CN110452905B - 一种提高烟草dna沉淀效率的提取方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种提高烟草DNA沉淀效率的提取方法及其应用，包括前处理和提取，前处理是将待检烟草材料进行浸泡、烘干、取样和研磨得到前处理材料a；提取是在前处理材料a中加入前处理材料体积2～3倍的TPS提取缓冲液，于温度70～80℃下静置30～50min，然后离心得到上清液b，加入上清液b等体积的异丙醇，混匀，离心去除上清液得到沉淀c，沉淀c中加入乙醇溶液震荡，然后离心去除乙醇，风干底部的沉淀得到沉淀d，沉淀d加溶剂溶解，得到DNA提取样本。本发明形成了一套稳定、完整、可行、提取难度低、提取的DNA质量高且对环境友好的DNA提取方法，可应用于卷烟材料、烤后烟叶和烟草鲜叶DNA提取工艺中。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种提高烟草DNA沉淀效率的提取方法。
背景技术
烟草是重要的经济作物，烟草中含生物碱约1％～9％及芸香苷、有机酸、脂肪、树脂、蛋白质、糖、香料等物质。在化工、农药和医药等领域有十分广泛的用途。烟草具有很强的生理活性，我国传统医药有许多利用烟草治病的记载。烟草栽培种植可以取得较好的经济收益，但由于利益驱动，目前市场上存在大量的假烟，里面可能掺杂着其它的植物材料，极大地损害了消费者的权益，甚至危害身体健康，同时还存在非法售卖私烟的行为，这些行为是违法的，但需要一种有效的方法检测查获的制品里面是否含有烟草成份，一旦含有烟草成份，则说明该制品违反了烟草专卖相关法规。卷烟是一种深加工食品，而加工程度越深，DNA的提取难度就越大。成品卷烟烟丝已经不能提取得到完整的基因组DNA。因为成品烟丝与新鲜烟叶的不同在于其经过初烤、复烤、切丝、烘丝等工序中的高温、高压、高湿、机械加工剪切以及加香加料后制成烟丝，不但增加了DNA提取过程中的污染物，还使基因组DNA严重降解，成为小于1000bp的小片段。由于烟草植物中次生代谢产物多酚类化合物可介导DNA降解，而多糖的污染也是影响烟草DNA纯度最常见的问题。因此，研究一种简单、快速的从卷烟中提取DNA的方法对以上研究至关重要。朱生伟等利用改良后SDS法提取得到新鲜烟叶中可用烟草育种，较纯净、高产率、大分子量的基因组DNA。寇姝燕等通过对比研究表明二次选择法得到的高分子量DNA总量更高，同时二次选择法得到的纯度更高，可以用于制备烟草BAC文库。任如意等以改良CTAB法提取复烤烟叶DNA，经U-3000紫外分光光度计测定，所获DNA呈典型的吸收曲线，且0D260/0D280在1.7～1.9之间；对烟草叶绿体不编码序列进行PCR扩增，获得理想条带。国际烟草科学研究中心介绍了提取新鲜烟叶基因组DNA的碱裂解法、改良后的CTAB法和酚/氯仿抽提法。目前对新鲜烟叶DNA的提取主要是CTAB法提取DNA，但是CTAB法需要采用氯仿及苯酚进行抽提以除去DNA中混杂的蛋白。但是氯仿对中枢神经系统具有麻醉作用，对心、肝、肾有损害，另外氯仿对环境有危害，对水体可造成污染。苯酚对皮肤、粘膜有强烈的腐蚀作用，可抑制中枢神经或损害肝、肾功能，还会引起急性中毒(吸入高浓度蒸气可致头痛、头晕、乏力、视物模糊、肺水肿等)。苯酚对环境有严重危害，对水体和大气可造成污染。因此传统的CATB法提取DNA对操作人员及环境具有危害。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术存在的问题，提供一种简单、快速且环境友好的可提高卷烟中DNA沉淀效率、以从卷烟中提取DNA的方法。本发明还提供所述的提高烟草DNA沉淀效率的提取方法的应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种提高烟草DNA沉淀效率的提取方法，包括前处理和提取步骤，具体包括：
A、前处理：将待检烟草材料进行浸泡、烘干、取样和研磨得到前处理材料a；
B、提取：在前处理材料a中加入前处理材料体积2～3倍的TPS提取缓冲液，于温度70～80℃下静置30～50min，然后离心得到上清液b，加入上清液b等体积的异丙醇，混匀，离心去除上清液得到沉淀c，沉淀c中加入体积百分浓度70～80％的乙醇溶液，震荡2～3min，然后离心去除乙醇，风干底部的沉淀得到沉淀d，沉淀d加溶剂溶解，得到DNA提取样本。
本发明方法所述的浸泡是将待检烟草材料于体积百分浓度60～80％的乙醇溶液中暗处浸泡8～12h。所述的烘干是将浸泡好的待检烟草材料于温度30～40℃下烘干至含水率为20～40％。所述的取样是从经浸泡和烘干制备的待检烟草材料上取待检烟草材料0.1g-0.3g。所述的研磨是将待检烟草材料研磨至粒度为100～200目。
本发明所述的TPS提取缓冲液配方如下：pH 8.0的1M Tris-HCl 90～110mL、pH8.0的0.5M EDTA 10～30mL、KCl 74～75g。
所述的提取缓冲液中还加入提取缓冲液体积0.5～1.5％的β巯基乙醇，以防止待检烟草材料氧化。所述的离心是在转速11000～13000rpm条件下离心5～10min。所述的溶剂为水或者TE溶液。
本发明所述的提高烟草DNA沉淀效率的提取方法的应用，是在卷烟材料、烤后烟叶和烟草鲜叶DNA提取工艺中应用所述的提高烟草DNA沉淀效率的提取方法。
本发明针对现有DNA提取方法的不足进行改良，提高DNA的沉淀效率，降低DNA提取难度，同时解决了传统DNA提取过程中需要酚、氯仿等易对环境产生危害的有机溶剂问题，形成了一套稳定、完整、可行、提取难度低、提取的DNA质量高且对环境友好的DNA提取方法。
附图说明
图1为本发明实施例1和实施例2电泳检测对比示意图；
图2为本发明实施例1和实施例2提取的DNA进行扩增后产物电泳检测对比示意图；
图3为本发明实施例4和实施例5电泳检测对比示意图；
图4为本发明实施例4和实施例5提取的DNA进行扩增后产物电泳检测对比示意图；
图5为本发明实施例7和实施例8电泳检测对比示意图；
图6为本发明实施例7和实施例8提取的DNA进行扩增后产物电泳检测对比示意图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的提高烟草DNA沉淀效率的提取方法，包括前处理和提取步骤，具体包括：
A、前处理：将待检烟草材料进行浸泡、烘干、取样和研磨得到前处理材料a。
所述的浸泡是将待检烟草材料于体积百分浓度60～80％的乙醇溶液中暗处浸泡8～12h。因为香烟中含有大量的香精香料，香精香料过多会影响DNA提取的质量，同时烟草烤后也含有大量的次生代谢物质，这些次生代谢物质也会影响烟草的质量。而这些香精香料，次生代谢物质能够溶于乙醇溶液，通过提前浸泡在乙醇溶液中，可以尽可能的去处这些物质对DNA质量的干扰。
所述的烘干是将浸泡好的待检烟草材料于温度30～40℃下烘干至含水率为20～40％。所述的取样是从经浸泡和烘干制备的待检烟草材料上取待检烟草材料0.1g-0.3g。所述的研磨是将待检烟草材料研磨至粒度为100～200目。
B、提取：在前处理材料a中加入前处理材料体积2～3倍的TPS提取缓冲液，于温度70～80℃下静置30～50min，然后离心得到上清液b，加入上清液b等体积的异丙醇，混匀，离心去除上清液得到沉淀c，沉淀c中加入体积百分浓度70～80％的乙醇溶液，震荡2～3min，然后离心去除乙醇，风干底部的沉淀得到沉淀d，沉淀d加溶剂溶解，得到DNA提取样本。
所述的TPS提取缓冲液配方如下：pH 8.0的1M Tris-HCl 90～110mL、pH 8.0的0.5M EDTA 10～30mL、KCl 74～75g。所述的提取缓冲液中还加入提取缓冲液体积0.5～1.5％的β巯基乙醇，以防止待检烟草材料氧化。
所述的离心是在转速11000～13000rpm条件下离心5～10min，通过高速离心可以尽可能的将DNA沉淀出来。
所述的溶剂为水或者TE溶液。
本发明所述的提高烟草DNA沉淀效率的提取方法的应用，是在卷烟材料、烤后烟叶和烟草鲜叶DNA提取工艺中应用所述的提高烟草DNA沉淀效率的提取方法。
下面通过具体实施例及与现有技术的对照对本发明做进一步的阐述。
实施例1
选取上海某品牌卷烟、湖南某品牌香烟、云南某品牌香烟制品为材料并分别进行DNA提取，每种材料的DNA提取步骤如下：
1、将卷烟材料在体积百分浓度70％的乙醇中浸泡过夜；
2、将浸泡好的卷烟材料在37℃的烘箱中烘干，至含水率在25％左右；
3、取少量卷烟材料(0.2g即可，太大材料效果反而不好)，用研磨器研磨(45Hz，90S)，或者用研磨棒将卷烟材料研磨碎至约150目；
4、在1.5ml EP管中加入400ul的TPS，如果材料易氧化，在TPS中先加入TPS体积1％的β巯基乙醇；75℃下放置40min；
所述TPS提取缓冲液由下述组分构成：
5、12000rpm离心5-10min，取上清液(注意不要吸到沉淀)；
6、在上清液中加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，12000rpm离心5min，倒掉上清液(注意不要将底部的沉淀倒掉)；
7、向沉淀中加入体积百分比浓度75％的乙醇500ul，颠倒两次，12000rpm离心5-10min，倒掉乙醇，风干底部的沉淀；
8、向沉淀中加入50-80ul水，溶解DNA，得到DNA提取样本，即可进行检测。
对照方法：
同样选取上海某品牌卷烟、湖南某品牌香烟、云南某品牌香烟制品为材料并分别采用经典的CTAB提取每种材料烟丝的DNA，提取步骤如下：
1、水浴加热CTAB提取缓冲液至60℃～65℃；
2、取烟丝0.2g，液氮研磨成粉末；
3、加入600μl的CTAB提取液研磨成匀浆；
4、将匀浆液转入1.5ml Eppendorf管；
5、60℃～65℃水浴一个小时；
6、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(酚/氯仿/异戊醇：25：24：1)，颠倒混合；
7、常温下12,000～13,000rpm离心15min；
8、用枪小心将上清液转移到新离心管中，注意不要吸动中间的蛋白质层；
9、将上清液在新离心管中12,000～13,000rpm离心10min，再将上清液转移到新管中，仍旧要注意不要触动中间的蛋白质层；
10、向新管的上清液中加入0.6倍至等体积异丙醇，彻底颠倒混匀，使DNA从溶液中析出，形成絮状沉淀；
11、用玻璃棒或枪头挑出DNA沉淀，放到已经加入70％酒精的1.5ml Eppendorf管中，颠倒管子几次，以洗涤DNA，溶解其中含有的色素等物质；
12、离心，倒出管中的酒精，并用枪将剩余的液体尽量吸净，经真空浓缩仪干燥之后，向管中加入适量TE缓冲液溶解DNA，得到DNA提取样本；
将本对照方法提取的DNA与实施例1提取获得的DNA进行电泳检测，见图1，可以看出采用两种方法进行DNA提取均获得不到主带。但均能够获得弥撒条带，说明卷烟烟丝在加工过程中DNA已经降解。
以实施例1和对照方法中提取到的云南某品牌的烟草制品的DNA为模板以特异引物为模板进行扩增以便检验提取到的DNA的质量，采用的引物为：
Rubisco引物：
F：5’-CTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGAC-3’
R：5’-AGACATTCATAAACAGCTCTACCGTAG-3’
PCR扩增体系为：
将获得的PCR产物进行电泳检测，电泳结果表明(见图2)，无论采取TPS法还是CTAB法都能够获得较好的PCR扩增条带，说明两种方法提取出的DNA都能够进行小片段的PCR扩增。这两种方法提取的DNA质量都可以用于PCR扩增。
由实施例1和对照方法相比，即本发明的提取方法与传统的DNA提取法相比，将DNA沉淀缓冲液体积增大，这样可以提高DNA的沉淀效率，降低DNA提取难度。本发明与CTAB法提取烟丝DNA相比，具有操作步骤简单，DNA质量高的优点，同时最主要的是实验操作过程中不采用酚及氯仿，具有环保和操作安全的特性。
实施例2
以国内主栽烟草品种云烟87，K326及红花大金元经过烤房烘烤过的烟草叶片为试验材料，进行DNA提取，提取步骤如下：。
1、将烟草叶片在体积百分浓度80％的乙醇中浸泡10～12小时；
2、将浸泡好的烟草叶片在30℃的烘箱中烘干，至含水率约40％；
3、取少量植物叶片材料(1cm×1cm大小即可，大约0.1g，太大材料效果反而不好)，用研磨器研磨，或者用研磨棒将卷烟材料研磨碎至约200目；
4、在1.5ml EP管中加入450ul的TPS缓冲液(如材料易氧化，在TPS中先加入1.5％的β巯基乙醇)；80℃放置50min；
TPS提取缓冲液由下述组分构成：
5、12000rpm离心5-10min，取上清液(注意不要吸到沉淀)；
6、向上清液中加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，12000rpm离心5min；
7、倒掉上清液(注意不要将底部的沉淀倒掉)，加入体积浓度70％乙醇500ul，震荡2～3min，12000rpm离心5-10min，倒掉乙醇，风干底部的沉淀；
8、向沉淀中加入50-100ul水，溶解DNA，得到DNA提取样本。
对照方法：
同样以国内主栽烟草品种云烟87，K326及红花大金元经过烤房烘烤过的烟草叶片为试验材料，采用经典的CTAB提取烤后烟叶的DNA步骤如下：
1、水浴加热CTAB提取缓冲液至60℃～65℃；
2、取烤后烟叶或叶片200mg，液氮研磨成粉末；
3、加入600μl的CTAB提取液研磨成匀浆；
4、将匀浆液转入1.5ml Eppendorf管；
5、60℃～65℃水浴一个小时；
6、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(酚/氯仿/异戊醇：25：24：1)，颠倒混合；
7、常温下12,000～13,000rpm离心15min；
8、用枪小心将上清液转移到新离心管中，注意不要吸动中间的蛋白质层；
9、将新离心管中的上清液12,000～13,000rpm离心10min，将上清液转移到新管中，仍旧要注意不要触动中间的蛋白质层；
10、向新管的上清液中加入0.6倍至等体积异丙醇，彻底颠倒混匀，使DNA从溶液中析出，形成絮状沉淀；
11、用玻璃棒或枪头挑出DNA沉淀，放到已经加入70％酒精的1.5ml Eppendorf管中，颠倒管子几次，以洗涤DNA，溶解其中含有的色素等物质；
12、离心，倒出管中的酒精，并用枪将剩余的液体尽量吸净，真空浓缩仪干燥之后，向管中加入适量TE缓冲液溶解DNA，得到DNA提取样本；
将本对照方法提取的DNA与实施例2提取获得的DNA进行电泳检测，见图3，可以看出采用TPS法获得的DNA具有明显的主带，而采用CTAB法提取的DNA主带不是很明显，主要以弥散条带为主。
以实施例2和对照方法中提取到的烤后烟叶DNA为模板以特异引物进行扩增检验提取到的DNA的质量，采用的引物为：
Rubisco引物：
F：5’-CTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGAC-3’
R：5’-AGACATTCATAAACAGCTCTACCGTAG-3’
PCR扩增体系为：
将获得的PCR产物进行电泳检测，电泳结果表明(见图4)，无论采取TPS法还是CTAB法都能够获得较好的PCR扩增条带，说明两种方法提取出的DNA都能够进行小片段的PCR扩增。
由实施例2和对照方法相比，即本发明的提取方法与传统的DNA提取法相比，将DNA沉淀缓冲液体积增大，这样可以提高DNA的沉淀效率，降低DNA提取难度。本发明与CTAB法提取烤后烟叶DNA相比，具有操作步骤简单，DNA质量高的优点，同时最主要的是实验操作过程中不采用酚及氯仿，具有环保和操作安全的特性。
实施例3
以国内烟草主栽品种云烟87的新鲜烟叶为实验材料，新鲜烟叶的DNA提取方法包括以下步骤:
1、将新鲜烟叶在体积百分浓度60％的乙醇中浸泡8～10小时；
2、将浸泡好的新鲜烟叶在40℃的烘箱中烘干，至含水率约22％；
3、取少量新鲜烟叶材料(0.3即可，太大材料效果反而不好)，用研磨器研磨，或者用研磨棒将卷烟材料研磨碎至约100目；
4、在1.5ml EP管中加入300ul的TPS缓冲液(如材料易氧化，在TPS中先加入0.5％的β巯基乙醇)；70℃放置30min；
所述TPS提取缓冲液由下述组分构成：
5、12000rpm离心5-10min，取上清液(注意不要洗到沉淀)；
6、在上清液中加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，12000rpm离心5min；
7、倒掉上清液(注意不要将底部的沉淀倒掉)，加入体积浓度80％乙醇500ul，震荡2～3min，12000rpm离心5-10min，倒掉乙醇，风干底部的沉淀；
8、向沉淀中加入50ul TE溶液，溶解DNA，得到DNA提取样本。
对照方法：
同样以国内烟草主栽品种云烟87的新鲜烟叶为实验材料，采用经典的CTAB提取新鲜烟叶的DNA，步骤如下：
1、水浴加热CTAB提取缓冲液至60℃～65℃；
2、取愈伤组织或叶片200mg，液氮研磨成粉末；
3、加入600μl的CTAB提取液研磨成匀浆；
4、将匀浆液转入1.5ml Eppendorf管；
5、60℃～65℃水浴一个小时；
6、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(酚/氯仿/异戊醇：25：24：1)，颠倒混合；
7、常温下12,000～13,000rpm离心15min；
8、用枪小心将上清液转移到新离心管中，注意不要吸动中间的蛋白质层；
9、将新离心管中的上清液12,000～13,000rpm离心10min，将离心后的上清液转移到新管中，仍旧要注意不要触动中间的蛋白质层；
10、向新管的上清液中加入0.6倍至等体积异丙醇，彻底颠倒混匀，使DNA从溶液中析出，形成絮状沉淀；
11、用玻璃棒或枪头挑出DNA沉淀，放到已经加入70％酒精的1.5ml Eppendorf管中，颠倒管子几次，以洗涤DNA，溶解其中含有的色素等物质；
12、离心，倒出管中的酒精，并用枪将剩余的液体尽量吸净，真空浓缩仪干燥之后，向管中加入适量TE缓冲液溶解DNA，得到DNA提取样本；
将本对照方法提取的DNA与实施例3提取获得的DNA进行电泳检测(见图5)，可以看出采用TPS法及CTAB法均获得的DNA具有明显的主带。
以实施例3及对照方法中提取到的新鲜烟叶DNA为模板以特异引物进行扩增检验提取到的DNA质量，采用的引物为：
Rubisco引物：
F：5’-CTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGAC-3’
R：5’-AGACATTCATAAACAGCTCTACCGTAG-3’
PCR扩增体系为：
将获得的PCR产物进行电泳检测，电泳结果表明(见图6)，无论采取TPS法还是CTAB法都能够获得较好的PCR扩增条带，说明两种方法提取出的DNA都能够进行小片段的PCR扩增。
由实施例3和对照方法相比，即本发明的提取方法与传统的DNA提取法相比，将DNA沉淀缓冲液体积增大，这样可以提高DNA的沉淀效率，降低DNA提取难度。本发明与CTAB法提取烤后烟叶DNA相比，具有实验操作过程中不采用酚及氯仿，具有环保和操作安全的特性。
Claims (2)
1.一种提高烟草DNA沉淀效率的提取方法，其特征在于，包括前处理和提取步骤，具体包括：
A、前处理：将待检烟草材料进行浸泡、烘干、取样和研磨得到前处理材料a；所述待检烟草材料为烤后烟叶；
B、提取：在前处理材料a中加入前处理材料体积2～3倍的TPS提取缓冲液，将DNA沉淀缓冲液体积增大，于温度70～80℃下静置30～50min，然后离心得到上清液b，加入上清液b等体积的异丙醇，混匀，离心去除上清液得到沉淀c，沉淀c中加入体积百分浓度70～80％的乙醇溶液，震荡2～3min，将DNA沉淀缓冲液体积增大，然后离心去除乙醇，风干底部的沉淀得到沉淀d，沉淀d加溶剂溶解，得到DNA提取样本；
所述的浸泡是将待检烟草材料于体积百分浓度60～80％的乙醇溶液中暗处浸泡8～12h；
所述的烘干是将浸泡好的待检烟草材料于温度30～40℃下烘干至含水率为20～40％；
所述的取样是从经浸泡和烘干制备的待检烟草材料上取待检烟草材料0.1g-0.3g；
所述的研磨是将待检烟草材料研磨至粒度为100～200目；
所述的TPS提取缓冲液配方如下：pH8.0的1MTris-HCl90～110mL、pH8.0的0.5MEDTA10～30mL、KCl74～75g；
所述的提取缓冲液中还加入提取缓冲液体积0.5～1.5％的β巯基乙醇，以防止待检烟草材料氧化；
所述的离心是在转速11000～13000rpm条件下离心5～10min。
2.根据权利要求1所述的一种提高烟草DNA沉淀效率的提取方法，其特征在于，所述的溶剂为水或者TE溶液。
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