CN105596458A - 金芪降糖片治疗糖尿病心血管并发症 - Google Patents

Abstract

本发明涉及金芪降糖片在制备治疗糖尿病心血管并发症的组合物的应用，金芪降糖片以黄连、黄芪、金银花为原料制备。

Description

金芪降糖片治疗糖尿病心血管并发症

技术领域

本发明涉及中医药领域，涉及金芪降糖片治疗糖尿病心血管并发症。

背景技术

糖尿病是一种由于胰岛素分泌缺陷及(或)其生物学作用障碍引起的以高血糖为特征的代谢疾病，是在遗传基础上，有环境因素参与的遗传易感性疾病，是一种慢性全身性代谢疾病，严重危害人类健康，积极开展糖尿病的防治工作已成为主要的社会公共卫生问题。

I型糖尿病的发病原因主要是由于胰岛素分泌绝对缺少，II型糖尿病是从胰岛素抵抗为主伴胰岛素相对不足到胰岛素分泌不足为主伴胰岛素抵抗的病理过程。目前公认II型糖尿病是一种在环境因素、生活方式的改变的作用下由多个基因分别或相互作用所导致的复杂遗传病，但是II型糖尿病的病因尚未完全阐明。

目前糖尿病是严重威胁人类生命及生活质量的一类疾病，其中II型糖尿病(type2diabetesmellitus，T2DM)患者约占90％，而II型糖尿最主要致死原因为心血管并发症。

西医目前常采用饮食、运动疗法磺酰脲类、双胍类、噻唑烷二酮类、α-葡萄糖苷酶抑制剂、瑞格列奈、胰岛素等来治疗II型糖尿病，仅噻唑烷二酮类可改善胰岛素抵抗。病人在用西药治疗的同时，又不断地出现动脉硬化、冠心病和高血压等并发症，II型糖尿病的复杂机制及其导致的全身病变是西药治疗的薄弱环节。不论是磺脉类的促泌剂还是噻唑烷二酮类的增敏剂在实验和临床研究中都不具备明显的减肥功效，而肥胖是2型糖尿病乃至代谢综合征的重要病理基础。

流行病学研究表明肥胖、高热量饮食等是2型糖尿病最主要的环境因素。2型糖尿病是由于胰岛素的生物调节发生障碍，胰岛素信号转导通路的失活引起胰岛素抵抗，导致胰岛素分泌相对不足，病人常伴有糖脂代谢紊乱，出现代谢异常变现为高血糖、高甘油三酯血症和高胆固醇血症等。糖尿病控制较差会引发各种并发症，其中心血管病变为糖尿病患者最严重而突出的问题，基本病理为动脉硬化及微血管病变导致心血管等部位的衰竭病变，而且病情较重是糖尿病患者致死的主要原因之一。

金芪降糖片是以金银花、黄芪为主要成分的一种比较成熟的中药降血糖复方制剂，一直具有良好的降血糖、降血脂等作用，在临床应用中收到较好的效果。然而目前很少有研究金芪降糖片对糖尿病心血管并发症的治疗，本实验通过高脂诱导建立动物模型，观察金芪降糖片对高脂诱导的果蝇代谢紊乱的调节及心血管疾病的治疗作用，为临床用药提供实验依据。

金芪降糖片作为比较成熟的中药降血糖复方制剂，一直具有良好的降血糖、降血脂作用，在糖尿病治疗中具有良好的改善胰岛素抵抗和纠正脂质代谢作用。目前已有研究提示金芪降糖片可以保护血管内皮，金芪降糖片还可以减轻糖尿病慢性肾损伤，其程度可能与降脂作用程度相关；但是目前还未有研究金芪降糖片对糖尿病心血管并发症的作用，本实验首次研究发现金芪降糖片对心功能具有较好的保护作用。

发明内容

金芪降糖片在制备治疗糖尿病心血管并发症的组合物的应用，金芪降糖片由黄连10.3重量份黄芪15.4重量份金银花61.8重量份制成。

金芪降糖片在制备治疗糖尿病心血管并发症的组合物的应用，用于治疗糖尿病并发心衰。

金芪降糖片在制备治疗糖尿病心血管并发症的组合物的应用，用于治疗高脂饮食引起的糖脂代谢紊乱。

金芪降糖片在制备治疗糖尿病心血管并发症的组合物的应用，用于治疗心功能损伤。

金芪降糖片由黄连10.3重量份黄芪15.4重量份金银花61.8重量份制成，其具体方法如下：

黄连加70％乙醇回流提取二次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.15～1.20(60℃)的浸膏，用盐酸调节PH值至1～2，加氯化钠适量，静置12小时，滤过，沉淀加水适量，用20％氢氧化钠调节PH值至6～7，搅拌使溶解，滤过，取沉淀减压干燥粉碎备用；

黄芪加80％乙醇回流提取三次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.25～1.30(60℃)的浸膏，减压干燥粉碎备用；

金银花加水温浸二次，每次1小时，合并提取液，滤过，减压浓缩至相对密度为1.17～1.22(60℃)的浸膏，待温度降至40℃时，搅拌下缓慢加入乙醇，使含醇量达70％，静置24小时，滤过，减压浓缩至相对密度为1.22～1.28(60℃)的浸膏，减压干燥粉碎备用。

取上述三种粉末，加入辅料适量，制成颗粒，压制成1000片，包薄膜衣，即得金芪降糖片

药效试验过程：

本研究通过高脂食物饲养果蝇造模诱导果蝇发生糖脂代谢紊乱，继而研究发现高脂饮食引起糖尿病相关糖脂代谢紊乱可引起心管结构和功能的改变，引起提前发生的心衰。本次研究还发现金芪降糖片可明显改善高脂饮食引起的糖脂代谢紊乱及保护代谢紊乱引起的心功能损伤。

附图说明

图1：金芪降糖片对高脂饮食果蝇甘油三酯及海藻糖含量的影响

图2：金芪降糖片对高脂饮食果蝇心功能的影响

图3：金芪降糖片对高脂饮食果蝇心管4ebp、pepckmRNA表达量的影响

图4：金芪降糖片对高脂饮食果蝇4EBP蛋白磷酸化的影响

1材料

1.1药品与试剂

金芪降糖片(天津中新药业集团股份有限公司隆顺榕制药厂)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(Thermo)，磷酸化4EBP1(Thr37/46)兔抗(CST#2855s)，SYBR荧光定量试剂盒(Roche)，逆转录聚合酶链反应试剂盒(Vazyme)，FlyNap(CarolinaBiologicalSupplyCo.)，TRIzol(Invitrogen)，葡萄糖测试试剂盒(Sigma)、甘油三酯试剂盒(上海科华生物工程股份有限公司)，脂肪酶(Sigma)，海藻糖酶(Sigma)。

引物序列：

1.2仪器

人工气候培养箱(南京恒裕仪器设备制造有限公司RP-300A)，酶标仪(BioTeK基因有限公司)，匀浆机(IKAT10B)，相差显微镜(OLYMPUSBX53F)，EM-CCD(ANDOR)，电泳仪(BIO-RAD)，PCR仪(PeltierThermalCyclerPTC-200)。

1.4动物：野生型(Oregon-Rstrain)健康果蝇。

2方法

2.1果蝇甘油三酯及海藻糖含量测定

随机每组6只果蝇，加入500μlPBST后高速30s匀浆3次后离心取上清.取测试蛋白浓度，70℃五分钟变性后用葡萄糖试剂盒测试上清葡萄糖含量，加入海藻糖酶37℃孵育1小时后将海藻糖分解为葡萄糖后再次测试葡萄糖含量，计算差值即为海藻糖含量；上清加入脂肪酶37℃孵育过夜将甘油三酯分解为甘油，甘油三脂试剂盒测试甘油三酯含量。

2.2蛋白免疫印迹分析检测p-4EBP蛋白表达

随机每组五只果蝇，用蛋白裂解液提取果蝇组织蛋白，5％SDS-PAGE浓缩胶+12％SDS-PAGE分离胶电泳，转移蛋白至硝酸纤维膜上，以5％脱脂奶封闭，加入磷酸化4EBP(1∶1000，4℃孵育过夜)。PBST洗膜，加入相应二抗(1∶1000)孵育2h，PBST洗膜，化学发光法显影，以Tubulin作为内参，进行半定量分析。

2.3果蝇心功能分析

2.3.1.果蝇人造缓冲液的配置

母液：NaCl：6.31g/L；KCl：0.37g/L；CaCl2：0.22g/L；MgCl2：0.76g/L；Hepes(pH7.1)：3.57g/L；NaH2PO4：0.084g/L；NaHCO3：0.48g/L；1MNaOH调节pH为7.1。

糖溶液：蔗糖：17.1g/L；海藻糖：1.89g/L

配制1M的蔗糖和海藻糖溶液时，需要用无菌微孔滤器过滤，保存于4℃。糖液与母液按1∶100混合，新鲜配制的缓冲液，使用前室温下通空气15-20min，储存不超过12h。

2.3.2.果蝇成体心脏解剖

FlyNap麻痹果蝇2-5min，将麻醉的果蝇背部朝下，粘贴在有一层凡士林的培养皿中，翅膀分开同时也固定在培养皿中。微型手术剪从果蝇腿下穿过，斜着剪下去，去除头、脚和腹神经索。然后加入人造缓冲液，浸没果蝇。去除腹体节A7-8，随后沿侧面将腹部的表皮剪开。镊子去除腹部表皮以及与其相连的内脏。用拉好的毛细管与真空泵相连吸取去除脂肪组织。心脏被暴露出来，并且跳动，重新换上新鲜的人造缓冲液。

2.3.3果蝇活体心脏拍摄和数据分析

高速EM-CCD摄像机拍摄连续1500张图片生成果蝇心跳视频，使用Image-J软件分析果蝇心跳产生M-mode图，计算心动周期(HeartPeriod，HP)，收缩间期(SystolicInterval，SI)和舒张间期(DiastolicInterval，DI)时长，心管侧向舒张直径(DiastolicDiameter，DD)、收缩直径(SystolicDiameter，SD)及收缩幅度百分比(FractionalShortening，FS＝(舒张直径-收缩直径)/舒张直径，代表着心脏每次收缩时的射血体积)，以及心律不齐指数(ArrhythmiaIndex，AI每只果蝇心动周期标准差比均值，即每个果蝇心脏中每个心跳周期与整个心脏周期中值的差异大小，代表着果蝇的不规律心跳)。

2.4定量PCR检测果蝇心管4ebp、pepckmRNA表达量

随机每组20只果蝇解剖后取心管组织，样品总RNA提取采用Trizol提取方法。通过A260/A280测定RNA浓度和纯度，取总RNA1μg逆转录成cDNA。采用SYBR荧光法进行检测。PCR结果用内参基因rp49进行校准，以2^-ΔΔCT方法进行相对定量，对照组的基因表达设定为1，其他组的基因表达进行相应的转换。

2.5统计学方法

所有数据由GraphPadPrism5.0软件计算完成。多组均数间的比较采用单因素方差分析(ONE-WAYANOVA)Turkey法进行各组均数的比较。统计学分析结果*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。

3结果

3.1金芪降糖片对高脂饮食果蝇甘油三酯及海藻糖含量的影响

10％高脂饮食2周后HFD组果蝇平均海藻糖和甘油三酯含量较正常饮食的果蝇NCD组均明显升高(P＜0.05)；1％金芪降糖片给药治疗2周后果蝇1％JQ组海藻糖较高脂组含量有所下降(P＜0.05)，甘油三酯含量明显下降(P＜0.01)，几乎达到正常水平。见图1。

3.2金芪降糖片对高脂饮食果蝇心功能的影响

10％高脂饮食2周后果蝇收缩直径与舒张直径均变长(P＜0.01；P＜0.01)，收缩幅度百分比减小(P＜0.05)，收缩间期、舒张间期、心动周期延长(P＜0.05；P＜0.05；P＜0.05)，心律不齐指数变大(p＜0.05)；1％金芪降糖片给药治疗2周后收缩直径、舒张直径减小(P＜0.05；P＜0.001)，收缩幅度百分比增加(P＜0.001)，收缩间期、舒张间期、心动周期缩短(P＜0.01；P＜0.05；P＜0.01)，心率不齐指数变小(P＜0.05)。见图2。

3.3金芪降糖片对高脂饮食果蝇心管4ebp、pepckmRNA表达量的影响

10％高脂饮食2周后果蝇心管pepckmRNA含量明显升高(P＜0.001)，提示糖异生增加，金芪降糖片给药治疗后pepckmRNA含量与高脂组比明显下降(P＜0.001)，提示糖异生得到抑制；而高脂组较正常饮食组4ebpmRNA表达量明显下降(P＜0.05)，提示心脏保护作用下降，给药后4ebpmRNA表达量明显上升(P＜0.01)。见图3。

3.4金芪降糖片对高脂饮食果蝇4EBP蛋白磷酸化的影响

10％高脂饮食2周后HFD组果蝇4EBP蛋白磷酸化较正常饮食组明显升高，而金芪降糖片给药治疗后4EBP蛋白磷酸化明显下降。见图4。

基于上述发现，本发明现已完成。为了便于理解，下面通过附图和具体实施例对本发明的金芪降糖片在治疗糖尿病心肌病中的用途进行详细的描述。需要特别指出的是，具体实施例和附图仅是为了说明，显然本领域的技术人员可以根据本文说明，对本发明进行各种修正或改变，这些修正和改变也将纳入本发明范围之内。

具体实施方式

实施例1

金芪降糖片在制备治疗糖尿病心血管并发症的组合物的应用，金芪降糖片由黄连10.3重量份黄芪15.4重量份金银花61.8重量份制成。

实施例2

金芪降糖片在制备治疗糖尿病心血管并发症的组合物的应用，用于治疗糖尿病并发心衰。金芪降糖片由黄连10.3重量份黄芪15.4重量份金银花61.8重量份制成。

实施例3

金芪降糖片在制备治疗糖尿病心血管并发症的组合物的应用，用于治疗高脂饮食引起的糖脂代谢紊乱。金芪降糖片由黄连10.3重量份黄芪15.4重量份金银花61.8重量份制成。

实施例4

金芪降糖片在制备治疗糖尿病心血管并发症的组合物的应用，用于治疗心功能损伤。金芪降糖片由黄连10.3重量份黄芪15.4重量份金银花61.8重量份制成。

实施例5

金芪降糖片由黄连10.3重量份黄芪15.4重量份金银花61.8重量份制成，其具体方法如下：

黄连加70％乙醇回流提取二次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.15～1.20(60℃)的浸膏，用盐酸调节PH值至1～2，加氯化钠适量，静置12小时，滤过，沉淀加水适量，用20％氢氧化钠调节PH值至6～7，搅拌使溶解，滤过，取沉淀减压干燥粉碎备用；

黄芪加80％乙醇回流提取三次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.25～1.30(60℃)的浸膏，减压干燥粉碎备用；

金银花加水温浸二次，每次1小时，合并提取液，滤过，减压浓缩至相对密度为1.17～1.22(60℃)的浸膏，待温度降至40℃时，搅拌下缓慢加入乙醇，使含醇量达70％，静置24小时，滤过，减压浓缩至相对密度为1.22～1.28(60℃)的浸膏，减压干燥粉碎备用。

取上述三种粉末，加入辅料适量，制成颗粒，压制成1000片，包薄膜衣，即得金芪降糖片。

Claims (4)

1.金芪降糖片在制备治疗糖尿病心血管并发症的组合物的应用，

金芪降糖片由黄连10.3重量份黄芪15.4重量份金银花61.8重量份制成。

2.根据权利要求1中的组合物，其特征为：用于治疗糖尿病并发心衰。

3.根据权利要求1中的组合物，其特征为：用于治疗高脂饮食引起的糖脂代谢紊乱。

4.根据权利要求1中的组合物，其特征为：用于治疗心功能损伤。