CN118109599A - 用于龟甲及其配方颗粒和饮片的ARMS-qPCR鉴别的引物及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于龟甲及其配方颗粒和饮片的ARMS‑qPCR鉴别的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO：2所示。本发明还公开了上述引物的应用，基于该引物的试剂盒以及基于该引物的鉴别方法。实施本发明可有效鉴别龟甲及其配方颗粒和饮片的真伪。
Description
技术领域
本发明涉及中药鉴别技术领域，尤其涉及一种用于龟甲及其配方颗粒和饮片的ARMS-qPCR鉴别的引物及方法。
背景技术
中国药典2020年版规定龟甲来源为龟科动物乌龟Chinemys reevesii(Gray)的背甲及腹甲。全年均可捕捉，以秋、冬二季为多，捕捉后杀死，剥取背甲和腹甲，除去残肉，晒干。龟甲始载于汉代《神农本草经》，列为上品，是传统名贵药材，有滋阴潜阳、益肾强骨、养血补心、固精止汗的作用，用于阴虚潮热、骨蒸盗汗、头晕目弦、虚风内动、筋骨萎软、心虚健忘、崩漏经多等症。近代药理学研究表明龟甲有抗肿瘤，抑制肿瘤细胞的活性，在临床上应用了多年。
龟甲作为传统的滋阴药，在临床上应用广泛，且为细贵中药材，市场上出现大量的混淆品，如巴西龟、花龟、鳄龟、黄喉拟水龟等亲缘关系较近的龟类，它们形态学特征相似，依靠传统方法对破碎的、不完整的龟甲也无法进行客观准确地鉴别，使得准确性下降，尤其是经过水提取制成标准汤剂，进一步加工成配方颗粒后，在失去药材性状后，传统方法更难以进行有效鉴别，极大影响了龟甲的用药安全，为保证龟甲的质量和疗效，一种能准确、快速地鉴别龟甲及其配方颗粒和饮片真伪的手段刻不容缓。
ARMS(amplification refractory mutation system)即扩增突变系统是将一个不匹配的核苷酸引入引物3’端，结合不同序列的SNP位点，对核苷酸多态性的基因分型进行确定。本专利针对同源性较高的4个不同品种的龟类DNA条形码进一步分析，得到候补SNP位点，并根据SNP位点结合ARMS技术成功设计出1对种内特异性ARMS引物，通过real-time PCR(qPCR)技术对龟甲及其配方颗粒和饮片进行鉴别验证。qPCR技术具有高效、省时、稳定等特点，可成功将龟甲基原精准鉴定，为鉴定亲缘性较高的物种以及药材、水提取物的真伪提供了新的技术手段。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种用于龟甲及其配方颗粒和饮片的ARMS-qPCR鉴别的引物，其可有效鉴别龟甲及其配方颗粒和饮片的真伪。
本发明还要解决的技术问题在于，提供所述龟甲及其配方颗粒和饮片的ARMS-qPCR鉴别的引物的应用。
本发明还要解决的技术问题在于，提供一种试剂盒，其能够快速鉴别龟甲及其配方颗粒和饮片的真伪。
本发明还要解决的技术问题在于，提供一种鉴别龟甲及其配方颗粒和饮片真伪的方法，其准确度好、专属性高。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于龟甲及其配方颗粒和饮片的ARMS-qPCR鉴别的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ IDNO：1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO：2所示。
表1为所述上游引物和下游引物的具体序列
为了解决上述技术问题，本发明提供了所述龟甲及其配方颗粒和饮片的ARMS-qPCR鉴别的引物在(1)、(2)、(3)或(4)中的应用：
(1)鉴定龟甲及其配方颗粒和饮片真伪的应用；
(2)鉴定龟甲生品和炮制品配方颗粒；
(3)制备用于鉴别龟甲及其配方颗粒和饮片的试剂盒；
(4)构建鉴别龟甲及其配方颗粒和饮片真伪的方法中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述引物。
在一种实施方式中，所述试剂盒中还包括DNA阳性对照、qPCR反应体系、电泳鉴定体系。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种鉴别龟甲及其配方颗粒和饮片真伪的方法，包括以下步骤：
S1、提取待测样品的基因组DNA；
S2、以所述基因组DNA为模板，采用如表1所述的引物进行qPCR扩增，得到扩增产物；
S3、对所述扩增产物进行熔解曲线分析，以判断待测样品的真伪。
在一种实施方式中，所述qPCR扩增的程序为：将扩增体系在94℃-96℃的温度下预变性2min-4min，然后在94℃-96℃的温度下变性10s-20s，再在61℃-62℃的温度下退火30s-40s，至此完成一个循环周期，重复完成44-46个所述循环周期。
在一种实施方式中，所述qPCR扩增的反应体系包括：TB Green II 9μL-11μL，50×ROX 0.3μL-0.5μL，所述上游引物0.2μL-0.8μL，所述下游引物0.2μL-0.8μL，DNA模板1μL-3μL，灭菌双蒸水补足至20μL。
在一种实施方式中，所述上游引物的浓度为9μmol/L-11μmol/L，所述下游引物的浓度为9μmol/L-11μmol/L；
所述DNA模板的浓度为10ng/μl-40ng/μl。
在一种实施方式中，步骤S3中，所述熔解曲线的条件为：先在94℃-96℃的温度下停留10s-20s，然后在59℃-61℃的温度下停留55s-65s，随后升温至94℃-96℃再停留10s-20s。
在一种实施方式中，对所述扩增产物进行熔解曲线分析，若所述扩增产物能够在Tm值为82处获得熔解峰，则待测样品中含有龟甲；否则待测样品为伪劣品。
在一种实施方式中，步骤S1中，采用如下方法提取龟甲药材或饮片的基因组DNA：
取龟甲药材或饮片研磨成粉末后置于离心管中，加入SDS裂解液、蛋白酶K，涡旋震荡混匀，水浴加热过夜，取出离心，吸取上清液置于离心管中；
加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心吸取上清液，再加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心吸取上清液，再加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心吸取上清液，再加入等体积预冷异丙醇，在零下18℃-22℃静置60-90分钟，离心弃上清液，得到沉淀；
向所述沉淀中加入70％-80％乙醇，用移液器吹打，离心弃上清液，再加入无水乙醇，用移液器吹打，离心弃上清液后挥干溶剂，加高压灭菌超纯水溶解，得到龟甲药材的基因组DNA溶液。
在一种实施方式中，步骤S1中，采用如下方法提取龟甲配方颗粒的基因组DNA：
取龟甲配方颗粒研磨成细粉后置于离心管中，加入CTAB沉淀液，涡旋震荡，水浴加热，离心弃去上清液，再加入CTAB沉淀液，涡旋震荡，水浴加热，离心弃去上清液，再加入CTAB提取液、蛋白酶K和β-巯基乙醇，涡旋震荡混匀，水浴加热过夜，取出，离心吸取上清液置于离心管中；
加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心吸取上清液，再加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心吸取上清液，再加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心取上清液，再加入等体积异丙醇，在零下18℃-22℃静置60-90分钟，离心弃上清液，得到沉淀；
向所述沉淀中加入70％-80％乙醇，用移液器吹打，离心弃上清液，再加入无水乙醇，用移液器吹打，离心弃上清液，挥干溶剂，加高压灭菌超纯水溶解，得到龟甲配方颗粒的基因组DNA溶液。
实施本发明，具有如下有益效果：
本发明提供的引物能够特异性检测龟甲药材及龟甲配方颗粒、饮片，可作为快速鉴别龟甲药材及龟甲配方颗粒、饮片的特异性引物，为中药配方颗粒用药安全与临床疗效，提供了快速准确的鉴别方法。而且，本发明提供的鉴别方法，其准确度好、专属性高，能够快速准确地辨别龟甲及其配方颗粒和饮片的真伪，并且，本发明可快速鉴定龟甲生品和炮制品配方颗粒，可解决龟甲配方颗粒在失去形态后难以鉴别的难题。
附图说明
图1为本发明实施例1中的熔解曲线分析结果；
图2为本发明实施例2中龟甲配方颗粒的灵敏度的熔解曲线考察结果；
图3为本发明实施例2中龟甲药材的灵敏度熔解曲线考察结果。
图4为本发明实施例2中龟甲配方颗粒的不同引物浓度的熔解曲线考察结果；
图5为本发明实施例2中龟甲药材的不同引物浓度的熔解曲线考察结果；
图6为本发明实施例2中龟甲配方颗粒的重复性的熔解曲线考察结果；
图7为本发明实施例2中龟甲药材的重复性的熔解曲线考察结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明作进一步地详细描述。
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
本发明中，“优选”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，则包括数值区间的两个端点。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施方式对本发明作进一步地详细描述。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于龟甲及其配方颗粒和饮片的ARMS-qPCR鉴别的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ IDNO：1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO：2所示。
表1为所述上游引物和下游引物的具体序列
相应地，本发明提供了所述龟甲及其配方颗粒和饮片的ARMS-qPCR鉴别的引物在(1)、(2)、(3)或(4)中的应用：
(1)鉴定龟甲及其配方颗粒和饮片真伪的应用；
(2)鉴定龟甲生品和炮制品配方颗粒；
(3)制备用于鉴别龟甲及其配方颗粒和饮片的试剂盒；
(4)构建鉴别龟甲及其配方颗粒和饮片真伪的方法中的应用。
进一步地，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述引物。在一种实施方式中，所述试剂盒中还包括DNA阳性对照、qPCR反应体系、电泳鉴定体系。
再者，本发明还提供了一种鉴别龟甲及其配方颗粒和饮片真伪的方法，包括以下步骤：
S1、提取待测样品的基因组DNA；
在一种实施方式中，步骤S1中，采用如下方法提取龟甲药材或饮片的基因组DNA：
取龟甲药材或饮片研磨成粉末后置于离心管中，加入SDS裂解液、蛋白酶K，涡旋震荡混匀，水浴加热过夜，取出离心，吸取上清液置于离心管中；
加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心吸取上清液，再加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心吸取上清液，再加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心吸取上清液，再加入等体积预冷异丙醇，在零下18℃-22℃静置60-90分钟，离心弃上清液，得到沉淀；
向所述沉淀中加入70％-80％乙醇，用移液器吹打，离心弃上清液，再加入无水乙醇，用移液器吹打，离心弃上清液后挥干溶剂，加高压灭菌超纯水溶解，得到龟甲药材的基因组DNA溶液。
在一种实施方式中，步骤S1中，采用如下方法提取龟甲配方颗粒的基因组DNA：
取龟甲配方颗粒研磨成细粉后置于离心管中，加入CTAB沉淀液，涡旋震荡，水浴加热，离心弃去上清液，再加入CTAB沉淀液，涡旋震荡，水浴加热，离心弃去上清液，再加入CTAB提取液、蛋白酶K和β-巯基乙醇，涡旋震荡混匀，水浴加热过夜，取出，离心吸取上清液置于离心管中；
加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心吸取上清液，再加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心吸取上清液，再加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心取上清液，再加入等体积异丙醇，在零下18℃-22℃静置60-90分钟，离心弃上清液，得到沉淀；
向所述沉淀中加入70％-80％乙醇，用移液器吹打，离心弃上清液，再加入无水乙醇，用移液器吹打，离心弃上清液，挥干溶剂，加高压灭菌超纯水溶解，得到龟甲配方颗粒的基因组DNA溶液。
进一步地，对提取出的基因组DNA的浓度进行测定。在一种实施方式中，取基因组DNA样品，采用BioSpec-nano微量紫外分光光度计测定DNA浓度，同时记录OD260/OD230，OD260/OD280，并调整浓度到10-40ng/μL。
S2、以所述基因组DNA为模板，采用如表1所述的引物进行qPCR扩增，得到扩增产物；
在一种实施方式中，所述qPCR扩增的程序为：将扩增体系在94℃-96℃的温度下预变性2min-4min，然后在94℃-96℃的温度下变性10s-20s，再在61℃-62℃的温度下退火30s-40s，至此完成一个循环周期，重复完成44-46个所述循环周期。
优选地，所述qPCR扩增的程序为：将扩增体系在95℃预变性3min；95℃变性15s，62℃退火35s，共45个循环。
在一种实施方式中，所述qPCR扩增的反应体系包括：TB Green II 9μL-11μL，50×ROX 0.3μL-0.5μL，所述上游引物0.2μL-0.8μL，所述下游引物0.2μL-0.8μL，DNA模板1μL-3μL，灭菌双蒸水补足至20μL。
在一种实施方式中，所述上游引物的浓度为9μmol/L-11μmol/L，所述下游引物的浓度为9μmol/L-11μmol/L；所述DNA模板的浓度为10ng/μl-40ng/μl。
优选地，所述qPCR扩增的反应体系包括：TB Green II 10μL，50×ROX 0.4μL，所述上游引物0.4μL，所述下游引物0.4μL，DNA模板2μL，灭菌双蒸水补足至20μL。
所述上游引物的浓度为10μmol/L，所述下游引物的浓度为10μmol/L；所述DNA模板的浓度为10ng/μl-40ng/μl。
S3、对所述扩增产物进行熔解曲线分析，以判断待测样品的真伪。
在一种实施方式中，所述熔解曲线的条件为：先在94℃-96℃的温度下停留10s-20s，然后在59℃-61℃的温度下停留55s-65s，随后升温至94℃-96℃再停留10s-20s。
优选地，所述熔解曲线的条件为：先在95℃的温度下停留15s，然后在60℃的温度下停留60s，随后升温至95℃的温度下停留15s，升温过程中每分钟上升0.3℃。
在一种实施方式中，对所述扩增产物进行熔解曲线分析，若所述扩增产物能够在Tm值为82处获得熔解峰，则待测样品中含有龟甲；否则待测样品为伪劣品。
下面以具体实施例对本发明进行说明。
实施例1
鉴别龟甲及其配方颗粒和饮片真伪的方法，具体包括以下步骤：
S1、提取待测样品的基因组DNA；
按照表2准备样品，按照下述方法进行样品基因组DNA的提取。
表2为样品列表
取龟甲药材或饮片适量，充分研磨使成粉末，取100mg，置2.0ml离心管中，加入SDS裂解液[50mmol/L Tris-盐酸pH＝8.0，200mmol/L氯化钠，250mmol/L乙二胺四乙酸二钠pH＝8.0，1％十二烷基硫酸钠]1.0ml、蛋白酶K(20mg/ml)10μl，涡旋震荡混匀，56℃水浴加热过夜(中间翻转混匀3-5次)，取出，离心(转速为每分钟12000转)10分钟，吸取上清液置另一2.0ml离心管中；加入等体积的三氯甲烷-异戊醇(体积比24:1)溶液(约1.0ml)，充分混匀，4℃离心(转速为每分钟12000转)10分钟；吸取上清液置另一2.0ml离心管中，加入等体积的三氯甲烷-异戊醇(体积比24:1)溶液(约900μl)，充分混匀，4℃离心(转速为每分钟12000转)10分钟；吸取上清液，加入等体积的三氯甲烷-异戊醇(体积比24:1)溶液(约800μl)，充分混匀，4℃离心(转速为每分钟12000转)10分钟；吸取上清液置另一1.5ml离心管中，加入等体积预冷异丙醇(约700μl)，在零下20℃静置60-90分钟；离心(转速为每分钟12000转)5分钟，弃上清液；沉淀加入75％乙醇700μl，用移液器吹打5次，离心(转速为每分钟12000转)5分钟，弃上清液，再同法操作两次；沉淀加入无水乙醇700μl，用移液器吹打5次，离心(转速为每分钟12000转)5分钟，弃上清液；置37℃下挥干溶剂，加高压灭菌超纯水50μl，置37℃使溶解，作为模板DNA溶液，置4℃保存或置零下20℃长期保存。另取龟甲对照药材适量，同法制成对照药材模板DNA溶液。
取龟甲配方颗粒适量，充分研磨使成细粉，取100mg，置2.0ml离心管中，加入CTAB沉淀液[2.0％十六烷基三甲基溴化铵，100mmol/L Tris-盐酸pH＝8.0，20mmol/L乙二胺四乙酸二钠pH＝8.0]1.2ml，涡旋震荡，65℃水浴加热1小时(中间震荡混匀2-3次)，离心(转速为每分钟12000转)5分钟，弃去上清液；再加入CTAB沉淀液1.2ml，涡旋震荡，65℃水浴加热30分钟(中间震荡混匀2-3次)，离心(转速为每分钟12000转)5分钟，弃去上清液，加入CTAB提取液[2％十六烷基三甲基溴化铵，100mmol/L Tris-盐酸pH＝8.0，20mmol/L乙二胺四乙酸二钠pH＝8.0，2.5mmol/L氯化钠，2％PVP40]1.0ml、蛋白酶K(20mg/ml)10μl和β-巯基乙醇10μl，涡旋震荡混匀，56℃水浴加热过夜(中间翻转混匀3-5次)，取出，离心(转速为每分钟12000转)10分钟，吸取上清液置另一2.0ml离心管中；加入等体积的三氯甲烷-异戊醇(体积比24:1)溶液(约1.0ml)，充分混匀，4℃离心(转速为每分钟12000转)10分钟；吸取上清液置另一2.0ml离心管中，加入等体积的三氯甲烷-异戊醇(体积比24:1)溶液(约900μl)，充分混匀，4℃离心(转速为每分钟12000转)10分钟；吸取上清液，加入等体积的三氯甲烷-异戊醇(体积比24:1)溶液(约800μl)，充分混匀，4℃离心(转速为每分钟12000转)10分钟；吸取上清液置另一1.5ml离心管中，加入等体积预冷异丙醇(约700μl)，在零下20℃静置60-90分钟；离心(转速为每分钟12000转)5分钟，弃上清液；沉淀加入75％乙醇700μl，用移液器吹打5次，离心(转速为每分钟12000转)5分钟，弃上清液，再同法操作两次；沉淀加入无水乙醇700μl，用移液器吹打5次，离心(转速为每分钟12000转)5分钟，弃上清液；置37℃下挥干溶剂，加高压灭菌超纯水20μl，置37℃下使溶解，作为模板DNA溶液，置4℃保存或置零下20℃长期保存。
醋龟甲配方颗粒DNA提取方法详见专利《用于醋龟甲饮片、标准汤剂及中药配方颗粒PCR鉴别的引物组合及其应用、鉴别方法》，此处不再赘述。
取上述DNA样品，采用BioSpec-nano微量紫外分光光度计测定DNA浓度，同时记录OD260/OD230，OD260/OD280，并调整浓度到相应浓度。
S2、以所述基因组DNA为模板，采用表1所述的引物进行qPCR扩增，得到扩增产物；
(1)引物设计
在GeneBank数据库中搜索下载乌龟、鳄龟、巴西红耳龟、中华花龟和黄喉拟水龟的Cytochrome Oxidase I(CO I)序列，利用BioEdit软件对乌龟及其他龟类的序列进行同源比对，校对后分析乌龟的特异性SNP位点，确定该SNP位点后，将包含SNP位点的碱基序列导入到Primer Premier 5软件中，使SNP位点接近正向引物3’端，使SNP位点接近正向引物3’端，在原有的引物上另外添加错配碱基与3’端的第三位或者是第四位上，进通过最终引物评分以确定最佳引物组合，经初步筛选确定了如表1所示的1对引物，由上海生工有限公司合成。
(2)建立qPCR扩增体系和程序
建立qPCR扩增体系和程序，如表3所示：
表3为qPCR反应体系(20μL)
qPCR扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，62℃退火35s，共45个循环。
以步骤S1所得的基因组DNA和表1所示的引物进行qPCR扩增，得到扩增产物。
S3、对所述扩增产物进行熔解曲线分析，以判断待测样品的真伪。
待qPCR扩增反应结束后，扩增产物进行熔解曲线分析，熔解曲线条件为：先在95℃的温度下停留15s，然后在60℃的温度下停留60s，随后升温至95℃的温度下停留15s，升温过程中每分钟上升0.3℃。熔解曲线分析结果见图1，结果显示，所有引物对的空白对照均未出现扩增曲线，说明qPCR反应过程无污染，结果可靠。本发明设计的引物组GJ-4AF/GJ-4AR对能够在Tm值为82处获得龟甲熔解峰，而伪品没有获得熔解峰，说明了该引物组能够特异性检测龟甲，则可作为快速鉴别龟甲的特异性引物。
实施例2
ARMS-qPCR反应条件优化
(1)灵敏度考察
将龟甲DNA浓度稀释，按5×梯度稀释，每个梯度均取2.0μL为模板量，每个样品3个技术平行，获得其熔解曲线，并分析不同浓度模板DNA对龟甲熔解曲线峰形和Tm值的影响，测定其最小检测灵敏度。结果如图2和图3所示，龟甲配方颗粒和药材DNA浓度分别在0.62ng/μL-374.88ng/μL和1.62ng/μL-190.34ng/μL，均获得较为均一的熔解曲线，峰形差异不大，龟甲配方颗粒的Tm值较为一致，均为82，RSD值均小于0.03，且空白对照未检出任何信号，无假阳性出现，故龟甲配方颗粒和药材AMRS-qPCR鉴别检测限分别为1ng和3.30ng。
(2)不同引物浓度考察
取1批龟甲DNA样品，在20μL反应体系中分别加入0.2、0.4、0.6、0.8μL引物(母液浓度为10μmol/L)，获得其熔解曲线，并分析不同引物浓度对龟甲熔解曲线峰形和Tm值的影响，找到最佳引物浓度使其形成稳定的峰形。结果如图4和5所示，引物加入量在0.2μL-0.8μL时，均获得较为均一的熔解曲线，且峰形差异不大，其Tm值较为一致，均值为82.30，RSD值均小于0.03，且空白对照未检出任何信号，无假阳性出现，为保证结果稳定性和节约成本，故选择引物量为0.4μL。
(3)重复性考察
取同一龟甲DNA模板，设置5个平行样，每个样品3次技术平行，获得其熔解曲线，并分析同一个样本的方差来评价方法的重复性。结果如图6和7所示，5个平行样品的Tm值在82.12-82.32，均值为82.23，RSD值均小于0.03，且熔解曲线峰型稳定且基本重叠，差异不大，空白对照未检出任何信号，无假阳性出现，说明该方法重复性良好。
(4)龟甲ARMS-qPCR方法适用性检测
以龟甲对照药材1批、龟甲饮片16批、龟甲配方颗粒3批、鳄龟药材3批、巴西红耳龟药材5批、中华花龟药材4批和黄喉拟水龟3批DNA为模板，利用引物组GJ4A-F/GJ4A-R进行qPCR扩增，验证龟甲ARMS-qPCR的适用性。结果如表4、表5所示，该方法对于龟甲配方颗粒和饮片的鉴定率为100％，真阳性率为100％，真阴性率为100％，假阳性率为0％，假阴性率为0％，表明该方法能用于龟甲配方颗粒和饮片的特异性鉴别。
表4为qPCR扩增得到的龟甲配方颗粒及其伪品Tm值
表5为qPCR扩增得到的龟甲饮片及其伪品Tm值
实施例3
龟甲生品和炮制品配方颗粒的区分
以龟甲配方颗粒3批、醋龟甲配方颗粒3批DNA为模板，利用引物组GJ4A-F/GJ4A-R进行qPCR扩增，验证该引物组和ARMS-qPCR能否区分龟甲生品和炮制品配方颗粒。以表6所示，该方法只能检出龟甲配方颗粒，未能检出醋龟甲配方颗粒，且空白对照未检出任何信号，无假阳性出现；龟甲配方颗粒的的Tm值在82.18～82.48，均值为82.31，RSD值均小于0.03，而醋龟甲的Tm值均为61.44，与空白对照Tm值一致，与龟甲Tm值相差较大，说明该方法能很好地鉴别龟甲生品和炮制品配方颗粒。
表6为qPCR扩增获得的龟甲和醋龟甲配方颗粒Tm值
以上所述是发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于龟甲及其配方颗粒和饮片的ARMS-qPCR鉴别的引物，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO：2所示。
2.如权利要求1所述的引物在(1)、(2)、(3)或(4)中的应用：
(1)鉴定龟甲及其配方颗粒和饮片真伪的应用；
(2)鉴定龟甲生品和炮制品配方颗粒；
(3)制备用于鉴别龟甲及其配方颗粒和饮片的试剂盒；
(4)构建鉴别龟甲及其配方颗粒和饮片真伪的方法中的应用。
3.一种试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1所述的引物。
4.一种鉴别龟甲及其配方颗粒和饮片真伪的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、提取待测样品的基因组DNA；
S2、以所述基因组DNA为模板，采用如权利要求1所述的引物进行qPCR扩增，得到扩增产物；
S3、对所述扩增产物进行熔解曲线分析，以判断待测样品的真伪。
5.如权利要求4所述的鉴别龟甲及其配方颗粒和饮片真伪的方法，其特征在于，步骤S2中，所述qPCR扩增的程序为：将扩增体系在94℃-96℃的温度下预变性2min-4min，然后在94℃-96℃的温度下变性10s-20s，再在61℃-62℃的温度下退火30s-40s，至此完成一个循环周期，重复完成44-46个所述循环周期。
6.如权利要求4所述的鉴别龟甲及其配方颗粒和饮片真伪的方法，其特征在于，所述qPCR扩增的反应体系包括：TB Green II 9μL-11μL，50×ROX0.3μL-0.5μL，所述上游引物0.2μL-0.8μL，所述下游引物0.2μL-0.8μL，DNA模板1μL-3μL，灭菌双蒸水补足至20μL。
7.如权利要求4所述的鉴别龟甲及其配方颗粒和饮片真伪的方法，其特征在于，步骤S3中，所述熔解曲线的条件为：先在94℃-96℃的温度下停留10s-20s，然后在59℃-61℃的温度下停留55s-65s，随后升温至94℃-96℃再停留10s-20s。
8.如权利要求4所述的鉴别龟甲及其配方颗粒和饮片真伪的方法，其特征在于，步骤S3中，对所述扩增产物进行熔解曲线分析，若所述扩增产物能够在Tm值为82处获得熔解峰，则待测样品中含有龟甲；否则待测样品为伪劣品。
9.如权利要求4所述的鉴别龟甲及其配方颗粒和饮片真伪的方法，其特征在于，步骤S1中，采用如下方法提取龟甲药材或饮片的基因组DNA：
取龟甲药材或饮片研磨成粉末后置于离心管中，加入SDS裂解液、蛋白酶K，涡旋震荡混匀，水浴加热过夜，取出离心，吸取上清液置于离心管中；
加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心吸取上清液，再加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心吸取上清液，再加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心吸取上清液，再加入等体积预冷异丙醇，在零下18℃-22℃静置60-90分钟，离心弃上清液，得到沉淀；
向所述沉淀中加入70％-80％乙醇，用移液器吹打，离心弃上清液，再加入无水乙醇，用移液器吹打，离心弃上清液后挥干溶剂，加高压灭菌超纯水溶解，得到龟甲药材或饮片的基因组DNA溶液。
10.如权利要求4所述的鉴别龟甲及其配方颗粒和饮片真伪的方法，其特征在于，步骤S1中，采用如下方法提取龟甲配方颗粒的基因组DNA：
取龟甲配方颗粒研磨成细粉后置于离心管中，加入CTAB沉淀液，涡旋震荡，水浴加热，离心弃去上清液，再加入CTAB沉淀液，涡旋震荡，水浴加热，离心弃去上清液，再加入CTAB提取液、蛋白酶K和β-巯基乙醇，涡旋震荡混匀，水浴加热过夜，取出，离心吸取上清液置于离心管中；
加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心吸取上清液，再加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心吸取上清液，再加入等体积的三氯甲烷-异戊醇溶液，充分混匀，离心取上清液，再加入等体积预冷异丙醇，在零下18℃-22℃静置60-90分钟，离心弃上清液，得到沉淀；
向所述沉淀中加入70％-80％乙醇，用移液器吹打，离心弃上清液，再加入无水乙醇，用移液器吹打，离心弃上清液，挥干溶剂，加高压灭菌超纯水溶解，得到龟甲配方颗粒的基因组DNA溶液。
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