CN118109601A - 用于龟甲及其配方颗粒、标准汤剂的pcr鉴别的引物及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于龟甲及其配方颗粒、标准汤剂的PCR鉴别的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO：2所示。本发明还公开了上述引物的应用，基于该引物的试剂盒以及基于该引物的鉴别方法。实施本发明可有效鉴别龟甲及其配方颗粒、标准汤剂的真伪。
Description
技术领域
本发明涉及中药鉴别技术领域，尤其涉及一种用于龟甲及其配方颗粒、标准汤剂的PCR鉴别的引物及方法。
背景技术
中国药典2020年版规定龟甲来源为龟科动物乌龟Chinemys reevesii(Gray)的背甲及腹甲。龟甲始载于汉代《神农本草经》，列为上品，是传统名贵药材，有滋阴潜阳、益肾强骨、养血补心、固精止汗的作用，用于阴虚潮热、骨蒸盗汗、头晕目弦、虚风内动、筋骨萎软、心虚健忘、崩漏经多等症。近代药理学研究表明龟甲有抗肿瘤，抑制肿瘤细胞的活性，在临床上应用了多年。
龟甲作为传统的滋阴药，在临床上应用广泛，且为细贵中药材，市场上出现大量的混淆品，如巴西龟、花龟、鳄龟、黄喉拟水龟等亲缘关系较近的龟类，它们形态学特征相似，依靠传统方法对破碎的、不完整的龟甲也无法进行客观准确地鉴别，使得准确性下降，尤其是经过水提取制成标准汤剂，进一步加工成配方颗粒后，在失去药材性状后，传统方法更难以进行有效鉴别，极大影响了龟甲的用药安全，为保证龟甲的质量和疗效，一种能准确、快速地鉴别龟甲及其配方颗粒、标准汤剂真伪的手段刻不容缓。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种用于龟甲及其配方颗粒、标准汤剂的PCR鉴别的引物，其可有效鉴别龟甲及其配方颗粒、标准汤剂的真伪。
本发明还要解决的技术问题在于，提供所述龟甲及其配方颗粒的PCR鉴别的引物的应用。
本发明还要解决的技术问题在于，提供一种试剂盒，其能够快速鉴别龟甲及其配方颗粒、标准汤剂的真伪。
本发明还要解决的技术问题在于，提供一种鉴别龟甲及其配方颗粒、标准汤剂真伪的方法，其准确度好、专属性高。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于龟甲及其配方颗粒、标准汤剂的PCR鉴别的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO：2所示。
表1为所述上游引物和下游引物的具体序列
为了解决上述技术问题，本发明提供了所述龟甲及其配方颗粒的PCR鉴别的引物在(1)、(2)或(3)中的应用：
(1)鉴定龟甲及其配方颗粒、标准汤剂真伪的应用；
(2)制备用于鉴别龟甲及其配方颗粒、标准汤剂的试剂盒；
(3)构建鉴别龟甲及其配方颗粒、标准汤剂真伪的方法中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述引物。
在一种实施方式中，所述试剂盒中还包括DNA阳性对照、PCR反应体系、电泳鉴定体系。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种鉴别龟甲及其配方颗粒、标准汤剂真伪的方法，包括以下步骤：
S1、提取待测样品的基因组DNA；
S2、以所述基因组DNA为模板，采用如表1所述的引物进行PCR扩增，得到扩增产物；
S3、将所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，以判断待测样品的真伪。
在一种实施方式中，步骤S2中，所述PCR扩增的程序为：将扩增体系在94℃-96℃的温度下预变性4min-6min，然后在94℃-96℃的温度下变性25s-35s，再在61℃-62℃的温度下退火25s-35s，最后在71-75℃延伸下延伸25s-35s，至此完成一个循环周期，重复完成30-33个所述循环周期后在71-75℃延伸下延伸4min-6min。
在一种实施方式中，所述PCR扩增的反应体系包括：10×PCR缓冲液2μL-3μL，dNTP1μL-3μL，Ex Taq聚合酶0.1μL-0.3μL，所述上游引物0.2μL-0.4μL，所述下游引物0.2μL-0.4μL，DNA模板0.5μL-1.5μL，灭菌双蒸水补足至25μL。
在一种实施方式中，所述dNTP的浓度为2mmol/L-3mmol/L；
所述Ex Taq聚合酶的浓度为4U/μL-6U/μL；
所述上游引物的浓度为9μmol/L-11μmol/L，所述下游引物的浓度为9μmol/L-11μmol/L；
所述DNA模板为龟甲配方颗粒DNA模板、龟甲药材DNA模板或龟甲标准汤剂DNA模板，所述龟甲配方颗粒或龟甲标准汤剂DNA模板的浓度为100ng/μl-300ng/μl，所述龟甲药材DNA模板的浓度为10ng/μl-40ng/μl。
在一种实施方式中，步骤S3中包括：将所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，若所述扩增产物在270bp处产生条带，则待测样品中含有龟甲；否则待测样品为伪劣品。
在一种实施方式中，步骤S1中，采用如下方法提取龟甲药材的基因组DNA：
取龟甲药材研磨成粉末后置于离心管中，加入SDS裂解液、蛋白酶K，涡旋震荡混匀，水浴加热过夜，取出离心，吸取上清液置于离心管中；
加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心吸取上清液，再加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心吸取上清液，再加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心吸取上清液，再加入等体积预冷异丙醇，在零下18℃-22℃静置60-90分钟，离心弃上清液，得到沉淀；
向所述沉淀中加入70％-80％乙醇，用移液器吹打，离心弃上清液，再加入无水乙醇，用移液器吹打，离心弃上清液后挥干溶剂，加高压灭菌超纯水溶解，得到龟甲药材的基因组DNA溶液。
在一种实施方式中，步骤S1中，采用如下方法提取龟甲配方颗粒和龟甲标准汤剂的基因组DNA：
取龟甲配方颗粒或龟甲标准汤剂研磨成细粉后置于离心管中，加入CTAB沉淀液，涡旋震荡，水浴加热，离心弃去上清液，再加入CTAB沉淀液，涡旋震荡，水浴加热，离心弃去上清液，再加入CTAB提取液、蛋白酶K和β-巯基乙醇，涡旋震荡混匀，水浴加热过夜，取出，离心吸取上清液置于离心管中；
加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心吸取上清液，再加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心吸取上清液，再加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心取上清液，再加入等体积预冷异丙醇，在零下18℃-22℃静置60-90分钟，离心弃上清液，得到沉淀；
向所述沉淀中加入70％-80％乙醇，用移液器吹打，离心弃上清液，再加入无水乙醇，用移液器吹打，离心弃上清液，挥干溶剂，加高压灭菌超纯水溶解，得到龟甲配方颗粒或龟甲标准汤剂的基因组DNA溶液。
实施本发明，具有如下有益效果：
本发明提供的引物能够特异性检测龟甲药材及龟甲配方颗粒、龟甲标准汤剂，可作为快速鉴别龟甲药材及龟甲配方颗粒、龟甲标准汤剂的特异性引物，为中药配方颗粒用药安全与临床疗效，提供了快速准确的鉴别方法。而且，本发明提供的鉴别方法，其准确度好、专属性高，能够快速准确地辨别龟甲及其配方颗粒的真伪，可解决龟甲配方颗粒在失去形态后难以鉴别的难题。
附图说明
图1为本发明实施例1中的引物筛选电泳图；其中，M.DNA maker DL 1000，1.龟甲对照药材，2.龟甲饮片，3-4.龟甲标准汤剂，5-6.龟甲配方颗粒，7.鳄龟药材，8.巴西龟药材，9.花龟药材，10.黄喉拟水龟药材，11.空白(ddH2O)；
图2为本发明实施例2中不同退火温度的考察结果；其中，M.DNA maker DL 1000，1.龟甲对照药材，2.龟甲饮片，3-4.龟甲标准汤剂，5-6.龟甲配方颗粒，7.鳄龟药材，8.巴西龟药材，9.花龟药材，10.黄喉拟水龟药材，11.空白(ddH2O)；
图3为本发明实施例2中不同酶的考察结果：其中，M.DNA maker DL 1000，1.龟甲对照药材，2.龟甲饮片，3-4.龟甲标准汤剂，5-6.龟甲配方颗粒，7.鳄龟药材，8.巴西龟药材，9.花龟药材，10.黄喉拟水龟药材，N.空白(ddH2O)；
图4为本发明实施例2中不同循环周数的考察结果：其中，M.DNA maker DL 1000，1.龟甲对照药材，2.龟甲饮片，3-4.龟甲标准汤剂，5-6.龟甲配方颗粒，7.鳄龟药材，8.巴西龟药材，9.花龟药材，10.黄喉拟水龟药材，N.空白(ddH2O)；
图5为本发明实施例2中方法适用性的考察结果：其中，M.DNA maker DL 1000，1.龟甲对照药材，2-17.龟甲饮片，18-33.龟甲标准汤剂，34-36.龟甲配方颗粒，37-39.鳄龟药材，40-44.巴西龟药材，45-48.花龟药材，49-51.黄喉拟水龟药材，N.空白(ddH2O)。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明作进一步地详细描述。
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
本发明中，“优选”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，则包括数值区间的两个端点。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施方式对本发明作进一步地详细描述。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于龟甲及其配方颗粒、标准汤剂的PCR鉴别的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO：2所示。
表1为所述上游引物和下游引物的具体序列
相应地，本发明提供了所述龟甲及其配方颗粒的PCR鉴别的引物在(1)、(2)或(3)中的应用：
(1)鉴定龟甲及其配方颗粒、标准汤剂真伪的应用；
(2)制备用于鉴别龟甲及其配方颗粒、标准汤剂的试剂盒；
(3)构建鉴别龟甲及其配方颗粒、标准汤剂真伪的方法中的应用。
进一步地，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述引物。在一种实施方式中，所述试剂盒中还包括DNA阳性对照、PCR反应体系、电泳鉴定体系。
再者，本发明还提供了一种鉴别龟甲及其配方颗粒、标准汤剂真伪的方法，包括以下步骤：
S1、提取待测样品的基因组DNA；
在一种实施方式中，步骤S1中，采用如下方法提取龟甲药材的基因组DNA：
取龟甲药材研磨成粉末后置于离心管中，加入SDS裂解液、蛋白酶K，涡旋震荡混匀，水浴加热过夜，取出离心，吸取上清液置于离心管中；
加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心吸取上清液，再加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心吸取上清液，再加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心吸取上清液，再加入等体积预冷异丙醇，在零下18℃-22℃静置60-90分钟，离心弃上清液，得到沉淀；
向所述沉淀中加入70％-80％乙醇，用移液器吹打，离心弃上清液，再加入无水乙醇，用移液器吹打，离心弃上清液后挥干溶剂，加高压灭菌超纯水溶解，得到龟甲药材的基因组DNA溶液。
在一种实施方式中，步骤S1中，采用如下方法提取龟甲配方颗粒和龟甲标准汤剂的基因组DNA：
取龟甲配方颗粒或龟甲标准汤剂研磨成细粉后置于离心管中，加入CTAB沉淀液，涡旋震荡，水浴加热，离心弃去上清液，再加入CTAB沉淀液，涡旋震荡，水浴加热，离心弃去上清液，再加入CTAB提取液、蛋白酶K和β-巯基乙醇，涡旋震荡混匀，水浴加热过夜，取出，离心吸取上清液置于离心管中；
加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心吸取上清液，再加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心吸取上清液，再加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心取上清液，再加入等体积预冷异丙醇，在零下18℃-22℃静置60-90分钟，离心弃上清液，得到沉淀；
向所述沉淀中加入70％-80％乙醇，用移液器吹打，离心弃上清液，再加入无水乙醇，用移液器吹打，离心弃上清液，挥干溶剂，加高压灭菌超纯水溶解，得到龟甲配方颗粒的基因组DNA溶液。
进一步地，对提取出的基因组DNA的浓度进行测定。在一种实施方式中，取基因组DNA样品，采用BioSpec-nano微量紫外分光光度计测定DNA浓度，同时记录OD260/OD230，OD260/OD280，并调整药材/饮片、配方颗粒/标准汤剂DNA浓度分别到10ng/μl-40ng/μl和100-300ng/μL。
S2、以所述基因组DNA为模板，采用如表1所述的引物进行PCR扩增，得到扩增产物；
在一种实施方式中，所述PCR扩增的程序为：将扩增体系在94℃-96℃的温度下预变性4min-6min，然后在94℃-96℃的温度下变性25s-35s，再在61℃-62℃的温度下退火25s-35s，最后在71-75℃延伸下延伸25s-35s，至此完成一个循环周期，重复完成30-33个所述循环周期后在71-75℃延伸下延伸4min-6min。
优选地，所述PCR扩增的程序为：将扩增体系在95℃的温度下预变性5min，然后在95℃的温度下变性30s，再在61℃的温度下退火30s，最后在72℃延伸下延伸30s，至此完成一个循环周期，重复完成32个所述循环周期后在72℃延伸下延伸5min。
在一种实施方式中，所述PCR扩增的反应体系包括：10×PCR缓冲液2μL-3μL，dNTP1μL-3μL，Ex Taq聚合酶0.1μL-0.3μL，所述上游引物0.2μL-0.4μL，所述下游引物0.2μL-0.4μL，DNA模板0.5μL-1.5μL，灭菌双蒸水补足至25μL。
优选地，所述PCR扩增的反应体系包括：10×PCR缓冲液2.5μL，dNTP2μL，Ex Taq聚合酶0.2μL，所述上游引物0.3μL，所述下游引物0.3μL，DNA模板1μL，灭菌双蒸水补足至25μL。
在一种实施方式中，所述dNTP的浓度为2mmol/L-3mmol/L；所述ExTaq DNA聚合酶的浓度为4U/μL-6U/μL；所述上游引物的浓度为9μmol/L-11μmol/L，所述下游引物的浓度为9μmol/L-11μmol/L；
所述DNA模板为龟甲配方颗粒DNA模板或龟甲药材DNA模板或龟甲标准汤剂DNA模板，所述龟甲配方颗粒和龟甲标准汤剂DNA模板的浓度为100ng/μl-300ng/μl，所述龟甲药材DNA模板的浓度为10ng/μl-40ng/μl。
优选地，所述dNTP的浓度为2.5mmol/L；所述Ex Taq聚合酶的浓度为5U/μL；所述上游引物的浓度为10μmol/L，所述下游引物的浓度为10μmol/L；
S3、将所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，以判断待测样品的真伪。
在一种实施方式中，向扩增产物反应体系中加入5μL 6×loading buffer，混匀，取混合产物6-8μL点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于150-170V电压的条件下电泳25min，经GelRed显色，最后于凝胶成像仪观察记录结果。
在一种实施方式中，将所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，若所述扩增产物在270bp处产生条带，则待测样品中含有龟甲；否则待测样品为伪劣品。
下面以具体实施例对本发明进行说明。
实施例1
鉴别龟甲及其配方颗粒、标准汤剂真伪的方法，具体包括以下步骤：
S1、提取待测样品的基因组DNA；
按照表2准备样品，按照下述方法进行样品基因组DNA的提取。
表2为样品列表
取龟甲药材适量，充分研磨使成粉末，取100mg，置2.0ml离心管中，加入SDS裂解液[50mmol/L Tris-盐酸pH＝8.0，200mmol/L氯化钠，250mmol/L乙二胺四乙酸二钠pH＝8.0，1％十二烷基硫酸钠]1.0ml、蛋白酶K(20mg/ml)10μl，涡旋震荡混匀，56℃水浴加热过夜(中间翻转混匀3～5次)，取出，离心(转速为每分钟12000转)10分钟，吸取上清液置另一2.0ml离心管中；加入等体积的三氯甲烷-异戊醇(体积比24:1)溶液(约1.0ml)，充分混匀，4℃离心(转速为每分钟12000转)10分钟；吸取上清液置另一2.0ml离心管中，加入等体积的三氯甲烷-异戊醇(体积比24:1)溶液(约900μl)，充分混匀，4℃离心(转速为每分钟12000转)10分钟；吸取上清液，加入等体积的三氯甲烷-异戊醇(体积比24:1)溶液(约800μl)，充分混匀，4℃离心(转速为每分钟12000转)10分钟；吸取上清液置另一1.5ml离心管中，加入等体积预冷异丙醇(约700μl)，在零下20℃静置60～90分钟；离心(转速为每分钟12000转)5分钟，弃上清液；沉淀加入75％乙醇700μl，用移液器吹打5次，离心(转速为每分钟12000转)5分钟，弃上清液，再同法操作两次；沉淀加入无水乙醇700μl，用移液器吹打5次，离心(转速为每分钟12000转)5分钟，弃上清液；置37℃下挥干溶剂，加高压灭菌超纯水50μl，置37℃使溶解，作为模板DNA溶液，置4℃保存或置零下20℃长期保存。另取龟甲对照药材适量，同法制成对照药材模板DNA溶液。
取龟甲配方颗粒/标准汤剂适量，充分研磨使成细粉，取100mg，置2.0ml离心管中，加入CTAB沉淀液[2.0％十六烷基三甲基溴化铵，100mmol/L Tris-盐酸pH＝8.0，20mmol/L乙二胺四乙酸二钠pH＝8.0]1.2ml，涡旋震荡，65℃水浴加热1小时(中间震荡混匀2～3次)，离心(转速为每分钟12000转)5分钟，弃去上清液；再加入CTAB沉淀液1.2ml，涡旋震荡，65℃水浴加热30分钟(中间震荡混匀2～3次)，离心(转速为每分钟12000转)5分钟，弃去上清液，加入CTAB提取液[2％十六烷基三甲基溴化铵，100mmol/L Tris-盐酸pH＝8.0，20mmol/L乙二胺四乙酸二钠pH＝8.0，2.5mmol/L氯化钠，2％PVP40]1.0ml、蛋白酶K(20mg/ml)10μl和β-巯基乙醇10μl，涡旋震荡混匀，56℃水浴加热过夜(中间翻转混匀3～5次)，取出，离心(转速为每分钟12000转)10分钟，吸取上清液置另一2.0ml离心管中；加入等体积的三氯甲烷-异戊醇(体积比24:1)溶液(约1.0ml)，充分混匀，4℃离心(转速为每分钟12000转)10分钟；吸取上清液置另一2.0ml离心管中，加入等体积的三氯甲烷-异戊醇(体积比24:1)溶液(约900μl)，充分混匀，4℃离心(转速为每分钟12000转)10分钟；吸取上清液，加入等体积的三氯甲烷-异戊醇(体积比24:1)溶液(约800μl)，充分混匀，4℃离心(转速为每分钟12000转)10分钟；吸取上清液置另一1.5ml离心管中，加入等体积预冷异丙醇(约700μl)，在零下20℃静置60～90分钟；离心(转速为每分钟12000转)5分钟，弃上清液；沉淀加入75％乙醇700μl，用移液器吹打5次，离心(转速为每分钟12000转)5分钟，弃上清液，再同法操作两次；沉淀加入无水乙醇700μl，用移液器吹打5次，离心(转速为每分钟12000转)5分钟，弃上清液；置37℃下挥干溶剂，加高压灭菌超纯水20μl，置37℃下使溶解，作为模板DNA溶液，置4℃保存或置零下20℃长期保存。
取上述DNA样品，采用BioSpec-nano微量紫外分光光度计测定DNA浓度，同时记录OD260/OD230，OD260/OD280，并调整浓度到相应浓度。
S2、以所述基因组DNA为模板，采用表1所述的引物进行PCR扩增，得到扩增产物；
(1)引物设计
在GeneBank数据库中搜索下载乌龟、鳄龟、巴西红耳龟、中华花龟和黄喉拟水龟的Cytochrome Oxidase I(CO I)序列，利用BioEdit软件对乌龟及其他龟类的序列进行同源比对，校对后分析乌龟的特异性SNP位点，将包含SNP位点的碱基序列导入到PrimerPremier 5软件中，进行引物设计，经初步筛选确定了表3所示的4对引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表3为引物信息表
(2)引物筛选
建立PCR扩增体系和程序，如表4所示：
表4为PCR反应体系(25μL)
PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，共32个循环；最后72℃延伸5min。
以步骤S1所得的基因组DNA和表1所示的引物进行PCR扩增，得到扩增产物。
S3、将所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，以判断待测样品的真伪。
待PCR扩增反应结束后，向反应体系加5μL 6×loading buffer，混匀，取混合产物6-8μL点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于150V电压的条件下电泳25min，经GelRed显色，于凝胶成像仪观察结果，结果见图1。结果显示，所有引物对的空白对照均未出现反应条带，说明PCR反应过程无污染，结果可靠。其中，参考文献中的引物并未能实现本研究的龟甲特异性鉴别，而本专利设计的引物组GJ-2F/GJ-2R对能够对龟甲正品进行扩增，PCR扩增得到的目的条带长度为270bp，而目标条带处伪品没有扩增条带，但部分伪品有非特异性扩增，可通过后期PCR反应条件进行优化，说明了该引物组能够特异性检测龟甲，则可作为快速鉴别龟甲的特异性引物。
实施例2
PCR反应条件优化
(1)退火温度考察
通过单因素分别考察退火温度分别为58℃、59℃、60℃、61℃时，对PCR扩增的影响。以图2所示，当退火温度分别为58℃、59℃、60℃、61℃时，龟甲DNA样品均获得PCR扩增条带，且空白对照均无假阳性出现；在58℃～60℃，龟甲伪品均获得亮度较弱的PCR扩增条带，而61℃时伪品未出现PCR扩增条带，为保证结果准确性，故选用退火温度为61℃。
(2)不同酶考察
通过单因素分别考察DNA聚合酶分别为2×M5 Supper FastTaq、Ex Taq、MightyAMP、SpeedSTAR时，对PCR扩增的影响。以图3所示，当使用中保真的2×M5 SupperFastTaq聚合酶和Ex Taq聚合酶、高度保真的SpeedSTAR聚合酶以及MightyAMP聚合酶进行试验时，只有2×M5 Supper FastTaq聚合酶和Ex Taq聚合酶获得龟甲DNA样品的PCR扩增条带，且Ex Taq聚合酶得到的条带质量较好，为保证结果准确性，故选用Ex Taq聚合酶作为DNA聚合酶。
(3)不同循环数考察
通过单因素分别考察循环数为30、32、34、36个时，对PCR扩增的影响。以图4所示，随着循环数的增加，PCR扩增条带亮度逐渐增加，且均空白对照无假阳性出现；当循环数为36和34个时，龟甲伪品均获得PCR扩增条带；当循环数为32个时，条带亮度适中，且龟甲伪品无条带出现，为保证结果准确性，故选循环数为32个。
(4)龟甲特异性PCR方法适用性检测
以龟甲对照药材1批、龟甲饮片16批、龟甲标准汤剂16批、龟甲配方颗粒3批、鳄龟药材3批、巴西红耳龟药材5批、中华花龟药材4批和黄喉拟水龟3批DNA为模板，利用引物组GJ2-F/GJ2-R进行PCR扩增，验证龟甲特异性PCR法的适用性。
根据图5所示，引物组GJ2-F/GJ2-R对龟甲及其配方颗粒、标准汤剂的鉴定率均为100％，真阳性率均为100％，真阴性率均为100％，假阳性率均为0％，假阴性率均为0％。由此表明该方法能用于龟甲及其配方颗粒、标准汤剂的特异性鉴别。
以上所述是发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于龟甲及其配方颗粒、标准汤剂的PCR鉴别的引物，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO：2所示。
2.如权利要求1所述的引物在(1)、(2)或(3)中的应用：
(1)鉴定龟甲及其配方颗粒、标准汤剂真伪的应用；
(2)制备用于鉴别龟甲及其配方颗粒、标准汤剂的试剂盒；
(3)构建鉴别龟甲及其配方颗粒、标准汤剂真伪的方法中的应用。
3.一种试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1所述的引物。
4.一种鉴别龟甲及其配方颗粒、标准汤剂真伪的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、提取待测样品的基因组DNA；
S2、以所述基因组DNA为模板，采用如权利要求1所述的引物进行PCR扩增，得到扩增产物；
S3、将所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，以判断待测样品的真伪。
5.如权利要求4所述的鉴别龟甲及其配方颗粒、标准汤剂真伪的方法，其特征在于，步骤S2中，所述PCR扩增的程序为：将扩增体系在94℃-96℃的温度下预变性4min-6min，然后在94℃-96℃的温度下变性25s-35s，再在61℃-62℃的温度下退火25s-35s，最后在71-75℃延伸下延伸25s-35s，至此完成一个循环周期，重复完成30-33个所述循环周期后在71-75℃延伸下延伸4min-6min。
6.如权利要求4所述的鉴别龟甲及其配方颗粒、标准汤剂真伪的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系包括：10×PCR缓冲液2μL-3μL，dNTP1μL-3μL，Ex Taq聚合酶0.1μL-0.3μL，所述上游引物0.2μL-0.4μL，所述下游引物0.2μL-0.4μL，DNA模板0.5μL-1.5μL，灭菌双蒸水补足至25μL。
7.如权利要求6所述的鉴别龟甲及其配方颗粒、标准汤剂真伪的方法，其特征在于，所述dNTP的浓度为2mmol/L-3mmol/L；
所述Ex Taq聚合酶的浓度为4U/μL-6U/μL；
所述上游引物的浓度为9μmol/L-11μmol/L，所述下游引物的浓度为9μmol/L-11μmol/L；
所述DNA模板为龟甲配方颗粒DNA模板、龟甲药材DNA模板或龟甲标准汤剂DNA模板，所述龟甲配方颗粒或龟甲标准汤剂DNA模板的浓度为100ng/μl-300ng/μl，所述龟甲药材DNA模板的浓度为10ng/μl-40ng/μl。
8.如权利要求4所述的鉴别龟甲及其配方颗粒、标准汤剂真伪的方法，其特征在于，步骤S3中包括：
将所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，若所述扩增产物在270bp处产生条带，则待测样品中含有龟甲；否则待测样品为伪劣品。
9.如权利要求4所述的鉴别龟甲及其配方颗粒、标准汤剂真伪的方法，其特征在于，步骤S1中，采用如下方法提取龟甲药材的基因组DNA：
取龟甲药材研磨成粉末后置于离心管中，加入SDS裂解液、蛋白酶K，涡旋震荡混匀，水浴加热过夜，取出离心，吸取上清液置于离心管中；
加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心吸取上清液，再加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心吸取上清液，再加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心吸取上清液，再加入等体积预冷异丙醇，在零下18℃-22℃静置60-90分钟，离心弃上清液，得到沉淀；
向所述沉淀中加入70％-80％乙醇，用移液器吹打，离心弃上清液，再加入无水乙醇，用移液器吹打，离心弃上清液后挥干溶剂，加高压灭菌超纯水溶解，得到龟甲药材的基因组DNA溶液。
10.如权利要求4所述的鉴别龟甲及其配方颗粒、标准汤剂真伪的方法，其特征在于，步骤S1中，采用如下方法提取龟甲配方颗粒或龟甲标准汤剂的基因组DNA：
取龟甲配方颗粒或龟甲标准汤剂研磨成细粉后置于离心管中，加入CTAB沉淀液，涡旋震荡，水浴加热，离心弃去上清液，再加入CTAB沉淀液，涡旋震荡，水浴加热，离心弃去上清液，再加入CTAB提取液、蛋白酶K和β-巯基乙醇，涡旋震荡混匀，水浴加热过夜，取出，离心吸取上清液置于离心管中；
加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心吸取上清液，再加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心吸取上清液，再加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心取上清液，再加入等体积预冷异丙醇，在零下18℃-22℃静置60-90分钟，离心弃上清液，得到沉淀；
向所述沉淀中加入70％-80％乙醇，用移液器吹打，离心弃上清液，再加入无水乙醇，用移液器吹打，离心弃上清液，挥干溶剂，加高压灭菌超纯水溶解，得到龟甲配方颗粒或龟甲标准汤剂的基因组DNA溶液。
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