CN109745372A - 金芪降糖口服制剂在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用 - Google Patents

金芪降糖口服制剂在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了金芪降糖口服制剂在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用，为溃疡性结肠炎提供了一种新的药物选择，且金芪降糖口服制剂在动物实验和临床应用中未见毒性报告，具有药源丰富、安全无毒的特征，可进一步开发为用于抗炎药物，具有临床应用前景和很高的经济利用价值。

Description

金芪降糖口服制剂在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种中药复方制剂的新用途，具体涉及金芪降糖口服制剂在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用。
背景技术
溃疡性结肠炎（ulcerative colitis）是一种由遗传背景与环境因素相互作用而产生的疾病，呈慢性的炎性反应状态，病变呈连续性，可累及直肠、结肠的不同部位，具体病因尚未明确，临床以发作、缓解和复发交替为特点，是常见的消化系统疑难病。据推测中国溃疡性结肠炎患病率为11.6/10万，目前尚无大样本人群的流行病学资料。据南昌市统计，溃疡性结肠炎患者占结肠镜检查总人群的1.37%，宁夏自治区统计2014年溃疡性结肠炎患者占全年消化科住院总人数的3.27%。患者的临床表现为：腹泻黏液便及脓血便，轻者每天3～4次，重者数十次或腹泻与便秘交替出现；腹痛轻度患者无腹痛或仅有腹部不适。一般有轻度至中度腹痛，系左下腹或下腹阵痛，涉及全腹痛，排便后缓解的规律；便秘大便秘结4～5日排便一次，粪便如羊屎样，甚则不吃泻药不能通便；其他症状腹胀、消瘦、乏力、肠鸣、失眠、多梦、怕冷等症。溃疡性结肠炎患者的直系亲属中，15％～30％的人发病，由此看来结肠炎的发生于遗传因素有一定的关系。
目前治疗结肠炎的方法主要以西药、灌肠等手段为主要手段，但是西药容易复发，且副作用较大，灌肠短时间内见效，但容易导致肠内菌群失调。因此，寻找对溃疡性结肠炎具有良好治疗作用的中药，对于发现溃疡性结肠炎的新型治疗药物具有重要意义。
金芪降糖口服制剂为上市中药制剂，上市剂型包括片剂、胶囊剂及颗粒剂，功能主要为清热益气，用于消渴病气虚内热证，症见口渴喜饮，易饥多食，气短乏力等，用于轻、中型二型糖尿病见上述证候者。目前尚无将金芪降糖口服制剂用于治疗溃疡性结肠炎的研究报道。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供金芪降糖口服制剂在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用。
本发明所述的金芪降糖口服制剂，由下列中药原料制作而成：黄连、黄芪、金银花。
作为优选，所述的金芪降糖口服制剂，按重量份数计，由如下原料制成：黄连2-20份、黄芪3-30份、金银花12-120份。
在本发明中，所述金芪降糖口服制剂为金芪降糖片、金芪降糖颗粒或金芪降糖胶囊，均为已上市中药制剂，也可以为金芪降糖配方颗粒。
本发明经药理研究发现，金芪降糖口服制剂能显著降低溃疡性结肠炎小鼠DAI指数、对结肠缩短均有不同程度的缓解，且能显著抑制小鼠结肠组织中的MDA含量、提高小鼠结肠组织中的 H2O2含量，并能显著抑制小鼠结肠组织中的三种炎症因子（IL-1β、IL-6和TNF-α），对溃疡性结肠炎有不同程度的治疗作用。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明提供了金芪降糖口服制剂的新用途，为溃疡性结肠炎提供了一种新的药物选择，且金芪降糖口服制剂在动物实验和临床使用中未见毒性报告，具有药源丰富、安全无毒的特征，可进一步开发为用于抗炎药物，具有临床应用前景和很高的经济利用价值。
附图说明
图1为实施例1中各组小鼠每天体重减轻率DAI（A），各组小鼠每天DAI（B），结肠长度统计（C），代表性结肠实物图（D）。
图2为实施例1中各组小鼠代表性结肠H&E染色切片图（A），及结肠病理评分（B）柱形图；
图3为实施例1中各组小鼠结肠组织中H2O2含量（A）和MDA含量（B）柱形图；
图4为实施例1中各组小鼠结肠组织中炎症因子IL-1β（A），IL-6（B）和TNF-α（C）蛋白含量柱形图；
图5为实施例1中各组小鼠结肠组织中IL-1β（A），IL-6（B）相对基因表达量柱形图；
图6为实施例2中各组小鼠每天DAI图（A），结肠长度统计（B）以及代表性结肠实物图（C）；
图7为实施例2中各组小鼠脾脏指数柱形图；
图8为实施例2中各组小鼠代表性结肠H&E染色切片图（A），及结肠病理评分柱形图（B）；
图9为实施例2中各组小鼠结肠组织中H2O2含量（A）和MPO含量（B）柱形图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
实施例1：金芪降糖口服制剂治疗溃疡性结肠炎的动物实验（急性模型）：
一、主要仪器及试剂（见表1和表2）：
表1主要仪器
名称 型号 厂家
电子天平 BT 25S 德国赛多利斯集团
掌式离心机 LX-400 海门市其林贝尔仪器制造有限公司
脱水机 JJ-12J 武汉俊杰电子有限公司
包埋机 JB-P5 武汉俊杰电子有限公司
冻台 JB-L5 武汉俊杰电子有限公司
病理切片机 RM2016 上海徕卡仪器有限公司
组织摊片机 KD-P 浙江省金华市科迪仪器设备有限公司
烤箱 GFL-230 天津市莱玻瑞仪器设备有限公司
防脱载玻片 / Servicebio
匀浆机 OSE-Y30 天根生化科技(北京)有限公司
酶标仪 ELX800 美国伯腾仪器有限公司
微量紫外分光光度计 P330 德国Implen公司
实时荧光定量PCR仪 CFX96 美国BioRad公司
表2主要试剂及药物
名称 货号 厂家
金芪降糖片 GA87140 隆顺榕制药厂
葡聚糖硫酸钠（36000–50000kDa） 0216011080 美国MP Biometicals
柳氮磺吡啶 S129986 上海阿拉丁
氯化钠 20171204-2 广州化学试剂厂
二甲苯 10023418 国药集团化学试剂有限公司
无水乙醇 100092683 国药集团化学试剂有限公司
异丙醇 20180301-2 广州化学试剂厂
4%多聚甲醛 MA0192 广州斯佳生物科技有限公司
HE染液 G1005 servicebio
分化液 G1005-3 servicebio
返蓝液 G1005-4 servicebio
中性树胶 10004160 国药集团化学试剂有限公司
粪便隐血定性检测试剂盒 TC0511 北京雷根生物技术有限公司
酶联免疫试剂盒 EMC001b.96 欣博盛生物科技有限公司
酶联免疫试剂盒 EMC004.96 欣博盛生物科技有限公司
酶联免疫试剂盒 EMC102a.96 欣博盛生物科技有限公司
MDA检测试剂盒 S0131 上海碧云天生物技术有限公司
过氧化氢检测试剂盒 S0038 上海碧云天生物技术有限公司
总蛋白浓度检测试剂盒 P0009 上海碧云天生物技术有限公司
TRNzol总RNA提取试剂 DP405 天根生化科技（北京）有限公司
DEPC水 R0022 上海碧云天生物技术有限公司
逆转录酶 RT Master 宝日医生物技术(北京)有限公司
荧光定量酶 TB Green 宝日医生物技术(北京)有限公司
引物序列 / 生工生物工程(上海)股份有限公司
二、动物实验方法
1、分组，造模及给药
6-8 周龄，雄性，SPF 级，Balb/c小鼠。将小鼠随机分为：空白组（Control）、模型组（Model）、阳性药组（SASP）、金芪降糖口服制剂低剂量组（JQ(L)）及金芪降糖口服制剂高剂量组（JQ(H)）。每组 6 只，共30 只。在 SPF 级实验室适应性喂养一周。
2、溃疡性结肠炎模型的建立
配制浓度为4%的DSS水溶液。模型组自由饮用4% DSS水溶液。空白组自由饮用蒸馏水。常规饮食不变，连续饮用7天。
3、动物实验给药
3.1动物实验给药准备
取金芪降糖片（药物组成：黄连103g，黄芪154g，金银花618g，规格：0.42g/片），称取2.5g，在20mL蒸馏水中分散，超声30min，使用容量瓶定容至50mL。
3.2实验给药
金芪降糖口服制剂高剂量组给药剂量为1.0 g/kg/d，金芪降糖口服制剂低剂量组给药剂量为0.5 g/kg/d。阳性药美沙拉嗪组，给药剂量为0.6 g/kg/d，给药方式为灌胃给药，给药体积为0.2 m L/ 10 g。空白组和模型组每天灌胃等体积的蒸馏水。造模当天同时开始给药。
4、疾病活动指数（the disease activity index，DAI）评分
4.1大便隐血检测方法
按照隐血检测试剂盒说明书进行检测。
4.2 DAI 评分
体重减少：按减少体重的百分比计算，无体重减轻为0分，体重减轻1%-5%为1分，体重减轻6%-10%为2分，体重减轻11%-15%为3分，体重减轻大于15%为4分。
大便黏稠度：正常为0，松散便2分，腹泻4分。
大便出血：正常0分，隐血出血1分，显性出血3分。
分别就体重、大便粘稠度、大便出血进行评分。DAI值即这三项的平均值。DAI=（体重评分+大便性状评分+出血评分）/3，结果见表3和表4所示：
表3DAI评分标准
计分 体重下降（%） 大便形状 便血
0 0 正常 正常
1 1-5
2 5-10 松散 隐性便血
3 10-15
4 ＞15 腹泻 显性便血
表4 各组小鼠 DAI 指数（x ±S）（n=6）
空白 模型 阳性药 金芪降糖口服制剂（低） 金芪降糖口服制剂（高）
第一天 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00 ±0.00
第二天 0.11±0.16 0.67±0 0.58±0.43 0.33±0.27 0.78 ±0.16
第三天 0.00±0.00 0.67±0 0.25±0.28 0.28±0.3 0.45 ±0.32
第四天 0.00±0.00 0.67±0 0.59±0.36 0.56±0.46 0.78 ±0.16
第五天 0.00±0.00 0.67±0 0.5±0.29 0.61±0.45 0.78 ±0.16
第六天 0.00±0.00 1.67±1 0.84±1.09 0.78±0.79 0.56 ±0.42
第七天 0.00±0.00 2.5±0.37 0.84±0.29 1.33±0.86 0.78 ±0.16
第八天 0.00±0.00 3.25±0.36 1.17±0.55 2.44±0.63 0.67 ±0.00
见表4与图1（A），与空白组相比，模型组DAI指数在第二天就开始上升，并在第三天明显上升，且存在显著性差异（P<0.01）。与模型组相比，阳性药和金芪降糖口服制剂能降低溃疡性结肠炎小鼠DAI指数，而金芪降糖口服制剂则和模型组相比存在显著性差异。说明阳性药和金芪降糖口服制剂能对溃疡性结肠炎有不同程度的治疗作用。
5、取材
于最后一次给药后的第一天处死小鼠。剖开小鼠腹部，暴露腹腔，剪去肛门上2cm至盲肠的整段结肠。将整段结肠拍照并测量长度。沿肠系膜边缘纵向剖开，用生理盐水冲洗肠内容物并测量结肠重量。将整段结肠一分为二，一半放入10%福尔马林缓冲液中固定备用，另一半迅速放入液氮中，置于-80℃保存。
表5各组小鼠结肠长度（x ±S）（n=6）
组别 结肠长度（cm）
空白 7.9±0.42
模型 4.75±0.17
阳性药 6.45±1.24
金芪降糖口服制剂 6.63±0.49
各组小鼠代表性的结肠外观图见图1（D）。从表5以及图1(C)中可以看出，模型组小鼠结肠明显缩短，与空白组相比，存在极显著性差异（P<0.01）。与模型组相比，金芪降糖口服制剂组对结肠缩短均有不同程度的缓解，且具有统计学意义（P<0.05）。
6、结肠病理观察
6.1石蜡切片制备方法
1. 取材：新鲜组织用固定液固定24h以上。将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内。
2.脱水浸蜡：将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75%酒精4h-85%酒精2h-90%酒精2h-95%酒精1h-无水乙醇I 30min-无水乙醇II 30min-醇苯5-10min-二甲苯I 5-10min-二甲苯II 5-10min-65°融化石蜡I 1h-65°融化石蜡II 1h-65°融化石蜡III 1h。
3.包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20°冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。
切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机切片，厚4μm。切片漂浮于摊片机40℃ 温水上将组织展平，载玻片将组织捞起，60℃ 烘箱内烤片。水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。
石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-75%酒精5min，自来水洗。
4.苏木素染色：切片入苏木素染液染3-5min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗。
5.伊红染色：切片依次入85%、95%的梯度酒精脱水各5min，入伊红染液中染色5min。
6.脱水封片：切片依次放入无水乙醇I 5min -无水乙醇II 5min-无水乙醇Ⅲ5min-二甲Ⅰ5min- 二甲苯Ⅱ5min透明，中性树胶封片。
7.显微镜镜检，图像采集分析。
6.2组织病理学评分
组织病理学评分依据Cooper炎症分级标准进行组织病理学评分。在放大200倍下，每个标本在同一结肠区段的病理切片区域里，随机选取8个视野。对每个视野进行观察和评分。将这8个平均值作为这个标本的组织病理学评分值，具体评分方法如下：
0正常肠黏膜；
1黏膜层轻度炎症和水肿，基底部1/3隐窝消失；
2黏膜层中度炎症，基底部2/3隐窝消失；
3黏膜层中度炎症，隐窝完全消失，但上皮层尚完整；
4黏膜层、黏膜下层、肌层重度炎症，隐窝和上皮层消失。
各组小鼠代表性的结肠黏膜组织病理结果图见图2（A）。从图中可以发现，空白组小鼠结肠黏膜组织完好，隐窝结构完整，黏膜下层未见水肿。模型组小鼠黏膜上皮大量破损，脱落，隐窝结构消失，有溃疡形成，黏膜下层可见大量炎性细胞浸润。柳氮磺吡啶及金芪降糖口服制剂能缓解以上病理特征。减少上皮组织脱落，也可以减轻炎性细胞浸润情况。
各组小鼠结肠黏膜病理评分见表6及图2（B）。各组中，模型组病理评分最高，与空白组相比存在极显著性差异（P<0.01）。与模型组相比，各治疗组病理评分都有所降低，表明各给药组对溃疡性结肠炎都有一定程度的治疗作用，且有统计学意义（P<0.01）。
表6 各组小鼠结肠黏膜病理评分（x±S）（n=6）
组别 评分
空白 0.00±0.00
模型 7.67±0.47
阳性药 6.00±0.82
金芪降糖口服制剂（低） 4.33±0.47
金芪降糖口服制剂（高） 2.67±0.47
7、 结肠组织MDA检测
取约0.5cm长度结肠使用200μL生理盐水进行匀浆或裂解；4℃，14000rpm离心5min，取上清；使用用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，以便于后续计算单位蛋白重量结肠组织MDA含量；取适量标准品用生理盐水稀释至1、2、5、10、20、50μM，用于后续制作标准曲线；在离心管或其它适当容器内加入0.1ml生理盐水作为空白对照，加入0.1ml上述不同浓度标准品用于制作标准曲线，加入0.1ml样品用于测定；随后加入0.2ml MDA检测工作液；100℃或沸水浴加热15分钟；水浴冷却至室温，1000g室温离心10分钟。取200微升上清加入到96孔板中，随后用酶标仪在540nm测定吸光度。根据标准曲线计算获得MDA的摩尔浓度，计算出样品溶液中的MDA含量后，通过单位重量的蛋白含量来表示最初样品中的MDA含量：μmol/mg蛋白。
表7各组小鼠结肠MDA含量（x±S）（n=6）
组别 MDA含量（ng/mg蛋白）
空白 186.82±43.03
模型 485.42±108.64
阳性药 152.28±26.51
金芪降糖口服制剂（低） 232.06±70.88
金芪降糖口服制剂（高） 175.27±40.12
从表 7和图3（B）中可以看出，空白组 MDA本底约为100ng/mg蛋白。与空白组相比，模型组中MDA显著增高，有显著性差异（P<0.05）。在给药治疗后，与模型组相比，阳性药柳氮磺吡啶组有所降低，但没有显著性差异（P>0.05），而金芪降糖口服制剂组小鼠结肠组织中的MDA被显著抑制，且统计学上非常显著（P<0.01）。
8、 结肠组织过氧化氢检测
取约0.5cm长度结肠使用200μL生理盐水进行匀浆或裂解；4℃，14000rpm离心5min，取上清；使用用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，以便于后续计算单位蛋白重量结肠组织MDA含量；取适量标准品用生理盐水稀释至1、2、5、10、20、50μM，用于后续制作标准曲线；把浓度约为1M的过氧化氢用水稀释100倍，使过氧化氢的浓度约为10mM，测定A240。过氧化氢浓度(mM)=22.94 X A240，从而计算出试剂盒提供的过氧化氢标准品的实际浓度；把过氧化氢检测试剂在冰上或冰水浴上融解；在检测孔内加入50微升样品或标准品；在每个孔内加入100微升过氧化氢检测试剂；轻轻振荡或敲打混匀，37℃孵育30分钟，立即测定A540；根据标准曲线计算出样品中过氧化氢的浓度。
表8各组小鼠结肠H2O2含量（x±S）（n=6）
组别 H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>含量（ng/mg蛋白）
空白 620.22±200.06
模型 331.62±69.02
阳性药 612.99±220.44
金芪降糖口服制剂 804.90±254.98
从表 8和图 3（A）中可以看出，空白组过氧化氢含量本底约为600ng/mg蛋白。与空白组相比，模型组中 H2O2有所降低，但没有显著性差异（P>0.05）。在给药治疗后，与模型组相比，阳性药柳氮磺吡啶组有所升高，但也没有显著性差异（P>0.05），而金芪降糖口服制剂组小鼠结肠组织中的 H2O2则显著升高，且统计学上有显著性差异（P<0.05）。
9、ELISA检测
检测结肠组织中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平。按照ELISA试剂盒说明书操作如下：
用蒸溜水将Wash Buffer(20×)稀释20倍，得到Wash Buffer(1×)；在1.5mL EP管中梯度稀释标准品，用Sample Diluent将样本稀释成1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、0pg/mL；向标准孔中加入100μL稀释后标准品；向空白孔中加入100μLSample Diluent；向样本孔中加入100μL样品，贴封板膜，37℃孵育90min；洗板：350μL Wash Buffer/孔，洗3次；准备生物素化抗体工作液，用生物素化抗体稀释液将浓缩生物素化抗体（30X）稀释30倍；每孔加100μL生物素化抗体工作液。贴封板膜，37℃孵育60min；洗板：350μL Wash Buffer/孔，洗3次；准备酶结合物工作液，用酶结合物稀释液将浓缩酶结合物工作液（30X）稀释30倍；每孔加100μL酶结合物工作液。贴封板膜，37℃孵育60min；洗板：350μL Wash Buffer/孔，洗3次；每孔加100μL TMB 显色液，37℃避光孵育15min；每孔加100μL终止液；使用酶标仪，在450nm波长处测吸光值；结果判断：每个标准品和样品的OD值应减去空白孔的OD值，以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，绘制标准曲线，通过样品的OD值可在标准曲线上计算出其浓度。
表9各组小鼠结肠中IL-1β、IL-6和TNF-α含量（x±S）（n=6）
组别 IL-1β（ng/mg蛋白） IL-6（ng/mg蛋白） TNF-α（ng/mg蛋白）
空白 439.06 ±98.93 107.51 ±47.64 139.93±115.37
模型 783.67 ±119.04 294.62 ±60.72 812.96±86.59
阳性药 507.73 ±86.71 180.45 ±79.03 472.62±48.63
金芪降糖口服制剂 596.63 ±24.74 231.46 ±53.44 231.5±120.4
从表 9和图4中可以看出，与空白组相比，模型组中三种炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量显著增高，且都有显著性差异（P<0.05）。在给药治疗后，与模型组相比，阳性药柳氮磺吡啶组有所降低，但都没有显著性差异（P>0.05），而金芪降糖口服制剂组小鼠结肠组织中的 三种炎症因子都被显著抑制，且都存在显著性差异（P<0.01）。
10、Real-timePCR检测
检测结肠中中IL-1β，IL-6、TNF-α、IFN-β和TERT mRNA表达水平，具体操作步骤如下：
取约0.5mL长度结肠组织，置于1.5mL离心管中，加入1mL Trizol，使用匀浆仪进行冰上匀浆，室温放置5min；4℃，14000rpm离心5min，取上清，Trizon补充至1mL；加入0.2mL氯仿，剧烈震荡30s，室温放置5min；4℃，14000rpm离心15min，取上层水相400uL至新1.5mL离心管中；向离心管中加入1倍体积异丙醇，混匀室温放置5min；4℃，14000rpm离心15min，小心吸走上清，保留沉淀；加入75%乙醇1mL，震荡30s；4℃，7500rpm离心5min；小心吸走上清，保留沉淀；加入20μL DEPC水，使用掌式离心机离心30s，将所得到的溶液置于-80℃保存；逆转录合成cDNA，使用微量紫外分光光度计测定RNA浓度。按照PrimeScript™ RT Master Mix试剂盒说明书进行操作，按表10组份配制逆转录反应液，轻柔混匀后进行反转录反应，条件如下 :37℃ 15 min（反转录应）； 85℃ 5 s（反转录酶的失活应）；4℃。
表10逆转录反应液配制方法
试剂 使用量
5× PrimeScript RT Master 2uL
Total RNA 500ng
DEPC水 补充至1uL
11、样品Real-timePcR检测，将上一步得到的cDNA稀释，然后用目的基因和内参基因的引物分别进行扩增，引物序列见表12，按表11组份配制PCR 反应液（冰上进行），扩增程序为：95℃预变性30s，95℃变性5s，退火60℃，10s，共40个循环，延伸95℃，15s，60℃，1min，95℃，15s。
表11 RT-qPCR反应液配制方法
试剂 使用量 终浓度
TB Green Fast qPCR Mix（2×） 5μL 1×
PCR 正向引物（10 μM） 0.4μL 0.4μM
PCR 反向引物（10 μM） 0.4μL 0.4μM
DNA 模板（<100 ng） 0.8μL /
DEPC水 3.4μL /
总量 25μL /
表12 引物序列
Gene Sequence (5’-3’)
β-Actin-F GGCTGTATTCCCCTCCATCG
β-Actin-R CCAGTTGGTAACAATGCCATGT
IL-1β-F GAGCCTGTGTTTCCTCCTTG
IL-1β-R CAAGTGCAAGGCTATGACCA
IL-6-F CTCCCAACAGACCTGTCTATAC
IL-6-R CCATTGCACAACTCTTTTCTCA
使用BioRad CFX96 Real-Time PCR Detection Systems进行检测，结果见表13。
表13各组小鼠结肠中IL-1β及IL-6相对表达量（x±S）（n=6）（以模型组为100%）
组别 IL-1β（%） IL-6（%）
空白 33.34±11.69 10.15±2.76
模型 100.00±13.59 100±22.45
阳性药 61.29±24.42 30.22±10.82
金芪降糖口服制剂（低） 126.40±16.94 91.89±12.78
金芪降糖口服制剂（高） 67.33±6.21 31.86±13.63
从表 13和图 5中可以看出，与空白组相比，模型组中两种炎症因子IL-1β和IL-6表达显著增高，且都有显著性差异（P<0.05）。在给药治疗后，与模型组相比，阳性药柳氮磺吡啶组有所降低，但都没有显著性差异（P>0.05），而金芪降糖口服制剂组小鼠结肠组织中的两种炎症因子表达都被显著抑制，且都存在显著性差异（P<0.05）。
实施例2金芪降糖口服制剂治疗溃疡性结肠炎的动物实验（慢性模型）：
一、主要仪器及试剂同实施例1。
二、动物实验方法
1、分组，造模及给药
6-8 周龄，雄性，SPF 级，Balb/c小鼠。将小鼠随机分为：空白组（Control）、模型组（Model）、阳性药组（SASP）及金芪降糖口服制剂（JQ）。每组 6 只，共24 只。在 SPF 级实验室适应性喂养一周。
2、慢性溃疡性结肠炎模型的建立
慢性溃疡性结肠炎模型分为三个周期，模型组、阳性药组及金芪降糖口服制剂给药组第一个周期，从第一天至第六天使用2%DSS代替饮用水给与小鼠，第7至14天给与普通饮用水；第二个周期，从总第15天至总21天使用2%DSS代替饮用水给与小鼠，从总第22天至总23天给与普通饮用水；第三个周期，从总第31天至总第25天使用2%DSS代替饮用水给与小鼠，从总第36天至总第43天给与普通饮用水，空白组一直给与普通饮用水。
3、实验给药
金芪降糖口服制剂组给药剂量为1.0 g/kg/d，阳性药美沙拉嗪组给药剂量为0.6 g/kg/d，给药方式为灌胃给药，给药体积为0.2 m L/10 g，造模第6天开始每天给药一次，至第43天。空白组和模型组每天灌胃等体积的蒸馏水。
4、疾病活动指数（the disease activity index，DAI）评分同实施例1。
表14 各组小鼠 DAI 指数（x ±S）（n=6）
空白 模型 阳性药 金芪降糖口服制剂
第1天 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00
第2天 0.11±0.16 0.33±0.27 0.56±0.25 0.28±0.12
第3天 0.00±0.00 0.44±0.16 0.61±0.12 0.39±0.12
第4天 0.00±0.00 0.50±0.17 0.67±0.00 0.50±0.17
第5天 0.00±0.00 0.44±0.16 0.56±0.25 0.50±0.17
第6天 0.06±0.12 0.72±0.45 0.50±0.25 0.78±0.42
第7天 0.00±0.00 0.89±0.68 0.44±0.16 0.72±0.36
第8天 0.06±0.12 1.17±1.07 0.39±0.23 0.61±0.12
第9天 0.06±0.12 0.94±0.95 0.28±0.23 0.56±0.16
第10天 0.00±0.00 0.89±0.97 0.22±0.16 0.44±0.31
第11天 0.00±0.00 0.67±0.61 0.17±0.25 0.28±0.30
第12天 0.00±0.00 0.44±0.53 0.00±0.00 0.22±0.25
第13天 0.00±0.00 0.33±0.51 0.00±0.00 0.11±0.16
第14天 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00
第15天 0.00±0.00 0.33±0.38 0.00±0.00 0.11±0.16
第16天 0.00±0.00 0.44±0.71 0.17±0.17 0.22±0.16
第17天 0.00±0.00 0.50±0.57 0.33±0.33 0.28±0.12
第18天 0.00±0.00 0.67±0.64 0.56±0.37 0.61±0.23
第19天 0.00±0.00 0.83±0.71 0.50±0.25 0.72±0.36
第20天 0.00±0.00 0.83±0.54 0.39±0.12 0.33±0.00
第21天 0.00±0.00 0.94±0.49 0.78±0.16 0.44±0.16
第22天 0.00±0.00 0.89±0.60 0.78±0.16 0.44±0.25
第23天 0.00±0.00 0.61±0.30 0.94±0.23 0.39±0.12
第24天 0.00±0.00 0.50±0.25 1.00±0.38 0.33±0.00
第25天 0.00±0.00 0.39±0.12 0.89±0.42 0.22±0.16
第26天 0.00±0.00 0.44±0.16 0.61±0.45 0.22±0.16
第27天 0.00±0.00 0.33±0.00 0.39±0.30 0.17±0.17
第28天 0.00±0.00 0.33±0.00 0.17±0.17 0.06±0.12
第29天 0.00±0.00 0.28±0.12 0.28±0.23 0.06±0.12
第30天 0.00±0.00 0.28±0.12 0.06±0.12 0.00±0.00
第31天 0.00±0.00 0.17±0.17 0.11±0.25 0.06±0.12
第32天 0.00±0.00 0.17±0.17 0.33±0.33 0.17±0.17
第33天 0.00±0.00 0.28±0.12 0.39±0.30 0.17±0.17
第34天 0.00±0.00 0.44±0.25 0.56±0.25 0.39±0.12
第35天 0.00±0.00 0.44±0.25 0.72±0.36 0.39±0.12
第36天 0.00±0.00 0.44±0.16 0.72±0.36 0.39±0.12
第37天 0.00±0.00 0.50±0.25 0.83±0.32 0.33±0.00
第38天 0.00±0.00 0.50±0.25 0.89±0.31 0.33±0.00
第39天 0.00±0.00 0.33±0.00 0.78±0.37 0.33±0.00
第40天 0.00±0.00 0.33±0.00 0.67±0.38 0.28±0.12
第41天 0.00±0.00 0.33±0.00 0.61±0.40 0.17±0.17
第42天 0.00±0.00 0.33±0.00 0.44±0.37 0.06±0.12
第43天 0.00±0.00 0.28±0.23 0.33±0.27 0.06±0.12
见表14与图6（A），与空白组相比，模型组DAI指数在第二天就开始上升，并在第三天明显上升，且存在显著性差异（P<0.01）。与模型组相比，阳性药和金芪降糖口服制剂能降低溃疡性结肠炎小鼠DAI指数。说明阳性药和金芪降糖口服制剂能对溃疡性结肠炎有不同程度的治疗作用。
5、取材
于最后一次给药后的第一天处死小鼠。剖开小鼠腹部，暴露腹腔，剪去肛门上2cm至盲肠的整段结肠。将整段结肠拍照并测量长度。沿肠系膜边缘纵向剖开，用生理盐水冲洗肠内容物并测量结肠重量。将整段结肠一分为二，一半放入10%福尔马林缓冲液中固定备用，另一半迅速放入液氮中，置于-80℃保存。取小鼠脾脏，立即称量重量。
表15各组小鼠结肠长度（x ±S）（n=6）
组别 结肠长度（cm）
空白 9.61±0.37
模型 7.35±0.34
阳性药 8.28±0.45
金芪降糖口服制剂 8.81±0.38
表16各组小鼠脾脏指数（x ±S）（n=6）
组别 脾脏指数（mg/g）
空白 37.09±7.09
模型 60.44±7.87
阳性药 47.96±6.53
金芪降糖口服制剂 33.92±7.34
各组小鼠代表性的结肠外观图见图6（C），从表15以及图6（B）中可以看出，模型组小鼠结肠明显缩短，与空白组相比，存在极显著性差异（P<0.01）。与模型组相比，金芪降糖口服制剂组对结肠缩短均有不同程度的缓解，且具有统计学意义（P<0.05）。各组小鼠脾脏指数见表16及图7，从表16可见模型组小鼠脾脏明显肿大（P<0.01），而金芪降糖口服制剂对DSS诱导的脾脏肿大有明显缓解（P<0.01）。
6、结肠病理观察
表17 各组小鼠结肠黏膜病理评分（x±S）（n=6）
组别 评分
空白 0.00±0.00
模型 4.67±0.47
阳性药 3.33±0.47
金芪降糖口服制剂（高） 3.00±0.82
各组小鼠代表性的结肠黏膜组织病理结果图见图8（A）。从图中可以发现，空白组小鼠结肠黏膜组织完好，隐窝结构完整，黏膜下层未见水肿。模型组小鼠黏膜上皮大量破损，脱落，隐窝结构消失，有溃疡形成，黏膜下层可见大量炎性细胞浸润。柳氮磺吡啶及金芪降糖口服制剂能缓解以上病理特征。减少上皮组织脱落，也可以减轻炎性细胞浸润情况。
各组小鼠结肠黏膜病理评分见表17及图8（B）。各组中，模型组病理评分最高，与空白组相比存在极显著性差异（P<0.01）。与模型组相比，各治疗组病理评分都有所降低，表明各给药组对溃疡性结肠炎都有一定程度的治疗作用，且有统计学意义（P< 0.01）。
7、结肠组织MPO检测
表 18各组小鼠结肠MPO活性（x±S）（n=6）
组别 MPO活性（U/mg结肠组织）
空白 9.61±0.37
模型 7.35±0.34
阳性药 8.28±0.45
金芪降糖口服制剂 8.81±0.38
根据表18和图9（B）可知，模型组小鼠MPO活性比空白组明显上升（P< 0.01），MPO可以募集中性粒细胞，引起结肠组织损伤，而阳性药SASP和金芩降糖片对DSS诱导引起的MPO活性上升有明显抑制作用（P< 0.01），和结肠病理观察结果是一致的。
8、结肠组织过氧化氢检测
表19各组小鼠结肠H2O2含量（x±S）（n=6）
组别 H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>含量（ng/mg蛋白）
空白 613.94±114.78
模型 287.48±89.77
阳性药 321.97±144.69
金芪降糖口服制剂 524.11±112.90
从表19和图9（A）可知，DSS会明显抑制结肠组织中过氧化氢水平（P< 0.05），过氧化氢对肠道损伤有修复和抑制有害微生物作用，金芪降糖片可以明显恢复DSS诱导的过氧化氢水平下降（P< 0.05）。

Claims (3)

1.金芪降糖口服制剂在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的金芪降糖口服制剂在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用，其特征在于，所述金芪降糖口服制剂，按重量份数计，由如下原料制成：黄连2-20份、黄芪3-30份、金银花12-120份。
3.根据权利要求2所述的金芪降糖口服制剂在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用，其特征在于，所述金芪降糖口服制剂为金芪降糖片、金芪降糖颗粒、金芪降糖胶囊或金芪降糖配方颗粒。
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