CN112538476A - 一种提取白术叶片全基因组dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学技术领域，具体提供了一种提取白术叶片全基因组DNA的方法，主要步骤为：用液氮充分研磨白术叶片样品，经过核分离液解离、CTAB裂解液水浴裂解、蛋白酶消化、氯仿/异戊醇抽提、异丙醇沉淀以及乙醇洗涤、RNA酶处理，快速提取白术全基因组DNA。与改良SDS法相比，用时缩短，DNA浓度增加，质量明显提高；与DNA提取试剂盒方法相比，用时相当，DNA浓度增加1/2，DNA质量更高，费用却极大程度降低。解决了现有技术DNA提取质量偏低、提取量较少、程序繁琐、时间长等问题，能提取高质量白术基因组DNA，为白术种质资源遗传多样性分析、种质鉴定、分类等分子生物学研究提供重要技术支持。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种提取白术叶片全基因 组DNA的方法。
背景技术
白术(Atractylodes macrocephala Koidz.)属于菊科苍术属多年生草本植 物，以根茎入药，具有健脾益气、燥湿利水、止汗安胎的功效。由于白术 栽培历史悠久，长时期的不同产区引种及杂交现象使白术出现种质混杂和 质量参差不齐的问题，因此在分子水平上研究白术遗传多样性对于白术种 质鉴定和分类至关重要。DNA提取是基于PCR技术的遗传多样性分析的前 提，因此研究白术叶片高质、高效的DNA提取方法，对白术DNA分子水平上的研究具有重要意义。
以白术叶片为研究对象，SDS法、常规CTAB法及试剂盒法都能用于提 取白术等药用植物的基因组DNA，但常规CTAB法、SDS法存在提取DNA 质量偏低、提取量较少、程序繁琐、时间长等问题。试剂盒法虽然能有效 去除DNA中的多糖多酚物质，但成本较高、提取DNA量较少，同时伴随 一定降解。
因此通过建立改良的CTAB法，并对改良CTAB法试剂组成、流程、关 键步骤进行优化，能提取高质量白术基因组DNA。这为白术种质资源遗传 多样性分析、种质鉴定、分类等分子生物学研究提供重要技术支持。
发明内容
本发明的目的是提供一种提取白术全基因组DNA的方法，至少解决现 有技术中存在的部分缺陷。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种提取白术全基因组DNA的方法，该方法包括以下步骤：
(1)用液氮将白术叶片磨成细粉；
(2)向研磨后的细粉中加入核分离液，混匀后离心，弃上清液，收集 沉淀；其中，所述核分离液由如下成分组成：100mmol/L Tris-HCl，50mmol/L EDTA，700mmol/L NaCl，20g/LPVP，4g/L半胱氨酸，40～280mmol/Lβ- 巯基乙醇，且核分离液pH为8.0；
(3)向所述步骤(2)中得到的沉淀中加入CTAB核裂解液和蛋白酶 K，然后水浴；其中，所述CTAB核裂解液由如下成分组成：100mmol/L Tris-HCl，50mmol/L EDTA，1.4mol/LNaCl，20～30g/LCTAB，20g/L PVP， 4g/L半胱氨酸，40～280mmol/Lβ-巯基乙醇；且CTAB核裂解液pH为8.0；
(4)向所述步骤(3)水浴后的混合溶液中加入氯仿-异戊醇混合液， 混匀并离心后，取上清液；
(5)向所述步骤(4)中得到的上清液中加入异丙醇，混匀后于-20℃ 沉淀然后离心，弃上清液，收集DNA沉淀；
(6)向所述步骤(5)中得到的DNA沉淀中加75～95％乙醇洗涤，离 心弃上清液，得到沉淀的DNA；室温风干，加入含RNAase的TE缓冲液 溶解沉淀，-20℃保存备用。
进一步的，所述步骤(2)中研磨后的细粉与核分离液的用量比为：每200 mg研磨后的细粉中加入1.0～1.5mL核分离液。
进一步的，所述CTAB核裂解液和蛋白酶K的用量为：每200mg研磨 后的细粉加入800～1000μL CTAB核裂解液和3～5μL蛋白酶K。
进一步的，所述蛋白酶K的浓度为20～30mg/mL。
进一步的，所述步骤(3)中水浴温度为65℃，水浴时间为20min。
进一步的，所述步骤(4)中氯仿-异戊醇混合液的用量为CTAB核裂 解液体积的2/3，且氯仿和异戊醇体积比为24:1。
进一步的，所述步骤(5)中加入的异丙醇的体积与上清液的体积相同。
进一步的，所述步骤(5)中沉淀时间为10～15min。
进一步的，所述步骤(2)(4)(5)的离心条件为：10000～12000r/min， 10～15min。
进一步的，所述步骤(6)中含RNAase的TE缓冲液由如下成分组成： 10mmol/LTris-HCl，1mmol/L EDTA，10mg/mL RNAase；且TE缓冲液的 pH为8.0。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供的这种提取白术叶片全基因组DNA方法通过在核分 离液和CTAB核裂解液中添加半胱氨酸，更有效地防止酚氧化成醌，避免 引起磷酸二酯键的断裂，造成基因组DNA完整性的破坏以及序列长度的降 低，同时利于去除沉淀中的多酚，提高DNA提取的质量。
(2)本发明提供的这种提取白术叶片全基因组DNA方法在加入CTAB 核裂解液的同时加入蛋白酶K，将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分 子分离出来，降低了提取物中的蛋白质污染，提高了DNA提取的质量。
(3)本发明提供的这种提取白术叶片全基因组DNA方法在用于溶解 DNA沉淀的TE缓冲液中加入RNAase，一方面除去沉淀中的RNA，提高 DNA提取的质量，另一方面，最后添加RNAase避免了提取液中其它物质 对RNAase活性的影响，提高了RNAase的效率。
(4)本发明提供的这种提取白术叶片全基因组DNA方法较现有技术 而言所用试剂普遍，实验流程简单，缩短了实验时间，能提取高质量白术 基因组DNA，为白术种质资源遗传多样性分析、种质鉴定、分类等分子生 物学研究提供重要技术支持。
附图说明
图1是采用不同方法提取的白术叶片全基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳 图，其中1表示改良SDS法提取的白术叶片全基因组DNA；2表示本发明 提取的白术叶片DNA；3表示试剂盒法提取的白术叶片DNA，M表示DM 2000bp marker。
图2是本发明和试剂盒法提取的白术叶片全基因组DNA的PCR扩增 电泳图，其中1表示引物UBC845(5'-CTCTCTCTCTCTCTCTRG-3')扩增 本发明提取叶片DNA的电泳结果；2表示引物ITS2(F：5'- ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3',R：5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT- 3')扩增本发明提取叶片DNA的电泳结果；3表示引物U845扩增试剂盒 法提取叶片DNA的电泳结果；4表示引物ITS2扩增试剂盒法提取叶片DNA 的电泳结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显 然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。 尽管已经详细描述了本发明的代表性实施例，但是本发明所属技术领域的 普通技术人员将理解，在不脱离本发明范围的情况下可以对本发明进行各 种修改和改变。因此，本发明的范围不应局限于实施方案，而应由所附权 利要求及其等同物来限定。
本发明提供了一种提取白术叶片全基因组DNA的方法，包括以下步 骤：
(1)用液氮将白术叶片磨成细粉。
(2)向研磨后的细粉中加入核分离液，混匀后离心，弃上清液，收集 沉淀。其中，离心条件为10000～12000r/min离心10～15min。
具体的，每200mg研磨后的细粉中加入1.0～1.5mL核分离液；所述 核分离液由如下成分组成：100mmol/L Tris-HCl，50mmol/L EDTA，700 mmol/L NaCl，20g/L PVP，4g/L半胱氨酸，40～280mmol/L β-巯基乙醇，且 核分离液pH为8.0。
(3)向所述步骤(2)中得到的沉淀中加入CTAB核裂解液和20mg/mL 蛋白酶K，然后在65℃条件下水浴裂解20min。
具体的，每200mg研磨后的细粉中加入800～1000μL CTAB核裂解液 和3～5μL蛋白酶K；所述CTAB核裂解液由如下成分组成：100mmol/L Tris-HCl，50mmol/L EDTA，1.4mol/LNaCl，20～30g/L CTAB，20g/L PVP， 4g/L半胱氨酸，40～280mmol/L β-巯基乙醇；且CTAB核裂解液pH为8.0。
(4)向所述步骤(3)水浴后的混合溶液中加入氯仿和异戊醇混合液， 混匀并离心后，取上清液；其离心条件为10000～12000r/min离心10～15 min。
具体的，氯仿和异戊醇混合液的用量为CTAB核裂解液体积的2/3，且 氯仿和异戊醇体积比为24:1。
(5)向所述步骤(4)中得到的上清液中加入等体积异丙醇，混匀后 于-20℃沉淀10～15min，然后离心，弃上清液，收集DNA沉淀；其离心 条件为10000～12000r/min离心10～15min。
(6)向所述步骤(5)中得到的DNA沉淀中加75～95％乙醇洗涤，离 心弃上清液，得到沉淀的DNA；室温风干，加入含RNAase的TE缓冲液 溶解沉淀，-20℃保存备用；其中，含RNAase的TE缓冲液由如下成分组 成：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，10mg/mLRNAase；且TE缓冲液 的pH为8.0。
下面通过具体实施例对本发明白术叶片全基因组DNA提取方法的效 果进行研究。
实施例1：
本实例研究了裂解温度对本发明白术叶片全基因组DNA提取方法的 影响，具体过程如下：
首先，称取白术叶片于4℃预冷研钵中，并于液氮中迅速研磨成细粉， 将其等分为A、B、C、D、E五份；然后，按每200mg研磨后的细粉中加 入1.5mL核分离液的用量比向A、B、C、D、E中加入核分离液，充分混 匀后离心，弃上清收集沉淀；再按每200mg研磨后的细粉加入800μL CTAB 核裂解液和5μL蛋白酶K的比例，向所得的沉淀中加入CTAB核裂解液和 20mg/mL蛋白酶K，将A、B、C、D、E分别在45℃、55℃、65℃、70℃、 75℃下水浴40min；向水浴后的混合溶液中加入体积为上述CTAB核裂解液 体积的2/3的氯仿-异戊醇混合液，所述氯仿-异戊醇混合液中氯仿和异戊醇 体积比为24:1，充分混匀并离心后取上清液；向上述上清液中加入等体积 的异丙醇，充分混匀后于-20℃沉淀10min，然后12000r/min离心10min， 弃上清收集沉淀DNA；向上述沉淀DNA中加入75％乙醇洗涤，离心弃液， 得到沉淀的DNA；室温风干，加入含RNAase的TE缓冲液溶解沉淀，-20℃ 保存备用。
其中，所述核分离液成分为：100mmol/L Tris-HCl，50mmol/L EDTA， 700mmol/LNaCl，20g/LPVP，4g/L半胱氨酸，280mmol/L β-巯基乙醇，pH 8.0。
CTAB核裂解液成分为：100mmol/L Tris-HCl，50mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl；20g/L CTAB；20g/L PVP，4g/L半胱氨酸，280mmol/L β-巯基 乙醇，pH为8.0。
含RNAase的TE缓冲液配方为：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA， 10mg/mLRNAase，pH为8.0。
对本实施例中在不同裂解温度(即45℃、55℃、65℃、70℃、75℃) 下提取的白术叶片全基因组DNA质量进行检测，其结果如表1所示。
表1：不同裂解温度的单因素试验
由表1可知，裂解温度为65℃时，DNA浓度和纯度最高，DNA浓度 和OD260/OD280分别为40.5ng/μL和1.84，表明裂解温度为65℃，本发明 提取白术叶片全基因组DNA质量效果最好。
实施例2：
本实例研究了裂解时间对本发明白术叶片全基因组DNA提取方法的 影响，具体过程如下：
首先，称取白术叶片于4℃预冷研钵中，并于液氮中迅速研磨成细粉， 将其等分为A、B、C、D、E五份；然后，按每200mg研磨后的细粉中加 入1.5mL核分离液的用量比向A、B、C、D、E中加入核分离液，充分混 匀后离心，弃上清收集沉淀；再按每200mg研磨后的细粉加入800μL CTAB 核裂解液和5μL蛋白酶K的比例，向所得的沉淀中加入CTAB核裂解液和 20mg/mL蛋白酶K，将A、B、C、D、E在65℃下分别水浴5min、10min、 20min、30min、40min；向水浴后的混合溶液中加入体积为上述CTAB核裂 解液体积的2/3的氯仿-异戊醇混合液，所述氯仿-异戊醇混合液中氯仿和异 戊醇体积比为24:1，充分混匀并离心后取上清液；向上述上清液中加入等 体积的异丙醇，充分混匀后于-20℃沉淀10min，然后12000r/min离心10 min，弃上清收集沉淀DNA；向上述沉淀DNA中加入75％乙醇洗涤，离心 弃液，得到沉淀的DNA；室温风干，加入含RNAase的TE缓冲液溶解沉 淀，-20℃保存备用。
其中，所述核分离液成分为：100mmol/L Tris-HCl，50mmol/L EDTA， 700mmol/LNaCl，20g/LPVP，4g/L半胱氨酸，280mmol/L β-巯基乙醇，pH 8.0。
CTAB核裂解液成分为：100mmol/L Tris-HCl，50mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl；20g/L CTAB；20g/L PVP，4g/L半胱氨酸，280mmol/Lβ-巯基 乙醇，pH为8.0。
含RNAase的TE缓冲液配方为：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，10mg/mLRNAase，pH为8.0。
对本实施例中在不同裂解时间(即5min、10min、20min、30min、40min) 下提取的白术叶片全基因组DNA质量进行检测，其结果如表2所示。
表2：不同裂解时间的单因素试验
由表2可知，裂解时间为20min时，DNA浓度和纯度最高，DNA浓度 和OD260/OD280分别为60.5ng/μL和1.86，表明裂解时间为20min时，本 发明提取白术叶片DNA效果最好。
实施例3：
本实施例对本发明的白术叶片全基因组DNA提取方法，以及改良SDS 法和试剂盒法提取白术DNA效果进行比较。
采用本发明白术叶片全基因组DNA提取方法，具体步骤如下：
称取白术叶片于4℃预冷研钵中，并于液氮中迅速研磨成细粉，然后， 按每200mg研磨后的细粉中加入1.5mL核分离液的用量比加入核分离液， 充分混匀后离心，弃上清收集沉淀；再按每200mg研磨后的细粉加入800μL CTAB核裂解液和5μL蛋白酶K的比例，向所得的沉淀中加入CTAB核裂 解液和20mg/mL蛋白酶K，在65℃下水浴20min；向水浴后的混合溶液中 加入体积为上述CTAB核裂解液体积的2/3的氯仿-异戊醇混合液，所述氯 仿-异戊醇混合液中氯仿和异戊醇体积比为24:1，充分混匀并离心后取上清 液；向上述上清液中加入等体积的异丙醇，充分混匀后于-20℃沉淀10min， 然后12000r/min离心10min，弃上清收集沉淀DNA；向上述沉淀DNA中 加入75％乙醇洗涤，离心弃液，得到沉淀的DNA；室温风干，加入含RNAase 的TE缓冲液溶解沉淀，-20℃保存备用。
其中，所述核分离液成分为：100mmol/L Tris-HCl，50mmol/L EDTA， 700mmol/LNaCl，20g/LPVP，4g/L半胱氨酸，280mmol/L β-巯基乙醇，pH 8.0。CTAB核裂解液成分为：100mmol/L Tris-HCl，50mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl；20g/L CTAB；20g/L PVP，4g/L半胱氨酸，280mmol/L β-巯基 乙醇，pH为8.0。含RNAase的TE缓冲液配方为：10mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，10mg/mL RNAase，pH为8.0。
采用改良SDS法提取白术叶片全基因组DNA，具体步骤如下：
称取0.2g白术叶片于预冷研钵中，液氮中迅速研磨后转入2mL离心管 中，加入800μL溶液I(500mmol/L NaCl，50mmol/L Tris.HCl，50mmol/L EDTA，2％PVP，2％β-巯基乙醇，pH 8.0)，置于室温数分钟至解冻；然后 加入280μL10％SDS，轻轻混匀，65℃水浴40min(期间每隔10min轻轻 摇动离心管一次)；取出后立即置于冰上，并加入120μL 5M KAc于冰上反应30min，在4℃下12000r/min离心20min；取上清液，加入等体积异丙 醇，轻轻混匀后，-20℃放置1h，于4℃下离心20min；弃上清液，用500μLTE 缓冲液溶解沉淀，向其中加入2/3体积的氯仿-异戊醇(24:1)混匀后，4℃， 12000r/min离心5min；取上清液，向其中加入等体积的异丙醇和1/10体 积的3MNaCl，于-20℃放置1h，于4℃，12000r/min离心20min；弃上 清，用75％乙醇洗涤沉淀1次，室温风干；加入50μL含RNAase的TE缓 冲液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，10mg/mL RNAase，pH 8.0) 溶解沉淀，-20℃保存备用。
试剂盒法：
采用天根生化科技(北京)有限公司生产的新型植物基因组提取试剂盒 (DP320-02)提取白术叶片DNA。
取2μL上述三种方法提取的DNA溶液，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测 DNA质量，结果如图1所示，其中1表示改良SDS法提取的白术叶片全基 因组DNA；2表示本发明提取的白术叶片DNA；3表示试剂盒法提取的白 术叶片DNA，M表示DM 2000bp marker。
用核酸蛋白测定仪检测DNA浓度和OD260/OD280值，结果见表3， 其中1表示改良SDS法提取的白术叶片DNA；2表示本发明提取的白术叶 片DNA；3表示试剂盒法提取的白术叶片DNA。
表3：三种方法提取白术叶片基因组DNA浓度和OD260/OD280值
由表3和图1可知，采用本发明方法提取白术叶片全基因组DNA可以 缩短时间至1.5h，与改良SDS法相比提取时间缩短了一半，提取的DNA 浓度增加2倍，DNA条带更清晰，DNA质量更高；与试剂盒法相比，用时 相当，提取的DNA浓度增加1/2，DNA条带更清晰，DNA质量更高，费 用明显降低。
另外，将用试剂盒法和本发明方法提取的DNA经过PCR验证，其结 果如图2所示。其中1表示引物UBC845(5'-CTCTCTCTCTCTCTCTRG-3') 扩增本发明提取叶片DNA的电泳结果；2表示引物ITS2(F：5'- ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3',R：5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT- 3')扩增本发明提取叶片DNA的电泳结果；3表示引物U845扩增试剂盒 法提取叶片DNA的电泳结果；4表示引物ITS2扩增试剂盒法提取叶片DNA 的电泳结果。
由图2可知，用试剂盒法和本发明方法提取的DNA经过PCR验证后 均满足分子实验要求，同时扩增出的DNA条带并无明显差异。
实施例4：
本实施例对核分离液和CTAB核裂解液中含有半胱氨酸和不含半胱氨 酸的改良CTAB法提取DNA效果进行比较。具体步骤如下：
首先，称取白术叶片于4℃预冷研钵中，并于液氮中迅速研磨成细粉， 将其等分为A、B两份；然后，按每200mg研磨后的细粉中加入1.5mL核 分离液(100mmol/L Tris-HCl，50mmol/L EDTA，700mmol/L NaCl，20g/LPVP， 4g/L半胱氨酸，280mmol/L β-巯基乙醇，pH8.0)的用量比向A、B中分别加 入含有半胱氨酸和不含半胱氨酸的核分离液，充分混匀后离心，弃上清收 集沉淀；再按每200mg研磨后的细粉加入800μL CTAB核裂解液(100 mmol/LTris-HCl，50mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl；20g/L CTAB；20g/L PVP，4g/L半胱氨酸，280mmol/L β-巯基乙醇，pH为8.0)和5μL蛋白酶K 的比例，向所得的沉淀A、B中分别加入含有半胱氨酸和不含半胱氨酸的 CTAB核裂解液和20mg/mL蛋白酶K，65℃下水浴20min；向水浴后的混 合溶液中加入体积为上述CTAB核裂解液体积的2/3的氯仿-异戊醇混合液， 所述氯仿-异戊醇混合液中氯仿和异戊醇体积比为24:1，充分混匀并离心后 取上清液；向上述上清液中加入等体积的异丙醇，充分混匀后于-20℃沉淀 10min，然后12000r/min离心10min，弃上清收集沉淀DNA；向上述沉淀 DNA中加入75％乙醇洗涤，离心弃液，得到沉淀的DNA；室温风干，加 入含RNAase的TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，10mg/mLRNAase，pH为8.0)溶解沉淀，-20℃保存备用。
对本实施例中含有半胱氨酸和不含半胱氨酸的核分离液和CTAB核裂 解液提取的DNA进行检测，其结果如表4所示。其中1表示核分离液和 CTAB核裂解液含有半胱氨酸，2表示核分离液和CTAB核裂解液不含有 半胱氨酸。
表4：不同条件下提取白术叶片基因组DNA浓度和OD260/OD280值
由表4可知，核分离液和CTAB核裂解液中，加入半胱氨酸提取DNA 质量明显高于不加入半胱氨酸提取DNA质量，表明核分离液和CTAB核裂 解液中加入半胱氨酸时，本发明提取白术叶片DNA效果最好。
实施例5：
本实施例对本发明核裂解过程中加入蛋白酶K和不加入蛋白酶K提 取DNA效果进行比较。具体步骤如下：
首先，称取白术叶片于4℃预冷研钵中，并于液氮中迅速研磨成细粉， 将其等分为A、B两份；然后，按每200mg研磨后的细粉中加入1.5mL核 分离液(100mmol/L Tris-HCl，50mmol/L EDTA，700mmol/L NaCl，20g/LPVP， 4g/L半胱氨酸，280mmol/L β-巯基乙醇，pH8.0)的用量比向A、B中分别加 入核分离液，充分混匀后离心，弃上清收集沉淀；再按每200mg研磨后的 细粉加入800μL CTAB核裂解液(100mmol/L Tris-HCl，50mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl；20g/L CTAB；20g/L PVP，4g/L半胱氨酸，280mmol/L β- 巯基乙醇，pH为8.0)和5μL蛋白酶K的比例，向所得的沉淀A中加入CTAB 核裂解液和20mg/mL蛋白酶K，向沉淀B中仅加入CTAB核裂解液，65℃ 下水浴20min；向水浴后的混合溶液中加入体积为上述CTAB核裂解液体积 的2/3的氯仿-异戊醇混合液，所述氯仿-异戊醇混合液中氯仿和异戊醇体积 比为24:1，充分混匀并离心后取上清液；向上述上清液中加入等体积的异 丙醇，充分混匀后于-20℃沉淀10min，然后12000r/min离心10min，弃上 清收集沉淀DNA；向上述沉淀DNA中加入75％乙醇洗涤，离心弃液，得 到沉淀的DNA；室温风干，加入含RNAase的TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，10mg/mL RNAase，pH为8.0)溶解沉淀，-20℃ 保存备用。
对本实施例中加入蛋白酶K和不加入蛋白酶K提取的DNA进行检 测，其结果如表5所示。
表5：不同条件下提取白术叶片基因组DNA浓度和OD260/OD280值
由表5可知，加入蛋白酶K提取DNA质量明显高于不加入蛋白酶K 提取DNA质量，不加入蛋白酶K时，提取的DNA中含有较多的蛋白， 表明核分离液和CTAB核裂解液中加入半胱氨酸时，本发明提取白术叶片 DNA效果最好。
实施例6：
本实施例对在TE缓冲液中加入RNAase和不加RNAase提取DNA效 果进行比较。具体步骤如下：
首先，称取白术叶片于4℃预冷研钵中，并于液氮中迅速研磨成细粉， 将其等分为A、B两份；然后，按每200mg研磨后的细粉中加入1.5mL核 分离液(100mmol/L Tris-HCl，50mmol/L EDTA，700mmol/L NaCl，20g/LPVP， 4g/L半胱氨酸，280mmol/L β-巯基乙醇，pH8.0)的用量比向A、B中分别加 入核分离液，充分混匀后离心，弃上清收集沉淀；再按每200mg研磨后的 细粉加入800μL CTAB核裂解液(100mmol/L Tris-HCl，50mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl；20g/L CTAB；20g/L PVP，4g/L半胱氨酸，280mmol/Lβ- 巯基乙醇，pH为8.0)和5μL蛋白酶K的比例，向所得的沉淀A、B中加入 CTAB核裂解液和20mg/mL蛋白酶K，65℃下水浴20min；向水浴后的混 合溶液中加入体积为上述CTAB核裂解液体积的2/3的氯仿-异戊醇混合液， 所述氯仿-异戊醇混合液中氯仿和异戊醇体积比为24:1，充分混匀并离心后 取上清液；向上述上清液中加入等体积的异丙醇，充分混匀后于-20℃沉淀 10min，然后12000r/min离心10min，弃上清收集沉淀DNA；向上述沉淀 DNA中加入75％乙醇洗涤，离心弃液，得到沉淀的DNA；室温风干，向 A、B中分别加入含RNAase和不含RNAase的TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，10mg/mL RNAase，pH为8.0)溶解沉淀，-20℃ 保存备用。
对本实施例TE缓冲液含RNAase和不含RNAase提取的DNA进行检 测，其结果如表6所示。
表6不同条件下提取白术叶片基因组DNA浓度和OD260/OD280值
由表6可知，TE缓冲液中，含有RNAase提取DNA质量较高于不含 有RNAase提取DNA质量，TE缓冲液中不含有RNAase时，DNA中含有 大量RNA污染，表明TE缓冲液中含有RNAase时，本发明提取白术叶片 DNA效果最好。
综上所述，本发明提供的这种提取白术叶片全基因组DNA方法较现有 技术而言所用试剂较普遍，实验流程较简单，更容易操作，缩短了实验时 间，能提取高质量白术基因组DNA，为白术种质资源遗传多样性分析、种 质鉴定、分类等分子生物学研究提供重要技术支持。
以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围 的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种提取白术叶片全基因组DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用液氮将白术叶片磨成细粉；
(2)向研磨后的细粉中加入核分离液，混匀后离心，弃上清液，收集沉淀；其中，所述核分离液由如下成分组成：100mmol/LTris-HCl，50mmol/L EDTA，700mmol/L NaCl，20g/LPVP，4g/L半胱氨酸，40～280mmol/Lβ-巯基乙醇，且核分离液pH为8.0；
(3)向所述步骤(2)中得到的沉淀中加入CTAB核裂解液和蛋白酶K，然后水浴；其中，所述CTAB核裂解液由如下成分组成：100mmol/L Tris-HCl，50mmol/LEDTA，1.4mol/LNaCl，20～30g/LCTAB，20g/LPVP，4g/L半胱氨酸，40～280mmol/Lβ-巯基乙醇；且CTAB核裂解液pH为8.0；
(4)向所述步骤(3)水浴后的混合溶液中加入氯仿-异戊醇混合液，混匀并离心后，取上清液；
(5)向所述步骤(4)中得到的上清液中加入异丙醇，混匀后于-20℃沉淀然后离心，弃上清液，收集DNA沉淀；
(6)向所述步骤(5)中得到的DNA沉淀中加75～95％乙醇洗涤，离心弃上清液，得到沉淀的DNA；室温风干，加入含RNAase的TE缓冲液溶解沉淀，-20℃保存备用。
2.根据权利要求1所述的提取白术叶片全基因组DNA的方法，其特征在于，所述步骤(2)中研磨后的细粉与核分离液的用量比为：每200mg研磨后的细粉中加入1.0～1.5mL核分离液。
3.根据权利要求1所述的提取白术叶片全基因组DNA的方法，其特征在于，所述CTAB核裂解液和蛋白酶K的用量为：每200mg研磨后的细粉加入800～1000μL CTAB核裂解液和3～5μL蛋白酶K。
4.根据权利要求1所述的提取白术叶片全基因组DNA的方法，其特征在于，所述蛋白酶K的浓度为20～30mg/mL。
5.根据权利要求1所述的提取白术叶片全基因组DNA的方法，其特征在于，所述步骤(3)中水浴温度为65℃，水浴时间为20min。
6.根据权利要求1所述的提取白术叶片全基因组DNA的方法，其特征在于，所述步骤(4)中氯仿-异戊醇混合液的用量为CTAB核裂解液体积的2/3，且氯仿和异戊醇体积比为24:1。
7.根据权利要求1所述的提取白术叶片全基因组DNA的方法，其特征在于，所述步骤(5)中加入的异丙醇的体积与上清液的体积相同。
8.根据权利要求1所述的提取白术叶片全基因组DNA的方法，其特征在于，所述步骤(5)中沉淀时间为10～15min。
9.根据权利要求1所述的提取白术叶片全基因组DNA的方法，其特征在于，所述步骤(2)(4)(5)的离心条件为：10000～12000r/min，10～15min。
10.根据权利要求1所述的提取白术叶片全基因组DNA的方法，其特征在于，所述步骤(6)中含RNAase的TE缓冲液由如下成分组成：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，10mg/mLRNAase；且TE缓冲液的pH为8.0。
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