相同体积的水，共给药15周。15周后处死动物，分别取血、肾脏、肝脏，以10％中性福尔林固定24h，常规石蜡包埋切片，HE和PAS染色，PAS切片用于肾脏形态学定量分析，每片随机选取10个正切的肾小球，用肾小球分析软件测量出肾小球面积并按公式计算其体积大小。

(2)黄连总生物碱、黄芪多糖和黄芩总黄酮对db/db小鼠糖、脂代谢的影响实验开始后，每周称一次体重，One touch II测定一次随机血糖。于给药第8、15周全自动生化分析仪测定甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白，并于实验结束后放射免疫法测定血清胰岛素水平，根据试剂盒操作步骤检测。测定糖化血红蛋白。

(3)黄连总生物碱、黄芪多糖和黄芩总黄酮对db/db小鼠糖尿病肾病相关指标的影响肌酐清除率(clearance rate of creatinine，Ccr)，根据Ccr＝[尿肌酐浓度×24h尿量(ml)]/(血肌酐浓度×24×60)计算，结果用ml/min表示。第8、15周分别用代谢笼收集禁食不禁水24h尿液，样本于-20℃冰箱保存待测。尿微量白蛋白的测定采用CBB法，尿肌酐用苦味酸除蛋白法测定，按试剂盒操作说明进行检测。血清肌酐、尿素氮用全自动生化分析仪测定。

(4)黄连总生物碱、黄芪多糖和黄芩总黄酮对db/db小鼠组织内非酶糖基化终产物的抑制作用①黄连总生物碱、黄芪多糖和黄芩总黄酮对db/db小鼠组织内非酶糖基化反应的抑制作用取冻存的动物肾脏、肝脏于4℃下解冻，加入9倍量的0.86％冷生理盐水，匀浆，制备成10％的组织匀浆液，2000rpm离心10min，取上清液。NBT染色测定匀浆液中糖化白蛋白的量间接反应动物组织内的非酶糖基化反应。②黄连总生物碱、黄芪多糖和黄芩总黄酮对db/db小鼠组织内AGEs的抑制作用取冻存的动物的肾脏、肝脏于4℃下解冻，加入9倍量的0.86％冷生理盐水，匀浆，制备成10％的组织匀浆液，2000rpm离心10min，取上清液稀释10倍。取200μl于96孔板，荧光酶标仪测定匀浆液中荧光值，激发波长和发射波长分别为370nm和440nm。用荧光值表示组织匀浆液中非酶糖基化终产物的水平。(5)黄连总生物碱、黄芪多糖和黄芩总黄酮对db/db小鼠多元醇代谢通路的影响①黄连总生物碱、黄芪多糖和黄芩总黄酮对db/db小鼠醛糖还原酶活性的影响处死动物后，迅速取各组动物眼球、肾脏于-70℃冻存。提取各组动物的晶状体和肾脏的AR活性进行检测。②黄连总生物碱、黄芪多糖和黄芩总黄酮对db/db小鼠红细胞、肾脏和晶状体组织中山梨醇含量的影响i标本制备动物处死后，取部分血于抗凝管，4℃、3000rpm离心5分钟，上清液-70℃冻存待测其他指标。沉淀部分为血细胞，4℃的生理盐水洗3次。然后加入等体积的去离子水超声5min制备匀浆液，-70℃冻存。取冻存的肾脏、晶状体于4℃下解冻，加入9倍量的0.86％冷生理盐水，匀浆，制备成10％的组织匀浆液，2000rpm离心10min，取上清液待测。ii样品的制备(苯甲酰化)取10μg/ml的山梨醇标准品和各组动物组织的匀浆液0.5ml，加入0.8倍体积的10％三氯乙酸，混匀，常温下5000g，离心15min。上清液加入无水碳酸钠至终浓度为250mmol/L中和过多的酸。取70μl上清液于2ml离心管，加入20μl 1mol/L的磷酸二氢钾溶液，3μl苯甲酰氯，15μl 8mol/L的氢氧化钠，涡旋震荡5min。然后加入10μl 1.4mol/L的磷酸中和。再加入100μl乙酸乙酯震荡1min。最后取75μl乙酸乙酯相于1.5ml离心管中真空干燥20min。加入25μl乙腈水混合物(70∶30v/v)复融。待HPLC检测。iii色谱分析流动相为乙腈和水，洗脱条件为：0-5min，70∶30-80∶20；5-30min，80∶20-83∶17，流速1.0ml/min。室温，检测波长228nm，柱温箱25℃。以仪器自动积分后峰面积的大小来反应山梨醇的含量。

(6)黄连总生物碱、黄芪多糖和黄芩总黄酮对db/db小鼠抗氧化能力的影响取肾脏、肝脏于4℃下解冻，加入9倍量的0.86％冷生理盐水，匀浆，制备成10％的组织匀浆液，2000rpm离心10min，取上清液待测。还原型谷胱甘肽(GSH)采用比色法测定，脂质过氧化物丙二醛(MDA)采用TBA法测定。

(7)肝脏和肾脏组织的病理学分析对肝脏进行病理切片，HE染色，肾脏进行病理切片，HE和PAS染色。

(二)实验结果

1黄连总生物碱、黄芪多糖和黄芩总黄酮对db/db小鼠血糖、血清胰岛素和血脂的影响

黄连总生物碱能够明显降低db/db小鼠血清的血糖，甘油三酯、胆固醇和胰岛素(P＜0.05)，而黄芪多糖和黄芩总黄酮没有明显作用，组合物能够明显降低血糖、甘油三酯、胆固醇和胰岛素(P＜0.05)。对高密度有升高趋势，低密度脂蛋白有降低趋势，但无统计学意义。

表3黄连总生物碱、黄芪多糖和黄芩总黄酮对db/db小鼠血糖、血清胰岛素和血脂的影响(x±s)

注：“*”与模型组比较P＜0.05，“**”与模型组比较P＜0.01下同。

2黄连总生物碱、黄芪多糖和黄芩总黄酮对db/db小鼠肾功能的影响

黄连总生物碱、黄芪多糖和黄芩总黄酮对血清尿素氮和血清肌酐都有降低趋势，其中黄芩总黄酮和组合物对血清尿素氮有明显降低作用，黄芪多糖和组合物能够明显降低db/db小鼠血清肌酐(P＜0.05)，对尿肌酐和清除率，各组有升高趋势，组合物能够明显降低24h尿微量白蛋白(P＜0.05)。

表4黄连总生物碱、黄芪多糖和黄芩总黄酮对db/db小鼠肾功能相关指标的影响(x±s)

3黄连总生物碱、黄芪多糖和黄芩总黄酮对db/db小鼠非酶糖基化的抑制作用

各组对糖化血红蛋白、肾脏和肝脏的糖化蛋白、AGEs均有降低趋势。其中黄连生物碱能够明显降低糖化血红蛋白和肾脏糖化蛋白，黄芪多糖能明显降低肾脏和肝脏的糖化蛋白、AGEs，黄芩总黄酮能明显降低肾脏的糖化蛋白，和肝脏的糖化蛋白、AGEs，组合物对各指标均有明显降低作用。

表5黄连总生物碱、黄芪多糖和黄芩总黄酮对db/db小鼠非酶糖基化相关指标的影响(x±s)

4黄连总生物碱、黄芪多糖和黄芩总黄酮对db/db小鼠多元醇代谢通路的影响

黄连生物碱降低晶状体山梨醇含量，黄芪多糖对肾脏、晶状体的山梨醇和醛糖还原酶都有降低作用，对红细胞的山梨醇也有降低作用，黄芪多糖和黄芩总黄酮对肾脏、晶状体和红细胞的山梨醇都有降低作用，对肾脏和晶状体的醛糖还原酶也有降低作用，组合物对晶状体和红细胞的山梨醇，肾脏和晶状体的醛糖还原酶有明显降低作用。

表6黄连总生物碱、黄芪多糖和黄芩总黄酮对db/db小鼠多元醇代谢通路的影响(x±s)

5黄连总生物碱、黄芪多糖和黄芩总黄酮对db/db小鼠抗氧化能力的影响

黄连总生物碱对肾脏和肝脏的GSH都有升高作用，对肝脏的MDA有降低作用，黄芪多糖和组合物对肾脏和肝脏的GSH有升高作用，对肾脏和肝脏的MDA有降低作用。

表7黄连总生物碱、黄芪多糖和黄芩总黄酮对db/db小鼠抗氧化相关指标的影响(x±s)

6肝肾组织的病理学分析

HE染色观察肝脏的形态学变化，结果如下：正常组小鼠肝组织结构完整、清楚，肝小叶结构正常。肝细胞排列成肝索状，在中央静脉周围呈放射状分布，细胞呈多边形。模型组动物出现重度肝细胞脂肪变性，呈重度脂肪肝。部分脂滴形成大空泡，将细胞核挤压至一边。肝小叶结构破坏，肝细胞排列不规整，并伴大量肝细胞肿胀。部分呈气球样变，所有模型小鼠均可见到小叶内炎症。黄连总生物碱、黄芪多糖、黄芩总黄酮和组合物组中动物大都较模型组动物有所减轻。光镜下小鼠肾脏病理组织学观察结果如下：正常组小鼠未见明显肾小球、肾小管及间质病变。模型组动物多数肾小球明显增大，肾小球基底膜增厚，肾小球系膜细胞增生、系膜区增宽，少数肾小球出现轻度硬化。部分肾小管出现细胞肥大、空泡变性，管腔变窄。肾间质部分小血管玻璃样变性。PAS染色阳性物质增加；黄连总生物碱、黄芪多糖、黄芩总黄酮和组合物组较模型组病变明显减轻。图像分析结果如表8所示。模型组小鼠肾小球平均面积及体积较正常组明显增大，黄芪多糖、黄芩总黄酮和组合物组较模型组有所减轻。

表8黄连总生物碱、黄芪多糖和黄芩总黄酮对db/db小鼠肾小球体积的影响(x±s)

(三)体内实验小结

结果表明黄连总生物碱、黄芪多糖和黄芩总黄酮组合物对db/db小鼠血糖、甘油三酯、胆固醇和胰岛素有降低作用，起到调节血脂和降低胰岛素抵抗作用；抑制多元醇代谢通路的醛糖还原酶活性和山梨醇的产生；抑制非酶糖基化反应，减少AGEs的产生；抗氧化作用，对糖尿病并发症具有预防治疗作用。由肾功能指标和病理观察表明，该组合物作用确切；肝脏的病理分析也说明组合物对脂质代谢有调整作用。相比组合物中单个成分的作用，组合物能够通过配伍，达到和作用最强的单个成分作用接近或相当的水平，综合各单个成分的作用优势。

Claims (3)

1.黄连黄芪黄芩组合物在制备防治糖尿病并发症药物中的应用。

2.黄连黄芪黄芩组合物体外抑制非酶化反应及其终产物的应用。

3.黄连黄芪黄芩组合物在防治db/db小鼠糖尿病并发症的应用。

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