CN109136221A - 一种提取橡胶树叶片总dna的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提取橡胶树叶片总DNA的方法，涉及植物提取技术领域，在细胞核裂解前用提取缓冲液对样品进行预处理，使细胞质中的大部分多糖和多酚类物质溶解在提取缓冲液中，通过低速离心使之与含有总DNA的样品分离；提取缓冲液中用葡萄糖作稳定剂，以保持渗透性；提取缓冲液中用高浓度的聚乙烯吡咯烷酮结合多酚类物质；提取缓冲液中用高浓度巯基乙醇作抗氧化剂；裂解液中提供高浓度的氯化钠环境，使CTAB与DNA的复合物能充分溶解。

Description

一种提取橡胶树叶片总DNA的方法
技术领域
本发明涉及植物提取技术领域，具体涉及一种提取橡胶树叶片总DNA的方法。
背景技术
橡胶树体内不仅富含胶乳，而且有大量的多酚及多糖类次生物质。在提取DNA时，多糖很难与DNA分离，而酚类物质在研磨时易氧化，并与蛋白质和核酸发生不可逆的结合，形成胶状物，这种含有DNA的胶状物对其进行PCR或酶切分析不利。虽然提取橡胶树中DNA有多种方法，但这些方法均需用氯化铯超速离心，而且产物经常呈褐色的胶状物。要提取高质量的DNA，就得克服多酚及多糖类物质的干扰。因此，亟需一种适合于提取橡胶树中高质量DNA的方法。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种提取橡胶树叶片总DNA的方法，所得DNA没有蛋白质、酚类及小分子的污染，适合于分子生物学研究。
为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：一种提取橡胶树叶片总DNA的方法，包括以下步骤：
取橡胶树叶片，放在液氮中研成粉末后转入离心管中，在离心管中加入提取缓冲液，低温离心；
弃去上清液，沉淀中加入55～75℃预热的裂解液，于55～75℃水浴中保温；
加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇混合液，于室温下离心；
上清液转至另一新管中，加入异丙醇，于室温下离心；
以乙醇洗沉淀，沉淀风干后，加入TE缓冲液，溶于微量离心管中，加入核糖核酸酶，于室温下保温；
加入等体积的氯仿∶异戊醇混合液，低温离心；
弃去上清液，加入醋酸钠，混匀后加入无水乙醇，翻转混匀，于-15℃～-25℃中静置；
低温离心，用乙醇洗沉淀，沉淀风干后，将沉淀溶于TE缓冲液中，于-15℃～-25℃下保存。
在上述方案的基础上，橡胶树叶片与提取缓冲液比例为1∶5～1∶7。
在上述方案的基础上，所述提取缓冲液为0.45M的葡萄糖、0.1mM的Tris-HCl、5mM的EDTA、2％质量浓度的聚乙烯吡咯烷酮和2％物质浓度的β-巯基乙醇。
在上述方案的基础上，所述裂解液为2％质量浓度的CTAB、2％质量浓度的聚乙烯吡咯烷酮、1.4M的NaCl、20mM的EDTA、0.1M的Tris-HCl和2％物质浓度的巯基乙醇。
在上述方案的基础上，所述TE缓冲液为10mM的Tris-HCl和1mM的EDTA。
在上述方案的基础上，所述Tris-HCl的PH值为7.1～8.0。
在上述方案的基础上，所述EDTA的PH值为7.1～8.0。
在上述方案的基础上，所述酚∶氯仿∶异戊醇混合液中酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1。
在上述方案的基础上，所述氯仿∶异戊醇混合液中氯仿∶异戊醇的体积比为24∶1。
在上述方案的基础上，所述醋酸钠浓度为3mol/L。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
本发明提供一种提取橡胶树叶片总DNA的方法，(1)在细胞核裂解前用提取缓冲液对样品进行预处理，使细胞质中的大部分多糖和多酚类物质溶解在提取缓冲液中，通过低速离心使之与含有总DNA的样品分离；(2)提取缓冲液中用葡萄糖作稳定剂，以保持渗透性；(3)提取缓冲液中用高浓度的聚乙烯吡咯烷酮结合多酚类物质；(4)提取缓冲液中用高浓度巯基乙醇作抗氧化剂；(5)裂解液中提供高浓度的氯化钠环境，使CTAB与DNA的复合物能充分溶解。
附图说明
图1为本发明实施例中RRIM600总DNA的质量分析图。
图中：a为从橡胶树品种RRIM600不同生长时期(古铜期、变色期、稳定期)叶片中所提的总DNA；b为ISSR引物836的扩增图谱。
具体实施方式
以下结合附图及实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1：
本发明实施例提供一种提取橡胶树叶片总DNA的方法：
(1)取1g橡胶树叶片，放在液氮中快速研成粉末后转入15ml的离心管中。
(2)在盛有样品的离心管中加入5mL冰冷的提取缓冲液，混匀，冰上放置20min。样品与缓冲液的比例以1∶5～1∶7为宜，缓冲液太少，DNA产量会下降。
(3)以4020×g，于4℃下离心20min。
(4)弃去上清液，沉淀中加入65℃预热的5mL裂解液，混匀后于65℃水浴中保温40min。弃去的上清液中含有大量来自细胞质的多糖、多酚及色素类物质，低速离心可将这些杂质与未释放出的DNA分离。沉淀中加入预热的裂解液使核内的DNA释放出来，同时可钝化内源核酸酶的活性，以使释放出的DNA受到保护。
(5)加等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，翻转混匀约80次，直至有机相溶液浑浊为止。这样，可有效去除蛋白质。
(6)以11180×g，于室温下离心20min。CTAB溶液在低于15℃时会产生沉淀，所以不能在低温下离心。
(7)上清液转至另一新管中，加入0.6体积的冰冷的异丙醇，翻转混匀40次后于室温下静置10min
(8)以11180×g，于室温下离心10min，以70％乙醇洗沉淀2次，以除去沉淀中的小分子物质。
(9)沉淀风干后，加入500μl TE，溶于Eppendorf管中。加入2μl RNaseA，于37℃下保温30min。
(10)加等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，翻转混匀约80次，于4℃以11180×g离心10min。
(11)转移上清液，加入0.1体积的3M醋酸钠，
(12)混匀后加入2倍体积的无水乙醇，翻转混匀40次，于-20℃中静置30min，以使DNA得到充分沉淀。
(13)以11180×g于4℃下离心5min，用70％乙醇洗沉淀2次，以除去沉淀中的小分子物质。
(14)风干后，将沉淀溶于100μl TE中，于-20℃下保存。
实施例2：
在实施例1的基础上，实施例1的提取方法中采用的试剂及配方如下：
(1)提取缓冲液：0.45M的葡萄糖、0.1mM的Tris-HCl(pH8.0)、5mM的EDTA(pH8.0)、2％质量浓度的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、2％物质浓度的β-巯基乙醇。
(2)裂解液：2％质量浓度的CTAB、2％质量浓度的PVP、1.4M的NaCl、20mM的EDTA(pH8.0)、0.1M的Tris-HCl(pH8.0)、2％物质浓度的β-巯基乙醇。
(3)TE缓冲液:10mM的Tris-HCl、1mM的EDTA(pH8.0)。
(4)酚∶氯仿∶异戊醇:25∶24∶1。
(5)氯仿∶异戊醇：24∶1。
(6)乙醇：70％。
(7)无水乙醇。
(8)醋酸钠：3M，pH5.2。
(9)异丙醇。
实施例3：
在实施例1的基础上，简单序列重复间区分析步骤如下：
1)提取到的DNA质量检测：
用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。
2)简单序列重复间区(inter-simple sequence repeats，ISSR)分析
ISSR-PCR反应在BiometraT1PCR仪上进行。引物为836(GAGAGAGAGAGAGAGYA)。反应体积为10ul，反应体系参照所使用的PCR反应试剂盒，反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸70s，共循环45次；72℃下延伸7min。将扩增产物在2％琼脂糖凝胶(含0.5ug/ml的溴化乙锭)，80V稳压条件下进行电泳，紫外灯下观察结果并照相。
实施例4：
在实施例1的基础上，采用该方法提取近500个橡胶树样品的DNA，均获得满意的结果：
OD260/OD280在1.8～2.0，OD260/OD230在2.0～2.7，大量提取DNA的产量最高可达400μg·g-1(FW)，小量提取的DNA产量在50μg·g-1(FW)左右。橡胶树不同生长时期的DNA产量差异较大：稳定期的产量最低，为50μg·g-1(FW)；变色期的最高，为400μg·g-1(FW)；古铜期的居中。DNA得率随生长时期不同而有所差异，这可能与不同时期的橡胶树叶片的解剖结构和化学成分有关。稳定期的叶片已完全成熟，角质层较厚，叶脉明显，纤维增多增粗，很难研磨，多糖和多酚类物质也较多；古铜期的叶片尚未成熟，易于研磨，但叶片水分含量较大；变色期的叶片虽接近成熟，但其叶片质地柔软，易于研磨，多糖和多酚类物质并没有明显增多。本统计结果来自大量提取和小量提取，400μg·g-1(FW)和50μg·g-1(FW)分别是大量提取和小量提取的统计数据。由于样品在直径为6cm的陶瓷研钵中研磨，样品容易粘在研钵壁上，很难转移干净，使有效样品的量降低，而小量提取中样品量远小于大量提取，同样的样品损失量对小量提取的影响就要大过大量提取，故此统计结果会相差8倍。
采用本方法从不同生长时期橡胶树叶中提取的DNA均为白色沉淀。图1中a为从橡胶树品种RRIM600不同生长时期(古铜期、变色期、稳定期)叶片中所提的总DNA，3个泳道DNA均无降解，质量较高(表1)。以此DNA为模本进行ISSR反应表明，所提的DNA很容易产生清晰的PCR扩增带(图1中b)。
表1 RRIM 600总DNA的质量分析表
取样时期 OD<sub>260</sub>/OD<sub>280</sub> OD<sub>260</sub>/OD<sub>230</sub> 产量/μg·g<sup>-1</sup>(FW) 沉淀颜色
古铜期 2.0 2.0 217 白色
变色期 1.9 2.1 390 白色
稳定期 2.0 2.6 196 白色
本发明不局限于上述实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围之内。本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

Claims (10)

1.一种提取橡胶树叶片总DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
取橡胶树叶片，放在液氮中研成粉末后转入离心管中，在离心管中加入预冷的提取缓冲液，低温离心；
弃去上清液，沉淀中加入55～75℃预热的裂解液，于55～75℃水浴中保温；
加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇混合液，于室温下离心；
上清液转至另一新管中，加入异丙醇，于室温下离心；
以乙醇洗沉淀，沉淀风干后，加入TE缓冲液，溶于微量离心管中，加入核糖核酸酶，于室温下保温；
加入等体积的氯仿∶异戊醇混合液，低温离心；
弃去上清液，加入醋酸钠，混匀后加入无水乙醇，翻转混匀，于-15℃～-25℃中静置；
低温离心，用乙醇洗沉淀，沉淀风干后，将沉淀溶于TE缓冲液中，于-15℃～-25℃下保存。
2.如权利要求1所述的一种提取橡胶树叶片总DNA的方法，其特征在于：橡胶树叶片与提取缓冲液比例为1∶5～1∶7。
3.如权利要求1所述的一种提取橡胶树叶片总DNA的方法，其特征在于：所述提取缓冲液为0.45M的葡萄糖、0.1mM的Tris-HCl、5mM的EDTA、2％质量浓度的聚乙烯吡咯烷酮和2％物质浓度的β-巯基乙醇。
4.如权利要求1所述的一种提取橡胶树叶片总DNA的方法，其特征在于：所述裂解液为2％质量浓度的CTAB、2％质量浓度的聚乙烯吡咯烷酮、1.4M的NaCl、20mM的EDTA、0.1M的Tris-HCl和2％物质浓度的巯基乙醇。
5.如权利要求1所述的一种提取橡胶树叶片总DNA的方法，其特征在于：所述TE缓冲液为10mM的Tris-HCl和1mM的EDTA。
6.如权利要求3～5任意一项所述的一种提取橡胶树叶片总DNA的方法，其特征在于：所述Tris-HCl的PH值为7.1～8.0。
7.如权利要求3～5任意一项所述的一种提取橡胶树叶片总DNA的方法，其特征在于：所述EDTA的PH值为7.1～8.0。
8.如权利要求1所述的一种提取橡胶树叶片总DNA的方法，其特征在于：所述酚∶氯仿∶异戊醇混合液中酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1。
9.如权利要求1所述的一种提取橡胶树叶片总DNA的方法，其特征在于：所述氯仿∶异戊醇混合液中氯仿∶异戊醇的体积比为24∶1。
10.如权利要求1所述的一种提取橡胶树叶片总DNA的方法，其特征在于：所述醋酸钠浓度为3mol/L。
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