CN115386649A - 一对人参属特异性引物及中成药内人参属中药材的分子生物学鉴定方法 - Google Patents

一对人参属特异性引物及中成药内人参属中药材的分子生物学鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一对人参属特异性引物及中成药内人参属中药材的分子生物学鉴定方法，所述人参属特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；并涉及一种人参属中药材特异性DNA分子标记，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；以及一种利用人参属特异性引物鉴定中成药内人参属中药材的方法；应用本发明发现的特异性引物对，可在基因组混杂且碎片化的状态下，对中成药内的人参属药材进行快速直观的检测，整个过程操作简单，可重复性良好。

Description

一对人参属特异性引物及中成药内人参属中药材的分子生物 学鉴定方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一对人参属特异性引物及中成药内人参属中药材的分子生物学鉴定方法。
背景技术
中成药由多种药材经多种工艺加工而成，成分复杂，药材的原有性状均已消失。因此一旦药材参假，将无法通过性状鉴定的方法对中成药内的药材进行有效鉴定。人参属植物是名贵的药用植物，尤其是人参属中的三七、人参在中成药中应用广泛。
三七是我国传统名贵中药材，自古就有“止血神药”的美称。它是五加科(Araliaceae)人参属(Panax)植物三七[Panax notoginseng(Burkill)F.H.Chen]的干燥根，性温、味甘、微苦，主治出血症，跌打损伤，瘀血肿痛等。近年来我国医药学家还发现三七具有抗疲劳、耐缺氧、壮阳、抗衰老、降血糖和提高机体免疫功能等多方面的滋补强壮作用。清朝药学著作《本草纲目拾遗》中记载：“人参补气第一，三七补血第一，味同而功亦等，故称人参三七，为中药中之最珍贵者。”在中医药理指导下，多种中成药均以三七为原料制成，如心可舒、云南白药和血塞通胶囊等。由于三七在外科、妇科及中医骨伤科等具有广泛的用途及独特的疗效，加之其价格昂贵，因此市场上经常出现与其形态相似的伪品充作三七。中成药内的三七一旦掺假，不仅影响中成药的临床疗效，更损害了中医药的健康发展。因此急需建立一种中成药内三七的有效鉴定方法。
人参别名神草、地精、黄精，是五加科、人参属植物人参的干燥根和根茎。其性温、味甘、微苦，是我国的传统珍贵中药材，被誉为“百草之王”，为常用的40种大宗药材之一。现代药理学显示，人参具有调整血压、恢复心脏功能、治疗神经衰弱、祛痰、健胃、利尿、兴奋等功效，在临床上可用于调节免疫、抗肿瘤、治疗心脑血管或神经系统疾病。基于此，大量以人参为原料制成的中成药被研发出来，例如滋肾育胎丸、人参养荣丸、参乌健脑胶囊等。这些中成药因便于服用携带，应用十分广泛。人参掺假或缺失后不仅会影响中成药的临床治疗效果，更会损害中医药的健康发展。因此急需建立一种中成药内人参药材的有效鉴定方法。
由于分子生物学技术能从分子水平上客观反映物种的基因片段差异，克服传统鉴别方法主观性大、易受干扰等缺点，因此已成为中药材鉴定的现代化方法之一。DNA条形码技术即是以分子生物为基础，建立起的一种新型中药材鉴定技术。它以短且标准的DNA序列作为标记，来实现中药材的快速准确鉴定，具有操作简便、可重复性强、结果稳定可靠等优点。研究发现，在DNA条形码技术中，ITS2序列是药用植物鉴定的最优标记序列。截至目前为止，以三七的ITS2序列为标准，应用通用引物虽然可以完成三七的身份鉴定，但是此方法只能以单独的三七或其伪品为模板，分别进行鉴定，而无法检测多味药组成的中成药内是否含有三七或是中成药内是否掺杂了三七伪品；截至目前为止，以人参的ITS2序列为标准，应用通用引物虽然可以完成人参的身份鉴定，但是此方法只能以单独的人参或其伪品为模板，分别进行鉴定，而无法检测中成药内是否包含人参或是中成药内是否掺杂了人参伪品。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一对人参属特异性引物及中成药内人参属中药材的分子生物学鉴定方法。
本发明的技术方案如下：
一对人参属特异性引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，SEQ ID NO.1为上游引物，SEQ ID NO.2为下游引物。
SEQ ID NO.1：5’-CTCGTAGTTGGACTTTGGGTTGGG-3’；
SEQ ID NO.2：5’-TGGTCGGCATCGTTTATGGTTG-3’。
根据本发明优选的，所述人参属中药材为三七和/或人参。
上述人参属特异性引物在鉴定人参属中药材真伪的应用。
上述人参属特异性引物在鉴定中成药内是否含有人参属中药材的应用。
根据本发明优选的，所述应用中的人参属中药材为三七和/或人参。
一种鉴定人参属中药材的试剂盒Ⅰ，包括上述人参属特异性引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
根据本发明优选的，所述试剂盒Ⅰ还包括PCR反应体系、电泳鉴定体系。
根据本发明优选的，所述人参属中药材为三七和/或人参。
上述试剂盒Ⅰ在鉴定人参属中药材真伪中的应用。
上述试剂盒Ⅰ在鉴定中成药内是否含有人参属中药材的应用。
一种人参属中药材特异性DNA分子标记，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
一种鉴定人参属中药材的试剂盒Ⅱ，包括上述人参属中药材特异性DNA分子标记。
根据本发明优选的，所述试剂盒Ⅱ还包括PCR反应体系、电泳鉴定体系。
上述人参属中药材特异性DNA分子标记在鉴定人参属中药材真伪中的应用。
上述人参属中药材特异性DNA分子标记在鉴定中成药内是否含有人参属中药材的应用。
上述试剂盒Ⅱ在鉴定人参属中药材真伪中的应用。
上述试剂盒Ⅱ在鉴定中成药内是否含有人参属中药材的应用。
根据本发明优选的，所述人参属中药材为三七和/或人参。
一种利用人参属特异性引物鉴定中成药内人参属中药材的方法，包括如下步骤
(1)应用植物基因组提取试剂盒，提取中成药的混合基因组；以提取的混合基因组为模板，利用所述特异性引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2进行PCR，获得人参属特异产物，即人参属特异产物长度为350-550bp，人参属特异产物电泳检测结果条带单一，无杂带，初步判定中成药内含有人参属中药材；如果未获得人参属特异产物，则直接判定中成药内不含有人参属中药材；
(2)在步骤(1)中初步判定中成药内含有人参属中药材后，以步骤(1)中提取中成药的混合基因组为模板，利用ITS2通用引物进行PCR，获得含有多种中药材ITS2序列的混合产物；应用DNA连接酶将获得的含有多种中药材ITS2序列的混合产物分别插入线性化的pCR4Blunt-TOPO质粒中，随后将该质粒转染到宿主细胞，使其形成单克隆，完成ITS2混合序列的分离；
(3)中成药内人参属中药材特有ITS2序列的鉴定，挑取一定数量的步骤(2)中的单克隆，制备液体培养物；
应用质粒小提试剂盒，分别提取液体培养物中的单克隆质粒；
应用sanger测序法对提取的单克隆质粒进行核苷酸序列检测；
应用SeqMan与Chromas软件，根据产物长度、Q值，对测序结果进行序列拼接与校对；
将拼接校对后的测序结果分别放入数据库中进行比对，根据E Value、Max Score和Per Iden的得分，对测序结果进行鉴定，明确中成药的混合基因组中是否包含人参属中药材特有ITS2序列，完成中成药内人参属中药材的鉴定。
根据本发明优选的，步骤(1)中，人参属特异产物长度为416bp，核苷酸序列如SEQID NO.3所示。
根据本发明优选的，步骤(1)中，提取中成药的混合基因组，然后使用基因组纯化试剂盒，对提取的混合基因组进行纯化。
根据本发明优选的，步骤(1)中，PCR扩增体系如下：
Figure BDA0003083583870000031
进一步优选的，步骤(1)中，PCR扩增程序如下：
95℃预变性10min；95℃变性15s，41℃退火15s，72℃延伸30s，33个循环；72℃终延伸5min，然后12℃静置12h。
根据本发明优选的，步骤(2)中，PCR扩增体系如下：
Figure BDA0003083583870000041
进一步优选的，步骤(2)中，PCR扩增程序如下：
98℃预变性3min；98℃变性10s，48℃退火15s，72℃延伸10s，30个循环；72℃终延伸5min，然后12℃静置12h。
根据本发明优选的，步骤(2)中，将质粒转染到DH5α感受态细胞并涂布于具有抗性的LB固体培养基上，使其形成单克隆，完成ITS2混合序列的分离。
进一步优选的，步骤(2)中，LB固体培养基的抗性为卡那霉素。
根据本发明优选的，步骤(3)中，在步骤(2)中挑取一定数量单克隆，将它们分别接种于具有抗性的LB液体培养基中；随后将该液体培养基置于35-37℃的摇床内，在转速180-200rpm的条件下摇动过夜，获得液体培养物；
进一步优选的，步骤(3)中，挑取的单克隆数量为15-20个。
进一步优选的，步骤(3)中，LB液体培养基的抗性为卡那霉素。
根据本发明优选的，步骤(3)中，应用SeqMan与Chromas软件对测序结果进行拼接校对，产物长度为：拼接后的序列长度为200-400bp；Q值为：拼接校对后产物的平均Q值>30。
根据本发明优选的，步骤(3)中，比对数据库为NCBI的在线核苷酸序列数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome)和ITS2在线数据库(http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/)。
根据本发明优选的，上述方法中，所述人参属中药材为三七和/或人参。
根据本发明优选的，ITS2通用上游引物为SEQ ID NO.4，ITS2通用下游引物为SEQID NO.5。
本发明的有益效果
1、本发明首次发现一对人参属特异性引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，该引物可以用于中成药内人参属药材的身份鉴定。中成药经过多种工艺加工，其组成成分DNA碎片化且含量较低，应用本发明发现的特异性引物对，可在基因组混杂且碎片化的状态下，对中成药内的人参属药材进行快速直观的检测，整个过程操作简单，可重复性良好。
2、本发明首次建立了一种基于人参属特异性引物和ITS2通用引物的中成药内人参属药材成分鉴定的方法。此方法不受中成药成分复杂的限制，取样量少，准确性高、可重复性佳。应用此方法可快速完成中成药内人参属中药材成分的鉴定，有效避免中成药内贵重人参属中药材的恶意缺失或伪品的认为掺入，尤其是人参、三七等常用贵重人参属中药材，减少因人参属中药材缺失造成的药效改变或因伪品冒充而引发的临床用药危害的发生。
附图说明
图1为三七修订序列与丹参的核糖体RNA序列相似部分的截图。
图2为人参修订序列与党参、地黄的核糖体RNA序列相似部分的截图；
图中A：人参修订序列与党参的核糖体RNA序列相似部位的截图；B：人参修订序列与地黄的核糖体RNA序列相似部位的截图。
图3为心可舒的混合基因组为模板，人参属特异性引物PCR扩增的结果电泳图；
图中1：DNA分子大小标记DL1000；2：扩增产物。
图4为心可舒的混合基因组为模板，ITS2通用引物PCR扩增的结果电泳图；
图中1：DNA分子大小标记DL1500；2：扩增产物。
图5为卡那霉素抗性的固体LB培养基上形成的菌落单克隆。
图6为在16个单克隆菌落内提取的质粒检测结果图；
图中1：为DNA分子大小标记DL5000的条带；2-17：分别为单克隆1-16内的质粒。
图7为单克隆1内质粒包含的ITS2序列在NCBI的核苷酸数据库内的比对鉴定结果：三七的ITS2序列。
图8为单克隆2内质粒包含的ITS2序列在NCBI的核苷酸数据库内的比对鉴定结果：三七的ITS2序列。
图9为单克隆3内质粒包含的ITS2序列在NCBI的核苷酸数据库内的比对鉴定结果：三七的ITS2序列。
图10为单克隆4内质粒包含的ITS2序列在NCBI的核苷酸数据库内的比对鉴定结果：三七的ITS2序列。
图11为单克隆5内质粒包含的ITS2序列在NCBI的核苷酸数据库内的比对鉴定结果：三七的ITS2序列。
图12为单克隆6内质粒包含的ITS2序列在NCBI的核苷酸数据库内的比对鉴定结果：三七的ITS2序列。
图13为单克隆1-6号质粒包含的ITS2比对结果，即为三七ITS2的二级结构示意图。
图14为以三七原粉的基因组、含三七的心可舒全方样品基因组和不含三七的心可舒缺方样品基因组分别为模板，应用人参属特异引物PCR扩增的结果电泳图；
图中1：DNA分子大小标记DL5000。
图15为以纯化后的滋肾育胎丸混合基因组为模板，应用人参属特异引物PCR扩增的结果电泳图；
图中1：扩增产物；2：DNA分子大小标记DL2000。
图16为以纯化后的滋肾育胎丸混合基因组为模板，应用ITS2通用引物PCR扩增的结果电泳图；
图中1：DNA分子大小标记DL5000；2：扩增产物。
图17为卡那霉素抗性的固体LB培养基上形成的菌落单克隆。
图18为5号单克隆内插入ITS2序列在NCBI的核苷酸数据库内的比对鉴定结果：人参的ITS2序列。
图19为10号单克隆内插入ITS2序列在NCBI的核苷酸数据库内的比对鉴定结果：人参的ITS2序列。
图20为13号单克隆内插入ITS2序列在NCBI的核苷酸数据库内的比对鉴定结果：人参的ITS2序列。
图21为17号单克隆内插入ITS2序列在NCBI的核苷酸数据库内的比对鉴定结果：人参的ITS2序列。
图22为18号单克隆内插入ITS2序列在NCBI的核苷酸数据库内的比对鉴定结果：人参的ITS2序列。
图23为纯化后的滋肾育胎丸全方样品和缺人参的滋肾育胎丸缺方样品的基因组分别为模板，应用人参属特异引物PCR扩增的结果；
图中1：DNA分子大小标记DL1000；2：以缺人参的滋肾育胎丸缺方样品纯化的基因组为模板的扩增产物；3：以滋肾育胎丸全方样品纯化的基因组为模板的扩增产物。
图24为以未纯化的滋肾育胎丸混合基因组为模板，应用人参属特异引物PCR扩增的结果；
图中1：DNA分子大小标记DL5000；2：扩增产物。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明技术方案作进一步阐述，但本发明内容的保护范围不限于此。
下面所用原料及试剂均可由市场购得。
心可舒成药来源于山东沃华医药科技股份有限公司，成分包括：三七、丹参、山楂、云木香与葛根。
滋肾育胎丸成药来源于白云山中一药业，成分包括：人参、菟丝子、砂仁、地黄、桑寄生、阿胶、何首乌、艾叶、巴戟天、白术、党参、枸杞、鹿角霜、续断和杜仲。
实施例1
人参属特异性引物的获得
(1)基于三七种的人参属特异性引物的获得
在NCBI的在线核苷酸数据库中，分别检索得到人参属内11个三七种的核糖体RNA对应的基因序列，如表1所示。
表1.数据库中不同三七种核糖体RNA对应的基因序列
序号 ID 长度(bp)
1 MK408810.1 5874
2 MK408784.1 5874
3 MK408777.1 5874
4 MK408769.1 5874
5 MK408804.1 5874
6 AY271919.1 746
7 MK087943.1 455
8 MH345178.1 683
9 MH345112.1 683
10 MH345110.1 683
11 MH345108.1 683
应用SeqMan软件对上述11个核苷酸序列进行相似性比对后，将它们拼接在一起，得到三七种核糖体RNA的基因修订序列，该修订序列总长度为5874bp。将该修订序列与构成心可舒成药的其它组分：丹参、山楂、云木香和葛根的核糖体RNA的基因序列进行比对，结果如图1所示，该修订序列有部分片段与丹参的核糖体RNA相似。以拼接序列的非相似部分为模板，应用Primer5.0软件进行引物设计后，得到基于三七种的人参属特异性引物SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2。
(2)基于人参种的人参属特异性引物的获得
在NCBI的在线核苷酸数据库中，分别检索得到人参属内6个人参种的核糖体RNA对应的基因序列，如表2所示。
表2.数据库中不同人参种核糖体RNA对应的基因序列
Figure BDA0003083583870000071
Figure BDA0003083583870000081
应用SeqMan软件对上述6个核苷酸序列进行相似性比对后，将它们拼接在一起，得到人参种核糖体RNA的基因修订序列，该修订序列总长度为18465bp。将该修订序列与构成滋肾育胎丸成药的其它组分的核糖体RNA的基因序列进行比对，结果如图2所示，该修订序列有部分片段分别与党参和地黄的核糖体RNA相似。以拼接序列的非相似部分为模板，应用Primer5.0软件进行引物设计后，得到基于人参种的人参属特异性引物SEQ ID NO.1和SEQID NO.2。
本发明发现，步骤(1)中基于三七种的人参属特异性引物与步骤(2)中基于人参种的人参属特异性引物的核苷酸序列相同，都是SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；即将SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2作为人参属特异性引物。
SEQ ID NO.1为上游引物，SEQ ID NO.2为下游引物；
SEQ ID NO.1：5’-CTCGTAGTTGGACTTTGGGTTGGG-3’；
SEQ ID NO.2：5’-TGGTCGGCATCGTTTATGGTTG-3’。
实施例2
一种利用实施例1中人参属特异性引物鉴定中成药内人参属中药材的方法，包括如下步骤：
鉴定的中成药样品：心可舒成药
(1)心可舒成药内人参属中药材的初步鉴定：在0-4℃条件下研磨心可舒片剂，随后称取70mg研磨后的心可舒粉剂，使用QIAGEN试剂公司的植物基因组提取试剂盒提取心可舒成药的混合基因组，基因组提取后的浓度与纯度如表3所示，由于纯DNA的A260/A280为1.8，A260/A230为2.5。因此比对表3中数据可知，心可舒样品已成功提取基因组，但是此基因组中可能混杂有碳水化合物与苯酚。
表3.心可舒成药基因组浓度及纯度
样品 浓度(ng/uL) A260/A280 A260/A230
心可舒成药 117.8 1.75 0.53
(2)以步骤(1)提取的混合基因组为模板，利用人参属特异性引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2进行PCR；PCR反应体系包括：12.5μL的2×Taq Mix、1μL浓度为10μM的SEQ IDNO.1、1μL浓度为10μM的SEQ ID NO.2、5μL的心可舒成药的混合基因组；5.5μL的去离子水。PCR扩增程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，41℃退火15s，72℃延伸30s，33个循环；72℃终延伸5min。
扩增产物的电泳检测结果如图3所示，产物单一无杂带，产物长度为416bp，所述产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。该结果可初步判定，在心可舒成药内含有人参属中药材。
(3)心可舒成药内多种药材ITS2混合序列的分离：以步骤(1)提取的混合基因组为模板，利用ITS2通用引物进行PCR，获得ITS2序列的混合产物，所述ITS2通用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4与SEQ ID NO.5所示：
上游引物：5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’ SEQ ID NO.4；
下游引物：5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’ SEQ ID NO.5；
PCR反应体系包括：12.5μL的2×PrimeSTARMax Premix、1μL浓度为10μM的SEQ IDNO.4、1μL浓度为10μM的SEQ ID NO.5、3μL的心可舒成药的混合基因组；7.5μL的去离子水；PCR扩增程序为：98℃预变性3min；98℃变性10s，48℃退火15s，72℃延伸10s，30个循环；72℃终延伸5min。
扩增产物的电泳检测结果如图4所示，产物单一无杂带，长度为600bp。该结果提示，以心可舒的混合基因组为模板，体外可成功扩增ITS2序列。由于该ITS2引物为多物种的通用引物，而心可舒成药又是由三七、丹参、山楂、木香与葛根多种药材共同组成，所以此体外扩增的产物为包含了上述五种药材ITS2序列的混合物。
(4)将步骤(3)获得的ITS2序列的混合产物插入pCR4Blunt-TOPO质粒并转染到DH5α感受态细胞中，随后将此感受态细胞涂布于浓度为50μg/mL的卡那霉素抗性的LB固体培养基上。此固体培养基于37℃条件下静置16h后，如图5所示，菌落单克隆形成。
(5)心可舒成药内三七特有ITS2序列的鉴定，在步骤(4)获得的菌落单克隆中随机挑取16个单克隆菌落，将它们分别接种于浓度为50μg/mL的卡那霉素抗性的LB液体培养基内，随后将液体培养基置于37℃的摇床内，在转速180rpm的条件下摇动过夜；待液体培养基内的菌体富集后，应用质粒小提试剂盒提取质粒，结果如图6所示。该结果提示，随机选取的16个单克隆菌落内均包含已插入特定ITS2序列的pCR4Blunt-TOPO质粒。
(6)应用sanger测序法，结合M13通用引物，即M13F：5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’SEQID NO.6；M13R：5’-CAGGAAACAGCTATGA-3’SEQ ID NO.7，对步骤(5)中的16个质粒分别进行核苷酸序列检测。随后应用SeqMan与Chromas软件，对测序结果进行序列拼接与校对，去除测序结果两端的低质量部分。结果如表4所示，上述16个质粒中，14个质粒测序成功，这14个质粒的测序结果拼接比对后长度均在200-400bp之间，且平均Q值均>40。由于三七属于双子叶植物，且双子叶植物ITS2序列的平均长度约为200bp。因此测序结果的拼接序列若小于200bp，将可能未完全覆盖特异的ITS2片段，影响对三七身份的鉴定；若其大于400bp，则可能覆盖有太多的5.8S或28S等非特异片段，干扰数据库中对三七身份的比对。Q值代表了碱基测序质量值，该值越大，说明碱基测序结果越可信。当Q值为20时，表示测序碱基的错误概率为1％。基于此，我们的检测结果平均Q值>40，说明测序拼接后的结果真实可信。
表4.点克隆测序结果拼接校对后
序号 长度(bp) 平均Q值
1 294 40
2 299 41
3 277 40
4 249 49
5 239 46
6 256 42
7 214 41
8 304 44
9 319 46
10 219 41
11 349 43
12 290 46
13 279 47
14 214 47
15 — —
16 — —
(7)应用NCBI的核苷酸在线数据库与ITS2在线数据库，分别对上述14个拼接校对后的测序结果进行比对，根据E Value、Max Score和Per Iden的得分，对测序结果进行鉴定后发现，1-6号为三七的ITS2序列，见图7-12，图13为三七ITS2的二级结构示意图。
实施例3
一种利用实施例1中人参属特异性引物鉴定中成药内人参属中药材的方法，包括如下步骤：
鉴定的中成药样品：三七缺方的心可舒成药
(1)在0-4℃条件下研磨三七缺方的心可舒成药，随后称取70mg研磨后的粉剂，使用QIAGEN试剂公司的植物基因组提取试剂盒提取三七缺方的心可舒成药的混合基因组，基因组提取后的浓度与纯度如表5所示，此结果说明：三七缺方的心可舒样品已成功提取基因组，但是此基因组中可能混杂有碳水化合物和苯酚。
表5.三七缺方的心可舒成药基因组提取后的浓度及纯度
样品 浓度(ng/uL) A260/A280 A260/A230
三七缺方的心可舒 98 1.91 0.74
(2)以步骤(1)提取的混合基因组为模板，利用人参属特异性引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2进行PCR，PCR扩增体系以及扩增程序参见实施例2中的步骤(3)。
扩增结果如图14所示，无相应条带扩增出来。但是以三七和全方心可舒的混合基因组为模板，应用相同的引物和PCR扩增条件，仍然可以扩增出特异条带，见图14。该结果提示，三七缺方的心可舒混合基因组内不包含人参属中药材；亦证明此检测样品内不包含三七基因组，进一步说明了本发明涉及的人参属特异性引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2能够快速有效的鉴定中成药内是否含有人参属中药材。
实施例4
一种利用实施例1中人参属特异性引物鉴定中成药内人参属中药材的方法，包括如下步骤：
鉴定的中成药样品：滋肾育胎丸成药
(1)滋肾育胎丸成药内人参属中药材的初步鉴定：在0-4℃条件下研磨滋肾育胎丸，随后称取70mg研磨后的粉剂，使用QIAGEN试剂公司的植物基因组提取试剂盒提取滋肾育胎丸成药的混合基因组。基因组提取后的浓度与纯度如表6所示，由于纯DNA的A260/A280数值为1.8，A260/A230数值为2.5。因此对比表6中数据可知，滋肾育胎丸样品的基因组虽已成功提取，但是其中混杂有大量蛋白质、酚类物质、碳水化合物和盐等。应用OMEGA试剂公司的基因组纯化试剂盒将上述基因组进行纯化后，浓度与纯度如表7所示。比对表7中数据可知，滋肾育胎丸样品的基因组经纯化后，浓度虽有降低，但是其中混杂的蛋白质、酚类物质、碳水化合物和盐等有所减少。
表6.滋肾育胎丸成药基因组浓度及纯度
样品 浓度(ng/uL) A260/A280 A260/A230
滋肾育胎丸成药 332.9 0.95 0.43
表7.滋肾育胎丸成药基因组纯化后浓度及纯度
样品 浓度(ng/uL) A260/A280 A260/A230
滋肾育胎丸成药 22.9 1.04 0.49
(2)以步骤(1)提取的纯化后的混合基因组为模板，利用人参属特异性引物SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2进行PCR；PCR反应体系包括：12.5μL的2×Taq Mix、1μL浓度为10μM的SEQ ID NO.1、1μL浓度为10μM的SEQ ID NO.2、10.5μL的滋肾育胎丸成药纯化后的混合基因组；PCR扩增程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，50℃退火15s，72℃延伸30s，33个循环；72℃终延伸5min。
扩增产物的电泳检测结果如图15所示，产物单一，无杂带，产物长度为416bp，所述产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。该结果提示，在滋肾育胎丸成药内含有人参属中药材。
(3)滋肾育胎丸成药内多种药材ITS2混合序列的分离：以步骤(1)提取的纯化后的混合基因组为模板，利用ITS2通用引物进行PCR，获得ITS2序列的混合产物，所述ITS2通用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4与SEQ ID NO.5所示：
PCR反应体系包括：12.5μL的2×PrimeSTARMax Premix、1μL浓度为10μM的SEQ IDNO.4、1μL浓度为10μM的SEQ ID NO.5、10.5μL的滋肾育胎丸纯化后的混合基因组；PCR扩增程序为：98℃预变性3min；98℃变性10s，48℃退火15s，72℃延伸10s，30个循环；72℃终延伸5min。
扩增产物的电泳检测结果如图16所示，产物单一，无杂带，长度为600bp。该结果提示，以滋肾育胎丸的混合基因组为模板，体外可成功扩增ITS2序列。由于该ITS2引物为多物种的通用引物，而滋肾育胎丸成药又是由人参、菟丝子、砂仁、地黄、桑寄生、阿胶、何首乌、艾叶、巴戟天等多种药材共同组成，因此体外扩增产物应为多种药材ITS2序列共同组成的混合DNA。
(4)将步骤(3)获得的ITS2序列的混合产物插入pCR4Blunt-TOPO质粒并转染到DH5α感受态细胞中，随后将此感受态细胞涂布于浓度为50μg/mL的卡那霉素抗性的LB固体培养基上。此固体培养基于37℃条件下静置16h后，如图17所示，菌落单克隆形成。
(5)滋肾育胎丸成药内人参特有ITS2序列的鉴定，在步骤(4)获得的菌落单克隆中随机挑取20个单克隆菌落，将它们分别接种于浓度为50μg/mL的卡那霉素抗性的LB液体培养基内，随后将液体培养基置于37℃的摇床内，在转速180rpm的条件下摇动过夜；待液体培养基内的菌体富集后，应用质粒小提试剂盒提取质粒，并使用sanger测序法，结合M13通用引物，M13F：5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’SEQ ID NO.6；M13R：5’-CAGGAAACAGCTA TGA-3’SEQID NO.7，对上述20个质粒分别进行核苷酸序列检测。
(6)应用SeqMan与Chromas软件，对测序结果进行序列拼接与校对。结果显示，1-4号、6-8号、16号、19-20号十个单克隆为未插入外源DNA的自连pCR4Blunt-TOPO质粒；5号、9-15号、17-18号十个单克隆为插入有外源DNA的pCR4Blunt-TOPO质粒。10个插入有外源DNA的质粒的测序结果进行拼接校对后，如表8所示，校对后的测序片段长度均在200-400bp之间，且平均Q值均>35。由于人参属于双子叶植物，而双子叶植物ITS2序列的长度通常约为200bp左右。因此测序结果拼接后若小于200bp，将可能未完全覆盖人参特异的ITS2片段，影响对其身份的鉴定；若其大于400bp，则可能覆盖有太多的5.8S或28S等非特异片段，应用数据库对人参身份进行序列比对时，容易造成干扰。Q值代表了碱基测序质量值，该值越大，说明碱基测序结果越可信。当Q值为20时，表示测序碱基的错误概率为1％。基于此，我们的检测结果平均Q值>35，用以说明测序拼接后的结果真实可信。
表8.点克隆测序结果拼接校对后的长度与Q值
点克隆序号 长度(bp) 平均Q值
5 353 40
9 278 45
10 317 44
11 210 39
12 311 43
13 384 42
14 374 42
15 345 40
17 353 48
18 339 48
(7)应用NCBI的核苷酸在线数据库，分别对上述10个拼接校对后的测序结果进行比对，根据E Value、Max Score和Per Iden的得分，对测序结果进行鉴定后发现，5、10、13、17与18号均为人参的ITS2序列，见图18-22。
实施例5
一种利用实施例1中人参属特异性引物鉴定中成药内人参属中药材的方法，包括如下步骤：
鉴定的中成药样品：人参缺方的滋肾育胎丸成药
(1)在4℃条件下研磨不含人参的滋肾育胎丸样品，随后称取70mg研磨后的粉剂，使用QIAGEN试剂公司的植物基因组提取试剂盒提取人参缺方的滋肾育胎丸成药的混合基因组，随后应用OMEGA试剂公司的基因组纯化试剂盒将上述基因组进行纯化，纯化后的浓度与纯度如表9所示。该结果提示，已成功纯化得到人参缺方的滋肾育胎丸成药的基因组。
表9.人参缺方的滋肾育胎丸成药基因组纯化后的浓度及纯度
样品 浓度(ng/uL) A260/A280 A260/A230
人参缺方的滋肾育胎丸 71.5 1.00 0.40
(2)以步骤(1)提取的纯化后的混合基因组为模板，利用人参属特异性引物SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2进行PCR，PCR反应体系包括：12.5μL的2×Taq Mix、1μL浓度为10μM的SEQ ID NO.1、1μL浓度为10μM的SEQ ID NO.2、7μL的滋肾育胎丸纯化后的混合基因组、3.5μL的去离子水；PCR扩增程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，50℃退火15s，72℃延伸30s，33个循环；72℃终延伸5min。
扩增产物的电泳检测结果如图23所示，以人参缺方的滋肾育胎丸纯化后的混合基因组为模板进行PCR扩增，无相应条带扩增出来。但是以全方滋肾育胎丸纯化后的混合基因组为模板，应用相同的PCR扩增条件，仍然可以扩增出特异条带，见图23。该结果可以直接判定，人参缺方的滋肾育胎丸混合基因组内不包含人参属中药材；亦证明此检测样品内不包含人参成分，进一步说明了本发明涉及的人参属特异性引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2能够快速有效的鉴定中成药内是否含有人参属中药材。
对比例1
基因组未纯化的滋肾育胎丸成药内人参药材的鉴别
(1)4℃条件下研磨滋肾育胎丸全方样品，随后称取70mg研磨后的粉剂，使用QIAGEN试剂公司的植物基因组提取试剂盒提取其基因组，结果如表10所示。该结果提示，已成功提取滋肾育胎丸全方成药的混合基因组。
表10.滋肾育胎丸成药基因组提取后的浓度及纯度
样品 浓度(ng/uL) A260/A280 A260/A230
人参缺方的滋肾育胎丸 122 0.91 0.45
(3)以步骤(1)中未纯化的混合基因组为模板，利用人参属特异引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2进行PCR，结果如图24所示，无相应条带扩增出来。该结果提示，滋肾育胎混合基因组未经纯化时，由于其中含有大量蛋白质、苯酚、盐和碳水化合物等杂质，它们均会对PCR产物的扩增造成干扰，因此虽然中成药内含有人参药材，但是通过人参属特异引物仍无法对其完成初步鉴定，需要将混合基因组进行纯化后再利用本发明涉及人参属特异引物进行鉴定。
本发明利用三七种核糖体RNA的基因修订序列与丹参、山楂、云木香和葛根的核糖体RNA的基因序列进行比对，获得引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；利用人参种核糖体RNA的基因修订序列，与构成滋肾育胎丸成药的其它组分的核糖体RNA的基因序列进行比对，获得引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。本发明首次发现，上述获得引物对的核苷酸序列相同，该结果是本领域技术人员根据现有技术无法预料的，将该引物对作为人参属特异性引物。
本发明首次发现的人参属特异性引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，该引物可以用于中成药内人参属药材的身份鉴定。中成药经过多种工艺加工，其组成成分DNA碎片化且含量较低，应用本发明发现的特异性引物对，可在基因组混杂且碎片化的状态下，对中成药内的人参属药材进行快速直观的检测，整个过程操作简单，可重复性良好；本发明还提供了人参属中药材特异性DNA分子标记，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，用于中成药内人参属药材的身份鉴定；本发明首次建立了一种基于人参属特异性引物和ITS2通用引物的中成药内人参属药材成分鉴定的方法。此方法不受中成药成分复杂的限制，取样量少，准确性高、可重复性佳。应用此方法可快速完成中成药内人参属中药材成分的鉴定，有效避免中成药内贵重人参属中药材的恶意缺失或伪品的认为掺入，尤其是人参、三七等常用贵重人参属中药材，减少因人参属中药材缺失造成的药效改变或因伪品冒充而引发的临床用药危害的发生。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省科学院生物研究所
<120> 一对人参属特异性引物及中成药内人参属中药材的分子生物学鉴定方法
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctcgtagttg gactttgggt tggg 24
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tggtcggcat cgtttatggt tg 22
<210> 3
<211> 416
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctcgtagttg gactttgggt tgggtcggcc ggtccgcctc tcggtgtgca ccgatcgtct 60
cgtcccttct gccggcgatg cgctcctgtc cttaactggc cgggtcgtgc ctccggcgct 120
gttactttga agaaattaga gtgctcaaag caagcctacg ctctggatac attagcatgg 180
gataacatca taggatttcg gtcctattac gttggccttc gggatcggag taatgattaa 240
cagggacagt cgggggcatt cgtatttcat agtcagaggt gaaattcttg gatttatgaa 300
agacgaacaa ctgcgaaagc atttgccaag gatgttttca ttaatcaaga acgaaagttg 360
ggggctcgaa gacgatcaga taccgtccta gtctcaacca taaacgatgc cgacca 416
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgcgatact tggtgtgaat 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gacgcttctc cagactacaa t 21
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gtaaaacgac ggccag 16
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
caggaaacag ctatga 16

Claims (10)

1.一对人参属特异性引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示，SEQ ID NO.1为上游引物，SEQ ID NO.2为下游引物。
2.一种鉴定人参属中药材的试剂盒Ⅰ，其特征在于，所述试剂盒Ⅰ包括权利要求1所述的人参属特异性引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
3.一种人参属中药材特异性DNA分子标记，其特征在于，所述DNA分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.一种鉴定人参属中药材的试剂盒Ⅱ，其特征在于，所述试剂盒Ⅱ包括权利要求4所述人参属中药材特异性DNA分子标记。
5.如权利要求1所述人参属特异性引物、权利要求2所述鉴定人参属中药材的试剂盒Ⅰ、权利要求3所述人参属中药材特异性DNA分子标记、权利要求4所述鉴定人参属中药材的试剂盒Ⅱ任一项中，所述人参属中药材为三七和/或人参。
6.权利要求1所述人参属特异性引物、权利要求2所述鉴定人参属中药材的试剂盒Ⅰ、权利要求3所述人参属中药材特异性DNA分子标记、权利要求4所述鉴定人参属中药材的试剂盒Ⅱ任一项在鉴定人参属中药材真伪的应用。
7.权利要求1所述人参属特异性引物、权利要求2所述鉴定人参属中药材的试剂盒Ⅰ、权利要求3所述人参属中药材特异性DNA分子标记、权利要求4所述鉴定人参属中药材的试剂盒Ⅱ任一项在鉴定中成药内是否含有人参属中药材的应用。
8.如权利要求6或权利要求7所述应用中的人参属中药材为三七和/或人参。
9.一种利用人参属特异性引物鉴定中成药内人参属中药材的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)应用植物基因组提取试剂盒，提取中成药的混合基因组；以提取的混合基因组为模板，利用所述特异性引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2进行PCR，获得人参属特异产物，即人参属特异产物长度为350-550bp，人参属特异产物电泳检测结果条带单一，无杂带，初步判定中成药内含有人参属中药材；如果未获得人参属特异产物，则直接判定中成药内不含有人参属中药材；
(2)在步骤(1)中初步判定中成药内含有人参属中药材后，以步骤(1)中提取中成药的混合基因组为模板，利用ITS2通用引物进行PCR，获得含有多种中药材ITS2序列的混合产物；应用DNA连接酶将获得的含有多种中药材ITS2序列的混合产物分别插入线性化的pCR4Blunt-TOPO质粒中，随后将该质粒转染到宿主细胞，使其形成单克隆，完成ITS2混合序列的分离；
(3)中成药内人参属中药材特有ITS2序列的鉴定，挑取一定数量的步骤(2)中的单克隆，制备液体培养物；
应用质粒小提试剂盒，分别提取液体培养物中的单克隆质粒；
应用sanger测序法对提取的单克隆质粒进行核苷酸序列检测；
应用SeqMan与Chromas软件，根据产物长度、Q值，对测序结果进行序列拼接与校对；
将拼接校对后的测序结果分别放入数据库中进行比对，根据E Value、Max Score和PerIden的得分，对测序结果进行鉴定，明确中成药的混合基因组中是否包含人参属中药材特有ITS2序列，完成中成药内人参属中药材的鉴定。
10.如权利要求9所述方法，其特征在于，步骤(1)中，人参属特异产物长度为416bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
优选的，步骤(1)中，提取中成药的混合基因组，然后使用基因组纯化试剂盒，对提取的混合基因组进行纯化；
优选的，步骤(1)中，PCR扩增体系如下：
Figure FDA0003083583860000021
优选的，步骤(1)中，PCR扩增程序如下：
95℃预变性10min；95℃变性15s，41℃退火15s，72℃延伸30s，33个循环；72℃终延伸5min，然后12℃静置12h；
根据本发明优选的，步骤(2)中，PCR扩增体系如下：
Figure FDA0003083583860000022
优选的，步骤(2)中，PCR扩增程序如下：
98℃预变性3min；98℃变性10s，48℃退火15s，72℃延伸10s，30个循环；72℃终延伸5min，然后12℃静置12h；
优选的，步骤(2)中，将质粒转染到DH5α感受态细胞并涂布于具有抗性的LB固体培养基上，使其形成单克隆，完成ITS2混合序列的分离；
优选的，步骤(2)中，LB固体培养基的抗性为卡那霉素；
优选的，步骤(3)中，在步骤(2)中挑取一定数量单克隆，将它们分别接种于具有抗性的LB液体培养基中；随后将该液体培养基置于35-37℃的摇床内，在转速180-200rpm的条件下摇动过夜，获得液体培养物；
优选的，步骤(3)中，挑取的单克隆数量为15-20个；
优选的，步骤(3)中，LB液体培养基的抗性为卡那霉素；
优选的，步骤(3)中，应用SeqMan与Chromas软件对测序结果进行拼接校对，产物长度为：拼接后的序列长度为200-400bp；Q值为：拼接校对后产物的平均Q值>30；
优选的，步骤(3)中，比对数据库为NCBI的在线核苷酸序列数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome)和ITS2在线数据库(http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/)；
优选的，所述方法中，所述人参属中药材为三七和/或人参；
优选的，ITS2通用上游引物为SEQ ID NO.4，ITS2通用下游引物为SEQ ID NO.5。
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