CN102526656A - 一种预防或/和治疗红细胞增多症的药物或保健食品组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种预防或/和治疗红细胞增多症的药物或保健食品组合物，它含有下述重量配比的原料药制备而成：红景天200-400份、余甘子200-400份、沙棘100-300份、干姜50-150份。本发明还提供了该组合物的制备方法和用途。本发明药物用于预防或/和治疗红细胞增多症、具有缓解体力疲劳功能，作用明确，为临床提供了一种新的选择。

Description

一种预防或/和治疗红细胞增多症的药物或保健食品组合物

技术领域

本发明涉及一种预防或/和治疗红细胞增多症的药物或保健食品组合物。属药物领域。

背景技术

红细胞增多症(polycythemia)以红细胞数目、血红蛋白、红细胞压积和血液总容量显著地超过正常水平为特点。儿童时期血红蛋白超过180g/L(16g/dl)，红细胞压积大于55％和每公斤体重红细胞容量绝对值超过35ml，排除因急性脱水或烧伤等所致的血液浓缩而发生的相对性红细胞增多，即可诊断。红细胞增多症可分为原发性与继发性两大类，原发性的即真性红细胞增多症；继发性的主要是由组织缺氧所引起的。

高原红细胞增多症(简称“高红症”high altitude polycythemia或“高原多血症”)为慢性高原病的一种临床类型，是指人体长期在高原低氧环境下生活，由慢性低氧所引起的红细胞增生过度。临床表现红细胞、血红蛋白、红细胞压积增高，病理改变为各脏器及组织充血、血流淤滞及缺氧性损害。绝大多数病例在海拔3000m以上地区发病，多见于移居男性居民。红细胞增生过度、血粘度增高及缺氧性损害，加重了全身的缺氧，形成因果交替的循环，可发展成出血、血栓形成或局部组织坏死等各种并发症。高原缺氧易使人疲劳，更可导致人体各系统机能、新陈代谢，甚至形态的改变，严重时可危及生命。轻者可通过机体的代偿作用如增强呼吸运动，维持重要生命器官的需要；重者影响能量代谢，导致器官、细胞发生一系列形态结构、机能、代谢的变化及组织、器官的变性坏死。目前治疗高原红细胞增多症的方法有：1、一般治疗：(1)呼吸功能锻炼和减少劳动强度。重症患者应予休息，但不宜绝对卧床。(2)头痛等症状给予对症治疗，避免过多使用镇静剂。2、间歇吸氧：流量1～2L/min，每次1～2h，2～3/d。有条件可对重症患者行高压氧舱治疗。3、重症患者可行血液稀释疗法：一次静脉放血约300ml，同时输入等量或倍量稀释液如复方氯化钠溶液、平衡液、低分子右旋糖酐等，隔周一次，可行2～3次，亦可酌情应用光量子疗法。4、药物治疗：(1)己烯雌酚5mg/d；(2)甲孕酮20mg，3/d。该二药副反应的发生率均较高，应严密观察。5、中医中药：辨证施治，可用龙胆泻肝汤、血府逐瘀汤、大黄赤芍桂枝汤、四物汤等，或用狭叶红景天600mg，2/d，15d一疗程。如文献：汪学文，等，红景天治疗高原红细胞增多症疗效观察，《人民军医》1994年9期，公开了将红景天(Rhodiola rosea)治疗高原红细胞增多症。6、合并颅内压增高者：可用降低颅压药物。由于病程多呈亚急性经过，用较为缓和的利尿剂如醋唑磺胺更为可取。7、抗凝疗法：有血管内栓塞者，抗凝可用肝素或双香豆素。8、有出血者：按出血的原因和部位酌情处理。9、病程长、病情重者待病情稳定后宜转往低处治疗。目前预防或/和治疗红细胞增多症的药物较少，还不能满足临床需求。

发明内容

本发明的技术方案是提供了一种预防或/和治疗红细胞增多症的药物或保健食品组合物。本发明还提供了该组合物的制备方法和用途。

本发明提供了一种预防或/和治疗红细胞增多症的药物或保健食品组合物，它含有下述重量配比的原料药制备而成：

余甘子200-400份、沙棘100-300份、干姜50-150份。

其中，所述的原料药还含有红景天200-400份。进一步优选地，它是由下述重量配比的原料药制备而成：

红景天300份、余甘子300份、沙棘200份、干姜100份。

其中所述的红景天采用中国药典2010年版一部收载的大花红景天。

本发明组合物是由红景天、余甘子、沙棘、干姜的水或有机溶剂提取物为活性成分，加入药品或食品中可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂。

其中，所述的制剂是片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂或口服液。

其中，所述的胶囊剂中每粒含红景天以红景天苷(C₁₄H₂₀O₇)计，不得少于1mg。

本发明还提供了一种制备该组合物的方法，它包括如下步骤：

a、称取各重量配比的原料：

b、加水煎煮，合并煎液，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.05～1.10(50～60℃)的清膏，干燥，加入药品或食品中可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂。

本发明还提供了所述的组合物在制备预防或/和治疗红细胞增多症的药物或保健食品中的用途。

其中，所述的药物是治疗高原红细胞增多症的药物。

本发明还提供了该组合物在制备具有抗疲劳功效的药物或保健食品中的用途。

本发明组合物中大花红景天滋补元气为君药，以余甘子清热化瘀、以沙棘祛风化瘀为臣药，以干姜活血生火为佐药，诸药合用，滋补元气、清热化瘀，相互配伍，缓解体力疲劳、提高缺氧耐受力，可用于预防或/和治疗红细胞增多症，药效明确，药效显著优于同等剂量圣地红景天，且对易疲劳者特别是高原作业者的疲劳症状具有显著的改善作用。

附图说明

图1平原对照组×400

图2平原对照组×400

图3高原对照组×400

图4阳性药物组×400

图5本发明药物高剂量组×400

图6本发明药物低剂量组×400

图7本发明药物对高原多血症模型EPO mRNA表达的影响

图8内参基因β-actin mRNA电泳结果

具体实施方式

实施例1 本发明药物的制备

原料：大花红景天300g    余甘子300g    沙棘200g  干姜100g

辅料：淀粉40g    滑石粉25g    硬脂酸镁5g

以上共制成1000粒胶囊

制法：

以上四味，加水煎煮三次，第一次加水10倍量，第二、三次加水6倍量，每次3小时，合并煎液，离心滤过(每分钟转速3000转)，滤液浓缩至相对密度为1.05～1.10(50～60℃)的清膏，喷雾干燥，制成干膏粉，取干膏粉加入淀粉40g、滑石粉25g、硬脂酸镁5g，混匀，制成颗粒，干燥，过筛，装入胶囊，即得。

实施例2 本发明药物质量控制方法

(1)仪器与试药

仪器：日本岛津LC-10Avp高效液相色谱仪，SPD-10AV紫外检测器；CBL-100恒温箱。N-2000色谱数据工作站(浙江大学智达信息有限公司)。上海必能信CQ-250型超声波清洗器；BP211D、BP121S电子天平(德国Sartorius公司)，薄层色谱硅胶G(青岛海洋化工有限公司)。

试剂：甲醇、四氢呋喃为色谱纯，水为重蒸水。

对照品：红景天苷由中国药品生物制品检定所提供(批号：110818-200404，供含量测定用)。

(2)色谱条件

色谱柱：Diamonsil^TM(钻石)C₁₈ 250×4.6mm 5μm

流动相：甲醇-四氢呋喃-水(5∶2∶93)；流速：1ml/min；柱温：40℃；检测波长：275nm；灵敏度：0.04AUFS。

(3)测定波长的选择

取红景天苷对照品的甲醇溶液，在190～400nm波长范围内进行扫描，结果红景天苷在275nm处有最大吸收(见图1)，故选275nm为测定波长。

(4)流动相的选择

首先使用甲醇-四氢呋喃-水(11∶1∶88)、甲醇-四氢呋喃-水(9∶1∶90)等不同条件作为流动相，结果红景天苷峰形不好，在样品中，与其它组分未能达到基线分离；最后，将流动相调整为甲醇-四氢呋喃-水(5∶2∶93)，结果红景天苷与其它组分均能达到基线分离，且与相邻色谱峰的分离度大于1.5，阴性无干扰，以红景天苷峰计算，理论板数为3000以上。

(5)供试品溶液的制备方法：取本品装量差异项下的内容物，混匀，取1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇50mL，超声处理30分钟，放冷，滤过，用少量甲醇分次洗涤容器及残渣，洗液与滤液合并，挥干，残渣加甲醇使溶解，转移至10mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，精密量取5mL，置氧化铝柱(中性氧化铝2g，用水湿法装柱，加15mL水预洗)上，用70％甲醇洗脱，收集洗脱液，置25mL量瓶中，至洗脱液近刻度时为止，加70％甲醇至刻度，摇匀，即得。

(6)样品测定

取三批中试样品，按拟定的含量测定方法，制备供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液10μL、供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，测定，即得，结果见表1：

表1 样品含量测定结果(n＝2)

由上表可知，三批中试样品红景天苷的平均含量为3.042mg/g(1.065mg/粒)，根据以上测定结果，考虑到药材的来源、产地、加工、贮藏等影响因素，暂定本品每粒含红景天以红景天苷(C₁₄H₂₀O₇)计，不得少于1mg。按成品的重量计算：每100g成品含红景天苷≥250mg。

实施例3 本发明药物中没食子酸的含量测定

1.1.仪器

岛津LC-10Avp高效液相色谱仪，SPD-10AV紫外检测器，AT-330柱温箱；

N2000色谱工作站(浙江大学智达信息有限公司)；

BP211D电子天平(德国Sartorius公司)；

Q-250型超声波清洗器(上海必能信仪器制造有限公司)；

Lambda 35Uv/Vis Spectrometer(美国Perkin Elmer公司)。

1.2.试药

甲醇(色谱纯，Fisher Scientific)、乙腈(色谱纯，Fisher Scientific)、磷酸(85％，分析纯，成都科龙化学试剂公司)、水为去离子纯净水。

没食子酸(含量测定用，中国药品生物制品检定所，110831-200302)。

本发明药物(粉末，由西藏藏医学院提供，批号20080201，按实施例1方法制备)。

1.3.方法与结果

1.3.1.色谱柱

采用十八烷基硅烷键合硅胶柱Hypersil ODS2(4.6mm×250mm，5μm，柱号E1816641，大连依利特公司)；C₁₈预柱(IBBM-612111，大连依利特公司)。

1.3.2.流动相的选择

实验尝试了甲醇-0.2％磷酸、甲醇-0.1％磷酸、甲醇-0.03mol/L十六烷基三甲基溴化铵-N，N二甲基甲酰胺-磷酸(7.5∶82∶7.5∶0.1)。

确定流动相：甲醇-0.03mol/L十六烷基三甲基溴化铵-N，N二甲基甲酰胺-磷酸溶液(7.5∶82∶7.5∶0.1)为流动相，没食子酸峰形对称、尖锐，理论塔板达5000。

1.3.3.检测波长的选择

没食子酸对照品甲醇溶液在200～500nm波长范围内，在215nm和272nm有最大吸收。比较相同色谱条件下样品于215nm和272nm波长下的色谱图，272nm色谱图没食子酸峰可以达到良好的基线分离，峰形良好，因此采用272nm为检测波长。

1.3.4.其它色谱条件

流速0.6ml·min^-1；柱温：30℃；灵敏度：0.08AUFS。

1.3.5.对照品溶液的制备

精密称取没食子酸对照品适量，置100ml量瓶中，加甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为没食子酸对照品溶液贮备液(0.48mg/ml)。

精密吸取上述没食子酸对照品贮备液1ml，置10ml量瓶中，加甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为没食子酸对照品溶液(0.048mg/ml)。

精密吸取上述对照品贮备溶液0.2ml、0.5ml、1ml、2ml、5ml置于10ml量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别吸取上述一系列对照品溶液各5μl注入色谱仪，测定峰面积积分值，以峰面积(Y)为纵坐标，对照品的浓度(mg/ml)(X)为横坐标进行线性回归，得没食子酸回归方程Y＝23934622.57X-20712.58(r＝1)。如表2所示。

结果表明，在0.0096～0.24mg/ml范围内，没食子酸面积积分值Y与没食子酸对照品浓度X(mg/ml)线性关系良好。

表2 线性关系的考察

1.3.6.精密度试验

精密吸取对照品溶液(0.048mg/ml)5μl，重复进样5次，测定峰面积积分值。结果如表3所示。

表3 精密度试验

结果表明：六次测定值的相对标准偏差低于2％，具有较好的精密度。

1.3.7.对照品溶液的稳定性考察

取对照品溶液(0.048mg/ml)，置阴暗处室温密闭放置，于不同时间间隔取出测定其峰面积积分值。测定结果如表4所示。

表4 对照品溶液稳定性考察

结果表明：在12小时内，对照品峰面积积分值的相对标准偏差低于2％，具有较好的稳定性。

1.3.8.供试品溶液制备方法考察

(1)提取方式的考察

取本品粉末约0.1g，精密称定，置于100ml圆底烧瓶中，分别精密加入50ml甲醇，精密称定重量，分别超声处理30min、水浴加热回流30min，取出，放冷，补重，滤过，取续滤液，过0.45μm滤膜，作为供试品溶液，依法测定峰面积积分值，计算含量。结果如表5所示

表5 不同提取方法的考察

结果表明，以回流提取法为好。

(2)提取溶媒的考察

取本品粉末约0.1g，精密称定，置于100ml圆底烧瓶中，分别精密加入50ml甲醇、70％甲醇、50％甲醇、30％甲醇，精密称重，水浴加热回流30min，取出，放冷，补重，滤过，取续滤液，过0.45μm滤膜，作为供试品溶液。依法测定峰面积积分值，计算含量，结果如表6所示。

表6 不同溶媒提取的考察

结果表明：50％甲醇提取效果最好。

(3)溶媒用量考察

取本品粉末约0.1g，精密称定，置100ml圆底烧瓶中，分别精密加入50％甲醇30ml、50ml、60ml，精密称重，水浴加热回流30min，取出，放冷，补重，滤过，取续滤液，过0.45μm滤膜，作为供试品溶液。依法测定峰面积积分值，计算含量，结果如表7所示。

表7 不同提取溶媒用量考察

由表可知：溶媒用量以50ml为宜。

(4)提取时间的考察

取本品粉末约0.1g，精密称定，置100ml圆底烧瓶中，分别精密加入50％甲醇50ml，精密称重，分别水浴加热回流15min，30min，60min，取出，放冷，补重，滤过，取续滤液，过0.45μm滤膜，作为供试品溶液。依法测定峰面积积分值，计算含量，结果见表8。

表8 提取时间考察

由表可知：回流提取30min较好

(5)供试品溶液制备方法考察结果

供试品溶液制备的适宜方法为：取本品粉末约0.1g，精密称定，置于100ml圆底烧瓶中，加入50％甲醇50ml，水浴加热回流30min，取出，放冷，补重，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45μm滤膜，即得。

1.3.9.重复性试验

按拟定的含量测定方法，取同一批号样品，平行制备供试品溶液，依法测定峰面积积分值，计算含量。结果如表9所示。

表9 重复性试验

结果表明：6份样品测定值的相对标准偏差低于2％，本法具有较好的重复性。

1.3.10.加样回收率试验

取已知含量的样品粉末，取0.05g(6份)，精密称定，各精密加入没食子酸(0.48mg·ml^-1)对照品溶液0.8ml，按正文没食子酸含量测定方法进行测定，计算回收率，结果如表10所示。计算公式为：

表10 回收率试验

结果表明：本方法具有较好的回收率。

1.3.11.样品测定

按正文没食子酸含量测定方法，测定三批样品的含量，结果如表11所示。

表11 样品含量测定结果

根据以上含量测定结果，暂定本品含量限度为：本品每1g含以没食子酸计算，不得少于5.5mg。

实施例4 本发明药物的制备

原料：大花红景天300g    余甘子300g    沙棘200g

辅料：淀粉40g    滑石粉25g    硬脂酸镁5g

以上共制成1000粒胶囊

制法：

以上三味，加水煎煮三次，第一次加水10倍量，第二、三次加水6倍量，每次3小时，合并煎液，离心滤过(每分钟转速3000转)，滤液浓缩至相对密度为1.05～1.10(50～60℃)的清膏，喷雾干燥，制成干膏粉，取干膏粉加入淀粉40g、滑石粉25g、硬脂酸镁5g，混匀，制成颗粒，干燥，过筛，装入胶囊，即得。

实施例5 本发明药物的制备

原料：余甘子300g  沙棘200g  干姜100g

辅料：淀粉40g  滑石粉25g  硬脂酸镁5g

以上共制成1000粒胶囊

制法：

以上三味，加水煎煮三次，第一次加水10倍量，第二、三次加水6倍量，每次3小时，合并煎液，离心滤过(每分钟转速3000转)，滤液浓缩至相对密度为1.05～1.10(50～60℃)的清膏，喷雾干燥，制成干膏粉，取干膏粉加入淀粉40g、滑石粉25g、硬脂酸镁5g，混匀，制成颗粒，干燥，过筛，装入胶囊，即得。

以下通过具体药效学试验证明本发明的有益效果。

试验例1 本发明药物对家兔血瘀模型的影响

采用家兔耳缘静脉注射10％高分子右旋糖酐(50万单位)生理盐水溶液，10min内家兔微循环中即出现以细胞聚集为主的各种微循环障碍表现，造成以循环障碍为主的全身性血液循环系统改变血瘀证模型。高分子右旋糖酐是蔗糖经白念珠菌左右后形成的水溶性聚合物。经静脉注射高分子右旋糖酐后出现的微循环障碍，以红细胞聚集表现最为明显，其机制主要是大分子物质的架桥作用，即高分子右旋糖酐能被红细胞吸附，从而在红细胞和红细胞间起到桥梁作用，导致红细胞聚集。采用测定模型动物红细胞切变率、血浆粘度、压积、红细胞聚集指数、刚性指数等指标，观察本发明药物对高分子右旋糖酐引起的全身性血液循环系统改变血瘀证模型的影响。SOD对机体的氧化和抗氧化平衡起着重要作用，它的高低间接反应了机体清除自由基的能力，MDA的高低可反应机体脂质过氧化的程度，间接反应了机体细胞受到自由基攻击的严重程度，通过SOD与MDA结果分析，可以了解细胞抗氧化作用。

方法：健康未孕家兔60只，雌雄各半，体重2.0-2.4kg，随机分为6组，分别为空白对照组、模型对照组、阳性药对照组、本发明药物高、中、低剂量组。各组家兔均单笼饲养，观察3d后，各给药组按剂量灌胃给药，对照组和模型组给予等体积蒸馏水，每天1次，连续3d。末次给药后1h，除空白对照组外，其余各组家兔均耳缘静脉注射10％高分子右旋糖酐(50万单位)生理盐水溶液5ml·kg^-1，微循环中即出现以细胞聚集为主的各种微循环障碍表现。颈动脉取血5ml置肝素抗凝管(1％肝素生理盐水，0.5ml，100℃下干燥)，检测相关指标。其结果见表12、13、14、15。

表12 本发明药物对家兔血瘀模型的影响

表13 本发明药物对家兔血瘀模型的影响

注：空白组、复方丹参滴丸组、本发明药物高、中、低各组均与模型组比较，^***P＜0.001，^**P＜0.01，^*P＜0.05，下同。

表15 本发明药物对血瘀模型家兔SOD、MDA的影响

以上结果显示，本发明药物可以降低高分子右旋糖酐致家兔血瘀模型的高、中、低切变率下的全血粘度、血浆粘度，减轻红细胞压积、降低纤维蛋白原浓度、抑制红细胞聚集、增强红细胞变形能力(P＜0.05～0.001)，对红细胞刚性指数和变形指数具有降低的趋势，但无统计学意义(P＞0.05)。同时本发明药物能够提高SOD水平(P＜0.05～0.01)，降低MDA水平(P＜0.05～0.01)，具有良好的抗氧化作用。其作用机制通过减轻红细胞压积、降低纤维蛋白原浓度、抑制红细胞聚集、增强细胞抗氧化作用来实现，可能还与增强红细胞变形能力等有关。

试验例2 本发明药物治疗高原多血症作用机制的研究

采用目前比较先进的高原环境模拟舱，复制高原多血症动物模型。方法：将SD大鼠40只，随机分为平原对照组(海拔221m)、高原模拟组(海拔5000m)、诺迪康治疗组(海拔5000m)、本发明药物高剂量组(海拔5000m)、本发明药物低剂量组(海拔5000m)，每组8只，采用高原环境模拟舱模拟高度5000m、每天22小时(剩余2小时为灌胃给予治疗药物、饲料，清洁鼠笼时间)，连续40天；每隔一天腹腔注射CoCl₂溶液5.5mg/kg.bw.。第40天，20％乌拉坦麻醉后，经大鼠眼眶后静脉丛取血测定红细胞、血红蛋白和红细胞压积，确定高原多血症动物模型复制成功与否。分别按组别采用口服灌胃方式给药，平原对照组、高原模型对照组给予消毒蒸馏水1ml/100g·d；诺迪康对照组(诺迪康胶囊，为单味药圣地红景天提取物制剂，【规格】每粒装0.28克；【用法用量】口服。一次1～2粒，一日3次。大鼠等效剂量折算：(0.28g/次×2粒/日×3次)/60kg×5倍量＝0.14g/kg)，每天给诺迪康水溶液1.0ml/100g·d；本发明药物高剂量组为0.16g/100g·d，本发明药物低剂量组为0.04g/100g·d，连续给药40天。各组动物每周称重一次，依照体重调整给药量。

2.1.本发明药物对高原多血症模型动物血常规的影响

上述模型动物表现出畏寒喜暖，蜷缩少动，反应迟钝，被毛蓬松，毛无光泽，爪、尾部肤色黯红；其唇、舌紫黯，耳色黯红，与高红症患者多血面容极为相似。于实验第40天20％乌拉坦麻醉后，经眼眶后静脉丛取血，采用日本sysmex公司poch-80i多参数全自动全血分析仪测定红细胞数、血红蛋白和红细胞压积，结果见表16：

表16 本发明药物对高原多血症模型动物血常规的影响

上述结果表明，高原多血症模型复制成功，血常规检查显示：高原模型组动物红细胞数、血红蛋白、红细胞压积均显著高于平原对照组(P＜0.001)，本发明药物高剂量组血红蛋白显著低于高原模型组(P＜0.05)，而诺迪康组、本发明药物低剂量组测定结果仅显示降低红细胞、血红蛋白和红细胞压积趋势(P＞0.05)，不具备统计学差异。表明本发明药物高剂量组对高原多血症有一定治疗作用。

2.2.本发明药物对高原多血症模型动物血清EPO的影响

复制成功的高原多血症模型动物治疗组在口服灌胃给药治疗40天后，用10％乌拉坦麻醉，固定动物，分离暴露股静脉，插入导管，抽取静脉血加入5ml离心管中，待凝固后，4℃3000rpm离心，10min，取上层血清置于1.5ml离心管中，放置入-70℃冰箱，待标本取完后共同测定。测定前将样本放置于室温复融，再次4℃3000rpm离心，5min，取上清液测定。利用液相竞争抑制原理，采用平衡法对样品进行测定。待测样品与限量的抗血清及标记抗原加在一起进行竞争结合反应，反应完全后，加入免疫分离剂，分离出抗原-抗体复合物，采用中国科大中佳公司GC-911γ免疫计数器测定复合物的放射性(B)计算各标准管的结合率(B/BO％)。以B/T计算NSB、S0结合率，以B/BO计算标准及待测样品结合百分率，由自动γ计数器预先编制程序，直接给出有关参考，标准曲线及样品浓度。

NSB％＝(NSB管的cpm数÷T管cmp数)×100％

Bo％＝(Bo管的cpm数-NSB管的cmp数)÷T管cmp数×100％

B/Bo％＝(标准管或样品管的cpm数-NSB管的cpm数)÷(Bo管的cpm数-NSB管的cpm数)×100％

表17 本发明药物对高原多血症模型动物血清EPO的影响

血清EPO浓度测定检查显示：高原模型组动物血清EPO浓度均显著高于平原对照组(P＜0.01)，本发明药物低剂量组模型动物血清EPO浓度与高原模型组相比显著降低(P＜0.05)，而诺迪康组、本发明药物高剂量组测定结果与高原模型组相比，仅显示降低血清EPO浓度积趋势(P＞0.05)，不具备统计学差异。表明本发明药物低剂量对高原多血症，能够降低血清EPO浓度，具有一定治疗作用。

2.3.本发明药物对高原多血症模型脑组织损伤病理形态学检查的影响

方法：上述实验动物中，每组随机选取6只大鼠，10％乌拉坦麻醉后，打开胸腔、暴露心脏，剪开心包，找到主动脉，使之游离并在其下方穿线，灌注针头穿刺入主动脉后结扎穿线，剪刀剪开右心耳，先灌注生理盐水约200ml，待右心耳流出液体变得清亮、肺脏与肝脏因失血变白时，换用4％多聚甲醛约200ml灌注固定，待动物出现四肢剧烈抽搐、尾巴僵硬后，断头取脑，取前囟后3-6mm部分，4％多聚甲醛后固定4-6h，脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，片厚5μm。普通光镜下读片分析，判断标准见表18。

表18 脑组织损伤判断标准

组织学观察提示：高原模型组，以充血、出血、肿胀为主要病变，多数脑组织灶性溶解、脑细胞萎缩，胞浆及核深染。镜检可见神经细胞明显减少，皮质水肿，大量炎性细胞浸润。阳性药组，以充血、肿胀为主要病变，部分标本可见出血，部分脑组织灶性溶解、脑细胞萎缩，胞浆及核深染。神经细胞明显减少，皮质水肿明显。高剂量组，灰质和白质水肿，伴有灶性溶解，部分标本出现血管充血。脑细胞萎缩较轻，神经细胞数减少，皮质水肿不明显。低剂量组，灰质和白质水肿较轻，伴有灶性溶解，脑细胞萎缩较轻。神经细胞数未见明显减少。组织学评分及细胞数目统计分析见表19、表20

表19 本发明药物对高原多血症模型脑组织细胞数的影响

上述病理结果显示，本发明药物低剂量、高剂量组有对高原缺氧性的脑损伤有一定治疗效果。

2.4.本发明药物对高原多血症模型脑组织HIF-1α蛋白表达的影响

在前期药效实验中显示，本发明药物能够明显降低高原多血症模型动物血常规中血红蛋白含量，对降低红细胞数、红细胞压积也有一定作用，且呈较显著量效关系，同时降低模型动物血清EPO含量，对高原多血症具有一定的治疗作用。本研究针对本发明药物对高原多血症的治疗作用，采用免疫组织化学方法，通过检测模型动物脑组织中HIF-1α表达，以明确其作用靶点。

每组随机选取4只大鼠，10％乌拉坦麻醉后，打开胸腔、暴露心脏，剪开心包，找到主动脉，使之游离并在其下方穿线，灌注针头穿刺入主动脉后结扎穿线，剪刀剪开右心耳，先灌注生理盐水约200ml，待右心耳流出液体变得清亮、肺脏与肝脏因失血变白时，换用4％多聚甲醛约200ml灌注固定，待动物出现四肢剧烈抽搐、尾巴僵硬后，断头取脑，取前囟后3-6mm部分，4％多聚甲醛后固定4-6h，脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，片厚5μm。从上述切片中选取4张进行免疫组化检测，各组所取部位相同，检测皮质区和海马区HIF-1α的表达。对HIF-1α检测采用SABC免疫组织化学染色法。每张切片显微镜下分别随机选取缺血区内的4个视野，进行HIF-1α阳性细胞数计数。

HIF-1α的染色步骤(SABC法)

1)切片脱腊：二甲苯常规脱腊2次，每次10min。脱腊后切片依次放入100％、95％、85％、75％乙醇中各5min，PBS漂洗2次，每次5min。

2)每张切片滴加3％H₂O₂ 50μl，室温下孵育10min，以灭活内源性过氧化物酶，PBS漂洗3次，每次5min。

3)微波热修复抗原：将切片侵入枸橼酸缓冲液(PH6.0)中，微波加热至92℃-98℃，维持12-15min，自然冷却，PBS漂洗2次，每次5min。

4)切片上滴加正常山羊血清封闭液50μl，室温孵育30min，甩去多余液体，不洗。

5)滴加一抗兔抗大鼠HIF-1α多克隆抗体(1∶100)，湿盒内4℃冰箱过夜。

6)PBS漂洗3次，每次2min。

7)切片滴加生物素标记的二抗IgG，37℃孵育20min，PBS漂洗3次，每次2min。

8)滴加SABC液，37℃孵育20min，PBS漂洗4次，每次5min。

9)DAB显色：分别取DAB试剂盒中A、B、C液各一滴加入1ml蒸馏水中，依次混合，避光，半小时内使用。在显微镜下显色6-10min，自来水中止反应。

10)复染：苏木素淡染细胞核2min，清水冲洗，梯度乙醇脱水(75％酒精5min→85％酒精5min→95％酒精5min→无水酒精5min)，二甲苯透明，中性树胶封片。

结果见图1，2，3，4，5，6。

上述结果显示，HIF-1α阳性细胞光镜下见胞核或胞浆呈棕褐色或棕黄色。平原对照组大鼠有少量HIF-1α蛋白表达，主要分布在皮质及海马，神经元及胶质细胞均有表达，偶见核表达。高原模型组HIF-1α阳性表达明显增加，光镜下包浆呈棕黄色，染色较淡，散在分布，主要分布在皮层、海马。高原模型组、阳性药物组及本发明药物高、低剂量各组可见较多的HIF-1α阳性表达细胞，主要分布于皮质、海马、纹状体及室管膜细胞等，神经元与胶质细胞均有表达。各组HIF-1α蛋白表达结果见表21。

表21 本发明药物对高原多血症模型脑组织HIF-1α的影响

以上结果表明：高原模型组HIF-1α表达显著强于平原对照组(P＜0.001)，本发明药物高剂量组HIF-1α低于高原模型组(P＜0.05)，而诺迪康组、本发明药物低剂量组测定结果仅显示HIF-1α表达减弱趋势(P＞0.05)，不具备统计学差异。表明本发明药物高剂量组对高原多血症模型动物降低HIF-1α表达有一定作用，可能为治疗高原多血症机制之一。

2.5.本发明药物对高原多血症模型EPO mRNA表达的影响

前期实验本发明药物对高原多血症有治疗作用，其作用机理与调控缺氧基因HIF-1α，增强其表达有关，由此我们推论，在缺氧条件下，调控缺氧基因HIF-1α表达量的同时，调节发生转录水平，下游基因EPO mRNA采用半定量RT-PCR方法，通过检测模型动物EPO mRNA表达，以明确其作用靶点。

每组随机选取5只大鼠，将动物处死取肾脏，置于冰上约5min，剥取肾脏皮质，称重后置于RNAguard液中，并存放于-70℃冰箱。总RNA采用北京天根生物技术有限公司RNAsimple Total RNA Kit试剂盒提取，采用测定吸光度确定RNA纯度。引物由上海生工生物工程技术公司合成。

EPO

上游引物：5GCTTCGTGACCCTCTGTT3

下游引物：5TCCAATCTTTGTGGCATC3

产物位置：2685-2816

产物长度：132

退火温度：52

b-actin

上游引物：5CACCCGCGAGTACAACCTTC3

下游引物：5CCCATACCCACCATCACACC3

产物长度：207

退火温度：60

所提RNA采用超微量紫外分光光度计(ND-100型，Gene Company Limited生产)测定RNA OD₂₆₀/OD₂₈₀约为1.9-2.1，提示所提取RNA纯度较高。

运用实时荧光定量PCR测定系统(DNA Engine OPTICON，MJ ResearchOP001371)对已知浓度RNA进行反转录，将得到cDNA以9倍体积无RNase水进行梯度稀释，作为标准品与测定样品同时进行PCR反应，待反应结束后，机器自动读取Ct值。

RT-PCR扩增：

采用宝生物(大连)有限公司SYBR

PrimeScriptTM RT-PCR Kit试剂盒进行两步法扩增反应。

RT反应：

Sample RNA量：Total RNA 100ng。

反应体积：10μl。

反应条件：37℃ 15min；

          85℃ 5sec。

RT-PCR反应：

使用cDNA量：2μl(RT反应液)。

反应条件：预变性：95℃ 10sec；

          变性：95℃ 5sec；

          退火/延伸：60℃ 30sec；40个循环.

β-actin除进行18个循环外，其余RT-PCR操作同EPO。

标准曲线图提示，相关系数r-Squared＝0.998＞0.998，斜率-0.25，提示线性关系良好。

RT-PCR反应结束后，取5μl样品加入1μl 1％溴酚兰混匀，进行2％琼脂糖凝胶电泳，结果如下。

在紫外灯观察下，2％琼脂糖凝胶电泳结果显示：EPO mRNA长度132bp，β-actin mRNA长度207bp，目标条带清晰。表明引物特异性较好，体外扩增mRNA成功。

表22 本发明药物对高原多血症模型EPO mRNA表达的影响

以上结果表明：高原模型组EPO mRNA表达显著强于平原对照组(P＜0.01)，本发明药物高剂量组EPO mRNA低于高原模型组(P＜0.05)，而诺迪康组、本发明药物低剂量组测定结果仅显示EPO mRNA表达减弱趋势(P＞0.05)，不具备统计学差异。表明本发明药物高剂量组对高原多血症模型动物降低EPOmRNA表达有一定治疗作用，可能为治疗高原多血症机制之一。且在同等剂量下，本发明药物中红景天用量仅相当于对照药诺迪康的1/9，充分体现了藏药复方的疗效优势。

试验例3 本发明药物安全性毒理学评价

检验结果与结论：

①急性经口毒性试验：SD大鼠急性经口MTD大于15g/kg.bw，判属无毒类。

②遗传毒性试验：Ames试验、小鼠骨脊髓多染红细胞微核试验和小鼠精子畸形试验三项遗传毒性试验结果均为阴性，表明本检品无致突变作用。

③大鼠30天喂养试验：最高剂量为人体推荐摄入量100倍，未引起大鼠整体健康状况、生理生化功能和器官组织形态学等各项重要指标的异常变化，初步估计最大无作用剂量大于7.0g/kg.bw(人体推荐摄入量的100倍)。

试验例4 缓解体力疲劳功能评价

检验结果与结论：本实验采用SPF级昆明种小鼠，按人体推荐剂量的10、20、30倍连续灌胃30天，结果表明三个剂量组小鼠负重游泳时间显著长于空白对照组(P＜0.01)。20、30倍两个剂量组肝糖原含量显著高于空白对照组(P＜0.01)。三个剂量组血清氮含量显著低于空白对照组(P＜0.01)。依据评价标准，本品具有缓解体力疲劳的功能。

试验例5 本发明药物临床实验

“多血症”在青藏高原是一种多发病、常见病特别是该病在全世界范围内呈现出逐年增多的态势，对多血症到目前还没有一种理想的药物和治疗方法。

病例选择：(1)发病海拔在3000m以上。(2)Hb≥200g/L，RBC≥6.5*10¹²/L，Ht≥66％，并有有关临床症状和体征，如头痛、头昏、疲乏、胸闷、心悸、气急、紫绀、充血征及多血面容。(3)除外真性红细胞增多症和其它继发性红细胞增多症。

治疗方法：口服实施例1药物(给药剂型：胶囊剂，服用方法：每日3次，每次4粒，用温水送服)，无毒副作用、安全性好、疗效确切等的独特特点，效果明显疗效理想在治疗的三千多患者中治愈率达93％以上，临床运用疗效确切、安全稳定性好。

Claims (10)

1.一种预防或/和治疗红细胞增多症的药物或保健食品组合物，其特征在于：它含有下述重量配比的原料药制备而成：

余甘子200-400份、沙棘100-300份、干姜50-150份。

2.根据权利要求1所述的预防或/和治疗红细胞增多症的药物或保健食品组合物，其特征在于：所述的原料药还含有红景天200-400份。

3.根据权利要求2所述的预防或/和治疗红细胞增多症的药物或保健食品组合物，其特征在于：它是由下述重量配比的原料药制备而成：

红景天300份、余甘子300份、沙棘200份、干姜100份。

4.根据权利要求2或3所述的预防或/和治疗红细胞增多症的药物或保健食品组合物，其特征在于：它是由红景天、余甘子、沙棘、干姜的水或有机溶剂提取物为活性成分，加入药品或食品中可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂。

5.根据权利要求4所述的预防或/和治疗红细胞增多症的药物或保健食品组合物，其特征在于：所述的制剂是片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂或口服液。

6.根据权利要求5所述的预防或/和治疗红细胞增多症的药物或保健食品组合物，其特征在于：所述的胶囊剂中每粒含红景天以红景天苷(C₁₄H₂₀O₇)计，不得少于1mg；每1g含以没食子酸计算，不得少于5.5mg。

7.一种制备权利要求2或3所述的组合物的方法，它包括如下步骤：

a、称取各重量配比的原料：

b、加水煎煮，合并煎液，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.05～1.10(50～60℃)的清膏，干燥，加入药品或食品中可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂。

8.权利要求1所述的组合物在制备预防或/和治疗红细胞增多症的药物或保健食品中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述的药物是治疗高原红细胞增多症的药物。

10.权利要求1所述的组合物在制备具有抗疲劳功效的药物或保健食品中的用途。

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