CN104371999A - 一种棉花叶片dna提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种棉花叶片DNA提取方法，包括在棉花子叶或成株倒叶片中加入预处理缓冲液，研磨后，离心弃上清，加入TPS提取缓冲液90-97摄氏度水浴或金属浴，离心，即得到含有叶片DNA的上清液。本发明DNA提取材料选用棉花出苗之后到打顶之前任何时期的叶片，与其他快速DNA提取方法相比，DNA质量好，适于PCR分析；与现有的棉花叶片DNA提取的CTAB法方法相比，简化了步骤，节省了取样时间和DNA提取时间，时间缩短了80-90%左右，成本降低90%左右。本方法可适用于分子标记辅助育种过程中大量、快速、低成本DNA样品的提取。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种高通量、快速、低成本提取棉花叶片DNA的方法。
背景技术
近年来，随着作物数量性状基因位点定位研究的深入开展，分子标记技术越来越广泛地被科研和育种单位应用于作物标记辅助育种。在作物标记辅助育种程序中，高通量、快速、低成本提取作物单株的DNA一直是科研和育种者的理想目标。在棉花分子标记辅助选择工作中，一般是从棉株叶片中提取DNA样品。与其他植物的DNA提出不同的是，棉花叶片中除富含蛋白外，还含有棉酚、多糖、单宁等次生代谢物，这些代谢物在细胞破裂时容易氧化，氧化后与蛋白质、核酸等发生不可逆反应，形成棕色胶状复合物，影响后续的实验工作。因此棉花叶片DNA提取的步骤较其他作物更为复杂。目前棉花叶片DNA提取方法是CTAB法。这种方法包括田间取样、组织破碎、提取缓冲液预处理、裂解缓冲液裂解细胞、去除蛋白质及RNA等杂质、沉淀DNA、漂洗DNA和溶解等环节。CTAB法提取棉花DNA的程序较为复杂，过程繁琐耗时，从田间取样到提取出DNA，需要3-5小时。一个熟练工每天8小时只能处理50-80个样品，并且消耗较多的试剂和耗材。劳动成本按120～150元/天计算的话，提取每个DNA样品的劳动成本达1.5～3.0元。但CTAB法通过复杂的程序保证了所提取的棉花DNA的质量可以长期保存，并能用于多种分子生物学的实验分析。对于棉花分子标记辅助育种来说，主要使用SSR标记和其他普通PCR标记，需要高通量、快速、低成本地从大量的个体叶片中提取DNA样品。
为了适应标记辅助选择快速提取大量个体DNA的需要，近来在其他作物上出现了各种DNA快速提取方法。其中具有代表性的为TPS法(穆春华，玉米叶片基因组快速提取方法研究。玉米科学，2010，18(3):170－172)：叶片剪成1cm2大小于灭菌的1.5mL离心管中并加入适量液氮，用组织研磨棒磨成粉状，加入900μL TPS缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，pH值8.0；10mmol/LEDTA，pH值8.0；1mol/L KCl)，75℃水浴30min，每隔10min轻轻混匀1次，室温11000r/min离心10min，取上清液约500μL加入预冷的(等体积)无水乙醇，4℃放置20min，待DNA析出，室温11000r/min离心10min，弃上清液，倒置流尽残余液体，加入120μL灭菌蒸馏水，-20℃保存备用。该方法与CTAB法相比，简化了操作步骤，提高了速度。但仍用液氮研磨、乙醇沉淀并采用1.5mL离心管盛装，难以大批量进行。且只适用于含酚类、单宁等物质较少的物种，适合棉花叶片DNA快速提取的方法目前还未见报道。
TPS法在棉花种子DNA提取上已有应用(郎需勇，棉花学报，2014，26(1)：87-94)。具体DNA提取步骤为：使用前配制DNA提取缓冲液(100mmol/LTris-Base，pH8.0；10mmol/LNa2-EDTA，pH 8.0；1mol/L KCl)。①取棉花干种子胚于200μL96孔PCR板中；②向棉花干种子胚中(每孔)加入50μL DNA提取缓冲液，用PCR板硅胶盖封好，再将混合体系置于PCR扩增仪上94℃15～20min；③室温3000r/min离心2min，用12道移液器将上清液吸出去掉，重复步骤②一遍；④向棉花干种子胚中(每孔)加入150μL ddH2O稀释备用。该方法将TPS用于棉花种子DNA的提取，对最终DNA质量难以控制，PCR扩增时对模板DNA的量要求极严格(模板量只能在1.0-1.5μL之间，超出此范围就扩增效果差)，存在稳定性不佳的问题。而且种子一经破坏，就不能用于繁殖，因此在标记辅助选择工作中不能使用。我们将此TPS法用于棉花子叶期对子叶进行取样时，只有部分引物能扩增出部分条带，且效果不稳定。用于成株期叶片DNA提取时，DNA质量较差(见表1-TPS法)，不符合PCR要求，PCR扩增无条带。
另一种改良的TPS法被应用到花生叶片DNA快速提取(王蕾，山东农业科学2014，46(7):11～14)，其步骤如下：①取新鲜幼叶约0.05g，剪为0.1～0.8cm的碎片，放入1.5mL的EP管中，研磨棒研磨。②加入600μL TPS缓冲液，漩涡混匀5s，95℃水浴10min(TPS缓冲液包含100mmol/L Tris-HCl，1mol/L KCl，10mmol/L EDTA)。③12000r/min离心10min，取上清液加入等体积预冷的无水乙醇，上下颠倒混匀，置-20℃冰箱中10min，待析出沉淀，12000r/min离心2min，弃去上清液，将DNA沉淀风干，加入200μL TE溶解DNA。4℃保存或-20℃长期保存。但仍用乙醇沉淀并采用1.5mL离心管盛装，难以大批量进行。我们将次改良的TPS法用于棉花子叶期对子叶进行取样时，只有部分引物能扩增出条带，表现出对引物具有较强的选择性。用于成株期叶片DNA提取时，DNA质量较差(见表1-TPS法研磨)，大多数出现褐色沉淀，不符合PCR要求，PCR扩增无条带。原因是棉花叶片中酚类物质的含量远高于花生叶片。即使是幼嫩的棉花叶片，甚至是子叶，也含有较高的酚类物质，影响了DNA的提取质量。
发明内容
本发明的目的在于解决传统方法中棉花叶片DNA提取过程繁琐、耗时较长、试剂耗材成本较高以及目前各种TPS方法在棉花叶片DNA提取上效果不佳等问题，提供了一种棉花叶片DNA提取方法，该方法快速，简单，成本低，可大批量提取不同时期棉花叶片DNA。
一种棉花叶片DNA提取方法，包括以下步骤：
本发明提供一种棉花叶片DNA提取的方法，包括在棉花叶片中加入预处理缓冲液，研磨后，离心弃上清，加入TPS提取缓冲液90-97摄氏度水浴或金属浴，离心，即得到含有叶片DNA的上清液。
所述的叶片为棉花出苗之后到打顶之前任何时期的叶片；
所述的预处理缓冲液的配方为：5％葡萄糖，0.05M Tris-HCL，0.005M EDTA，2％PVP40，2％β-巯基乙醇。
所述的TPS提取缓冲液配方为：0.1M Tris-HCL，0.01M EDTA，1.2M/L KCL，2％PVP30。
进一步的，若样品为子叶，可直接在样品中加入TPS提取缓冲液，研磨后，90-97摄氏度水浴或金属浴，取上清即可。
以上所述的方案中，优选的，在采样时，用96孔PCR板取棉花子叶或成株倒2-3叶1/4～1/2平方厘米的叶片，用硅胶密封软垫盖好，置于冰盒中。
以上所述的方案中，优选的，预处理时，在每个样品孔中加入60-80μl预处理缓冲液。用带有改装钻头的微型手电钻(市售)研磨叶片至充分破碎。将装有研磨后叶片样品的PCR板在室温下以3000转/分钟的转速离心2-5分钟。
所述的改装钻头的改装方法为：200μl的黄色移液枪头尖端用酒精灯加热熔成直径2-3mm的圆球状，然后套在微型手电钻2-3mm直径的钻头上即可。
以上所述的方案中，优选的，棉花叶片中加入预处理缓冲液，研磨，PCR板离心后，取出PCR板，用多层吸水纸覆盖PCR板，倒掉上清液。向PCR板的样品孔中加入60-80μl TPS提取缓冲液，盖上密封软垫，90-97摄氏度水浴锅中水浴或PCR仪上金属浴15～20分钟。取出PCR板，在室温下以3000转/分钟的转速再次离心2-5分钟，得到含有叶片DNA的上清液。
一种棉花叶片DNA提取方法获得的DNA在棉花分子标记辅助选择中的应用，应用过程如下：
1.取提取的DNA上清液20-30μl，用灭菌的TE缓冲液稀释5-10倍，得到100-300μl DNA工作液，盖上密封软垫，置于4℃备用。
2.将目标DNA用12道微量移液器转到灭菌的干净PCR板中。选取辅助选择用的标记引物，以样品DNA为底物进行PCR扩增。
3.对扩增后的样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
利用一体化的96孔PCR板代替单个离心管，并简化操作步骤，适用于大批量的DNA提取；
本发明DNA提取材料选用棉花出苗之后到打顶之前任何时期的叶片。使用96孔PCR板盛放叶片样品，不需要单独用小管存放每个样品，大大节省了取样时标记取样管的时间。用微型手电钻直接在PCR板孔中对叶片样品进行研磨，研磨过程中不需要转移样品，简化了程序。而且因样品组织量少，微型手电钻方便操作，每个样品只需3-5秒即可研磨完毕。比液氮研磨或其他研磨方式节省了大量时间。叶片研磨过程中，用预处理液对样品进行处理，保证DNA样品的质量。用提取液进行加热处理后，直接得到DNA样品，不需要异丙醇沉淀DNA、苯酚+氯仿+异戊醇除去蛋白质、乙醇洗涤、风干溶解等步骤。本发明方法提取棉花叶片DNA，操作步骤简单，所用时间短。从CTAB法的9-15个步骤简化为3-4个步骤；每个样品的提取时间从CTAB法的3-5个小时缩短到25-30分钟；从CTAB法的每人每天8小时提取50-80个DNA样品提高到每人每天8小时提取600-800个DNA样品。人工成本从原来的1.5-3.0元/样品到0.15-0.25元/样品；试剂耗材成本也从原来的0.3-0.5元/样品下降为0.03-0.05元/样品。本方法与CTAB法相比，时间缩短了80％-90％左右，成本降低90％左右。同时也克服了现有其他DNA快速提取的各种改良TPS法得到DNA质量低的不足，所得DNA样品量可以满足100-300次PCR反应。本发明既简化了操作过程，又降低了操作成本，大大提高了DNA提取速度，可提取不同时期的棉花叶片DNA，能满足分子标记辅助育种过程中大量、快速、低成本提取DNA样品的需要，可促进棉花分子标记辅助育种和相关研究。
通过用含有葡萄糖、PVP和β-巯基乙醇的缓冲液对成株叶片进行预处理，以及在原TPS提取液中添加PVP30，对两种缓冲液的成分进行一些调整之后，提高了提取DNA的质量，保证了该方法在棉花叶片DNA提取上效果的稳定性。该方法直接得到DNA溶液，省去了蛋白抽提、DNA沉淀、洗涤、风干、溶解等一系列步骤，提供一种高通量、快速、低成本地提取棉花叶片DNA的方法，可满足棉花分子标记辅助育种工作中大量样本DNA高通量、快速、低成本提取的需要。
附图说明
图1为利用SSR引物BNL3535，组合DES-HAF16×鲁棉研28的F2群体单株成株期叶片预处理后提取DNA进行PCR扩增检测结果。
图2为利用SSR引物BNL3535扩增鲁棉研28单株检测结果。
1-12泳道：子叶预处理后提取DNA；13-24泳道：成株期叶片预处理后提取DNA；25-36泳道：子叶未预处理提取DNA。
图3为利用Cry1Ac基因引物扩增鲁棉研28单株检测结果。
1-12泳道：子叶预处理后提取DNA；13-24泳道：成株期叶片预处理后提取DNA；25-36泳道：子叶未预处理提取DNA。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的生化试剂均为市售。
以转Bt基因抗虫棉花品种鲁棉研28、哈克尼西棉胞质雄性不育系的恢复系DES-HAF16及组合DES-HAF16×鲁棉研28的F2群体单株为实验材料，通过具体实例对本发明做进一步的描述。具体实例统一采用10μl PCR扩增体系。取1.0μl PCR扩增后产物，用浓度为9％的非变性PAGE(聚丙烯酰胺凝胶)电泳检测。具体组分及程序如下：
PCR扩增反应体系：10×PCR Buffer 1.0μl(含Mg2+)，10mM dNTP Mix 0.2μl，SSR正、反向引物(5μmol/L)各1.0μl，5U申能博彩DNA聚合酶0.1μl，待测样品DNA 1.0μl(含50-200ng DNA)，灭菌去离子水5.7μl。
PCR反应程序：95℃预变性5分钟；94℃变性45s，53或57℃退火45s，72℃延伸60s，循环35次；72℃延伸5分钟；4℃保存。
本发明实施例用到的SSR引物或基因扩增引物序列如下：
育性恢复基因连锁标记BNL3535：
正向引物序列：CTGGGATACATACCGTGGCT
反向引物序列：ACTTTGCTGAATAAAGGTGAGTG
Bt基因Cry1Ac引物:
正向引物序列：GTTCCAGCTACAGCTACCTCC
反向引物序列：CCACTAAAGTTTCTAACACCCAC
本发明实施例使用的微型手电钻为带有改装钻头的微型手电钻。
所述的改装钻头的改装方法为：200μl的黄色移液枪头尖端用酒精灯加热熔成直径2-3mm的圆球状，然后套在微型手电钻2-3mm直径的钻头上即可。
本发明方法提取的DNA用于SSR标记辅助棉花育种的效果。
实施例1：
一种棉花叶片DNA提取方法，包括以下步骤：
棉花子叶DNA提取
将待检测单株挂牌编号后，用96孔PCR板进行取样。1/4-1/2平方厘米子叶，按顺序放入96孔PCR板中，取完后用硅胶密封软垫盖严，置于冰盒中存放。
向PCR板孔中加入70μlTPS提取缓冲液，用微型手电钻研磨子叶至充分破碎，盖上硅胶密封软垫，95℃水浴20分钟，然后以3000转/分钟的速度离心盛有样品的PCR板2分钟。取20μl上清液，加入180μl灭菌TE缓冲液，用枪头上下吸打使DNA溶液混匀，即得到可以直接使用的DNA样品。
所述的TPS提取缓冲液配方为：0.1M Tris-HCL，0.01M EDTA，1.2M/L KCL，2％PVP30。将提取的DNA用于棉花分子标记辅助选择，具体如下：
PCR扩增
选用SSR引物BNL3535，取1.0μl上述DNA样品进行PCR扩增(PCR反应程序：95℃预变性5分钟；94℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸60s，循环35次；72℃延伸5分钟；4℃保存)，用9％浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物。
选用抗虫基因Cry1Ac引物，取1.0μl上述DNA样品进行PCR扩增(PCR反应程序：95℃预变性5分钟；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸60s，循环35次；72℃延伸5分钟；4℃保存)，用9％浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物。
(3)结果检测
通过微量分光光度计(NANO100)检测，DNA在260nm和280nm处的吸收值比例为1.72，浓度为285.4ng/uL。由图2、3可知，子叶简化方法提取DNA的PCR扩增产物样品的目标带清晰(图3)。
实施例2：
一种棉花叶片DNA提取方法，包括以下步骤：
(1)子叶预处理后DNA提取
将待检测单株挂牌编号后，用96孔PCR板进行取样。取1/4-1/2平方厘米的子叶，按顺序放入96孔PCR板中，取完后用硅胶密封软垫盖严，置于冰盒中存放。
向PCR板孔中加入70μl预处理缓冲液，用微型手电钻研磨子叶至充分破碎。盖上硅胶密封软垫，以3000转/分钟的速度离心盛有样品的PCR板2分钟。取出PCR板，揭掉密封软垫，用多层吸水纸覆盖PCR板，倒置PCR板，让吸水纸吸收上清液。向PCR板孔中加入70μlTPS提取缓冲液，盖上硅胶密封软垫，95℃水浴或金属浴20分钟，然后以3000转/分钟的速度离心盛有样品的PCR板2分钟。取20μl上清液，加入180μl灭菌TE，上下吸打使DNA溶液混匀，即得到可以直接使用的DNA样品。
所述的预处理缓冲液的配方为：5％葡萄糖，0.05M Tris-HCL，0.005M EDTA，2％PVP40，2％β-巯基乙醇。
所述的TPS提取缓冲液配方为：0.1M Tris-HCL，0.01M EDTA，1.2M/L KCL，2％PVP30。
(2)PCR扩增
选用SSR引物BNL3535，取1.0μl上述DNA样品进行PCR扩增(PCR反应程序：95℃预变性5分钟；94℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸60s，循环35次；72℃延伸5分钟；4℃保存)，用9％浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物。
选用抗虫基因Cry1Ac引物，取1.0μl上述DNA样品进行PCR扩增(PCR反应程序：95℃预变性5分钟；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸45s，循环35次；72℃延伸5分钟；4℃保存)，用9％浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物。
(3)结果检测
通过微量分光光度计(NANO100)检测，DNA在260nm和280nm处的吸收值比例为1.87，浓度为253.3ng/uL。图2、图3可知，子叶预处理后提取DNA的PCR扩增产物目标条带清晰。
实施例3：
一种棉花叶片DNA提取方法，包括以下步骤：
(1)成株期叶片预处理后DNA提取
将田间待检测单株挂牌编号后，用96孔PCR板进行田间取样。取打顶前的棉花植株倒2-倒3叶1/4平方厘米的叶片，按顺序放入96孔PCR板中，取完后用硅胶密封软垫盖严，置于冰盒中存放。
向PCR板孔中加入70μl预处理缓冲液，用微型手电钻研磨叶片至充分破碎，盖上硅胶密封软垫，以3000转/分钟的速度离心盛有样品的PCR板2分钟。取出PCR板，揭掉密封软垫，用多层吸水纸覆盖PCR板，倒置PCR板，让吸水纸吸收上清液。向PCR板孔中加入70μl提TPS提取缓冲液，盖上硅胶密封软垫，95℃水浴或金属浴20分钟，然后以3000转/分钟的速度离心盛有样品的PCR板2分钟。取20μl上清液，加入180μl灭菌TE，上下吸打使DNA溶液混匀，即得到可以直接使用的DNA样品。
所述的预处理缓冲液的配方为：5％葡萄糖，0.05M Tris-HCL，0.005M EDTA，2％PVP40，2％β-巯基乙醇。
所述的TPS提取缓冲液配方为：0.1M Tris-HCL，0.01M EDTA，1.2M/L KCL，2％PVP30。
(2)PCR扩增
选用SSR引物BNL3535，取1.0μl上述DNA样品进行PCR扩增(PCR反应程序：95℃预变性5分钟；94℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸60s，循环35次；72℃延伸5分钟；4℃保存)，用9％浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物。
选用抗虫基因Cry1Ac引物，取1.0μl上述DNA样品进行PCR扩增(PCR反应程序：95℃预变性5分钟；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸45s，循环35次；72℃延伸5分钟；4℃保存)，用9％浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物。
(3)结果检测
通过微量分光光度计(NANO100)检测，DNA在260nm和280nm处的吸收值比例为1.92，浓度为201.2ng/uL。由图1、图2、图3可知，成株叶片预处理后提取的DNA样品经PCR扩增后，目标带清晰。
实施例4：
本发明方法与常规提取方法比较
将以上郎需勇提出了TPS法、王蕾提出的改良TPS法、本发明方法以及目前广为使用的CTAB法用于棉花叶片DNA提取，具体程序同前面所述。将4种方法提取的DNA进行质量、浓度、耗时和成本等进行了比较，结果见表1。从表1中可以看出，用TPS法(郎需勇，棉花学报，2014，26(1)：87-94)和改良TPS法(王蕾，山东农业科学2014，46(7):11～14)提取棉花叶片DNA的260/280吸收值在1.4-1.6之间，蛋白质含量较高，不适合后续PCR分析。本方法提取的DNA样品的260/280吸收值在1.8-2.0之间，与CTAB法提取的样品吸收值接近，样品中的蛋白质杂质较少，符合PCR扩增要求。TPS法因缺少研磨环节，DNA浓度较低。改良TPS法和本发明方法因为组织充分破碎，样品DNA含量较高。CTAB法因为有风干再溶解环节，DNA含量最高。从样品提取所用时间来看，本发明与TPS法相同，远低于改良TPS法和CTAB法。试剂耗材成本的比较结果与所用时间的比较结果相同。
表1.不同方法提取的DNA样品质量与浓度的比较
Claims (5)
1.一种棉花叶片DNA提取的方法，包括在棉花叶片中加入预处理缓冲液，研磨后，离心弃上清，加入TPS提取缓冲液90-97摄氏度水浴或金属浴，离心，即得到含有叶片DNA的上清液；
所述的叶片为棉花出苗之后到打顶之前任何时期的叶片；
所述的预处理缓冲液的配方为：5%葡萄糖，0.05 M Tris-HCL，0.005 M EDTA，2% PVP40，2% β-巯基乙醇；
所述的TPS提取缓冲液配方为：0.1 M Tris-HCL，0.01 M EDTA，1.2M/L KCL，2% PVP30。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：样品为子叶时，直接在样品中加入TPS提取缓冲液，研磨后，90-97摄氏度水浴或金属浴，取上清即可。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在采样时，用96孔PCR板取棉花子叶或成株倒2-3叶1/4～1/2平方厘米的叶片，用硅胶密封软垫盖好，置于冰盒中。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：预处理时，在每个样品孔中加入60-80μl预处理缓冲液，用带有改装钻头的微型手电钻研磨叶片至充分破碎，将装有研磨后叶片样品的PCR板在室温下以3000转/分钟的转速离心2-5分钟；
所述的改装钻头的改装方法为：200μl的黄色移液枪头尖端用酒精灯加热熔成直径2-3mm的圆球状，然后套在微型手电钻2-3mm直径的钻头上即可。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：样品中加入预处理缓冲液，研磨，PCR板离心后，取出PCR板，用多层吸水纸覆盖PCR板，倒掉上清液；向PCR板的样品孔中加入60-80μl TPS提取缓冲液，盖上密封软垫，90-97摄氏度水浴锅中水浴或PCR仪上金属浴15～20分钟；取出PCR板，在室温下以3000转/分钟的转速再次离心2-5分钟，得到含有叶片DNA的上清液。
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