CN101935695B

CN101935695B - 检测水稻植株早衰的分子标记方法

Info

Publication number: CN101935695B
Application number: CN2010101341594A
Authority: CN
Inventors: 严雯奕; 张小明; 何祖华; 叶胜海; 金庆生; 董彦君
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences; Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences; Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2010-03-26
Filing date: 2010-03-26
Publication date: 2012-05-09
Anticipated expiration: 2030-03-26
Also published as: CN101935695A

Abstract

本发明涉及水稻品种资源特性的检测技术，尤其涉及一种检测水稻早衰基因的分子标记方法。检测水稻植株早衰的分子标记方法，该方法包括水稻植株DNA提取，将提取的DNA模板和特异性分子标记PCR扩增，对PCR反应产物检测判断水稻植株早衰性状的基因型；所述的特异性分子标记选自以下一条或两条结合使用：I、sg1，上游端如SEQ ID NO：1所示，下游端如SEQ ID NO：2所示；II、sg2，上游端如SEQ ID NO：3所示，下游端如SEQ ID NO：4所示；两者结合使用可检测AA、Aa和aa三种不同的基因型。本发明设计特异性分子标记sg1和sg2，对水稻苗期提取的DNA进行PCR扩增后，根据其PCR产物，检测水稻植株早衰性状的基因型，该方法具有检测准确性高，操作简单，成本低廉的特点。

Description

检测水稻植株早衰的分子标记方法

技术领域

本发明涉及水稻品种资源特性的检测技术，尤其涉及一种检测水稻早衰基因的分子标记方法。

背景技术

叶片衰老，作为叶片发育的最终阶段，被认为是程序性细胞死亡的一种，以依赖年龄的方式进行，由诸多环境因素诱导。受生长发育时期内外因素复杂相互作用的影响，内部因素包括发育阶段和激素水平等，外部因素包括温度、干旱、营养缺失、黑暗、创伤和病原体感染等。一些有关植物生长和发育关键基因的缺失将诱导自发性细胞死亡，并显示出类似于病原菌诱导的细胞死亡的过敏性反应。现有如何检测水稻是否存在早衰基因还未见有公开文献报道过。

发明内容

为了快速有效地检测水稻是否存在早衰基因，本发明的目的在于提供一种检测水稻植株早衰的分子标记方法，该方法具有检测准确性高，操作简单，成本低廉的特点。

为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：

检测水稻植株早衰的分子标记方法，该方法包括水稻植株DNA提取，将提取的DNA模板和特异性分子标记PCR扩增，对PCR反应产物检测判断水稻植株早衰性状的基因型；所述的特异性分子标记选自以下特异性分子标记中的一条或两条结合使用：

I、检测水稻早衰显性基因的特异性分子标记sg1，上游端自5′端至3′端的核苷酸序列为ATGGAGGTAGTTTCTGCG(如SEQ ID NO：1所示)，下游端自5′端至3′端的核苷酸序列为CGTTGGGCTACAGGAAGA(如SEQ ID NO：2所示)；

II、检测水稻早衰隐性基因的特异性分子标记sg2，上游端自5′端至3′端的核苷酸序列为ATAACTGAGAAATAAGGGTC(如SEQ ID NO：3所示)，下游端自5′端至3′端的核苷酸序列为CTGTTTAAGAATCCACGAT(如SEQ ID NO：4所示)；

上述的特异性分子标记sg1检测显性基因A的存在与否，特异性分子标记sg2检测隐性基因a的存在与否，两者结合使用可检测AA、Aa和aa三种不同的基因型。

作为一种水稻植株DNA提取的方法，本发明的水稻植株DNA提取的方法可以如下：

①取4～6cm²的水稻叶片于含有400μlTPS的1.5ml离心管中，用1ml的枪头将叶片稍微捣碎并压到管底，75℃水浴30min；

②水浴后12000rpm，离心10min；

③取400μl上清液于离心管中，加入等体积的异丙醇，12000rpm离心10min；

④弃上清液，取沉淀，加入1ml70％的乙醇洗涤，12000rpm离心5min；

⑤弃上清液，取沉淀，室温干燥10～20min，加入30～50μl1/10TE溶解；

⑥PCR反应时20μl反应体系取1μl，提好的DNA做DNA模板，TPS溶液组成如下：100mMTris-HCl，pH为8.0，10mMEDTA，pH为8.0，1MKCl。

作为优选，上述的PCR扩增反应在PCR扩增仪上进行，其中：

①PCR反应体系20μl如下：

DNA模板1μl，

dNTPs，2mM，2μl，

Buffer，含Mg2+，10×，2μl，

特异性分子标记sg1或特异性分子标记sg2，正向引物，10μM，0.5μl，

特异性分子标记sg1或特异性分子标记sg2，反向引物，10μM，0.5μl，

Taq酶，2U/μl，0.5μl，

H₂O13.5μl；

②PCR反应条件：

(1)特异性分子标记sg1温度反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，共36个循环；最后72℃延伸10min。

(2)特异性分子标记sg2温度反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸90sec，共36个循环；最后72℃延伸10min。

作为优选，上述对PCR反应产物检测判断水稻植株早衰性状的基因型的方法如下：将扩增产物，经溴化乙锭染色后上样在1％琼脂糖凝胶上，电泳，在UVP凝胶成像仪上成像；根据特异性分子标记sg1和sg2有无条带，检测显性基因A和隐性基因a的存在与否。

本发明设计特异性分子标记sg1和sg2，对水稻苗期提取的DNA进行PCR扩增后，根据其PCR产物，检测水稻植株早衰性状的基因型，该方法具有检测准确性高，操作简单，成本低廉的特点。

附图说明

图1为特异性分子标记sg1对“日本晴/浙粳早衰”杂交后有早衰性状分离的群体的PCR扩增结果。

图2为特异性分子标记sg2对“日本晴/浙粳早衰”杂交后有早衰性状分离的群体的PCR扩增结果。

图3为特异性分子标记sg1对“日本晴/浙粳早衰”杂交后没有早衰性状分离的群体的PCR扩增结果。

图4为本发明的特异性分子标记sg2对“日本晴/浙粳早衰”杂交后没有早衰性状分离的群体的PCR扩增结果。图中，M代表标记(Marker)，N代表日本晴(Nipponbare)；S代表浙粳早衰；F₁代表“日本晴/浙粳早衰”的杂种F₁植株；F₂代表“日本晴/浙粳早衰”的杂种F₂植株。

具体实施方式

发明人将浙粳早衰与籼稻品种9311(国家水稻中期库保存号CN20483)和粳稻品种日本晴(国家水稻中期库保存号CN5590)分别配组，构建群体，分析各个株系的基因型。浙粳早衰(已提交保藏)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2010年1月27日，保藏编号CGMCCNo.3597，分类命名：水稻Oryza sativa，性状稳定。

种植上述日本晴与浙粳早衰杂交后的F₂群体，苗期采用特异性分子标记sg1和sg2分别进行水稻植株早衰基因的检测。特异性分子标记sg1的上游端自5′端至3′端的核苷酸序列为ATGGAGGTAGTTTCTGCG，下游端自5′端至3′端的核苷酸序列为CGTTGGGCTACAGGAAGA；特异性分子标记sg2的上游端自5′端至3′端的核苷酸序列为ATAACTGAGAAATAAGGGTC，下游端自5′端至3′端的核苷酸序列为CTGTTTAAGAATCCACGAT。

一、水稻植株DNA提取

1.取4-6cm²的水稻叶片于含有400μl TPS的1.5ml离心管中，用1ml的枪头将叶片稍微捣碎并压到管底，75℃水浴30min。

2.12000rpm，离心10min。

3.取400μl上清液于离心管中，加入等体积的异丙醇，12000rpm离心10min。

4.弃上清液，取沉淀，加入1ml 70％的乙醇洗涤，12000rpm离心5min。

5.弃上清液，取沉淀，室温干燥10-20min，加入30-50μl 1/10TE溶解。

6.PCR反应时20μl反应体系取1μl提好的DNA做模板。

TPS溶液组成：100mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)，1M KCl。

二、PCR扩增

PCR扩增反应在PCR扩增仪上进行。

1.PCR反应体系(20μl)如下：

DNA模板1μl

dNTPs(2mM)2μl

Buffer(含Mg²⁺，10×)2μl

sg1(或sg2)(正向引物，10μM)0.5μl

sg1(或sg2)(反向引物，10μM)0.5μl

Taq酶(鼎国公司，2U/μl)0.5μl

H₂O 13.5μl

2.PCR反应条件：

(1)引物sg1温度反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，共36个循环；最后72℃延伸10min，PCR产物大小298bp。

(2)引物sg2温度反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸90sec，共36个循环；最后72℃延伸10min，PCR产物大小1448bp。

三、PCR反应产物检测

将扩增产物，经溴化乙锭染色后上样在1％琼脂糖凝胶上，电泳，在UVP凝胶成像仪上成像。

从正常表型植株中收获的种子，有两种基因型。一种是显性纯合的正常表型植株(AA基因型)，后代不发生分离，都出现正常表型；另一种是杂合的植株(Aa基因型)，虽然当代表现为正常表型，但后代发生分离，出现正常和早衰两种表型。分别对这两种群体进行检测，标记sg1检测显性基因(A)的存在与否，标记sg2检测隐性基因(a)的存在与否，两者结合使用可检测AA、Aa和aa三种不同的基因型。如图1和2所示，在有分离的群体中，泳道1，4，7，11和12，用sg1检测有条带，说明存在显性基因A；sg2检测无条带，说明不存在隐性基因a，这些植株的基因型为AA。泳道2，5，9，10，13和14，用sg1检测有条带，说明存在显性基因A；sg2检测也有条带，说明存在隐性基因a，这些植株的基因型为Aa。泳道3，6和8，用sg1检测无条带，说明不存在显性基因A；用sg2检测有条带，说明存在隐性基因a，说明这些植株的基因型为aa。如图3和4所示，在没有分离的群体中用sg1检测所有植株均有条带，说明存在显性基因A；sg2检测均无条带，说明不存在隐性基因a，由此推测所有植株的基因型均为AA，与实际相符。这说明，利用分子标记sg1和sg2能够准确检测早衰植株的基因型。

序列表

<110>浙江省农业科学院

<120>检测水稻植株早衰的分子标记方法

<160>4

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

ATGGAGGTAGTTTCTGCG 18

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

CGTTGGGCTACAGGAAGA 18

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

ATAACTGAGAAATAAGGGTC 20

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

CTGTTTAAGAATCCACGAT 19

Claims

1.检测水稻植株早衰的分子标记方法，其特征在于该方法包括水稻植株DNA提取，将提取的DNA模板和特异性分子标记PCR扩增，对PCR反应产物检测判断水稻植株早衰性状的基因型的步骤；所述的特异性分子标记选自以下特异性分子标记中的一条或两条结合使用：

I、检测水稻早衰显性基因的特异性分子标记sg1，上游端自5′端至3′端的核苷酸序列为ATGGAGGTAGTTTCTGCG，下游端自5′端至3′端的核苷酸序列为CGTTGGGCTACAGGAAGA；

II、检测水稻早衰隐性基因的特异性分子标记sg2，上游端自5′端至3′端的核苷酸序列为ATAACTGAGAAATAAGGGTC，下游端自5′端至3′端的核苷酸序列为CTGTTTAAGAATCCACGAT；

2.根据权利要求1所述的检测水稻植株早衰的分子标记方法，其特征在于水稻植株DNA提取的方法如下：

②水浴后12000rpm，离心10min；

⑤弃上清液，取沉淀，室温干燥10～20min，加入30～50μl 1/10TE溶解；

⑥PCR反应时20μl反应体系取1μl提好的DNA做DNA模板，TPS溶液组成如下：100mMTris-HCl，pH为8.0，10mMEDTA，pH为8.0，1MKCl。

3.根据权利要求1所述的检测水稻植株早衰的分子标记方法，其特征在于PCR扩增反应在PCR扩增仪上进行，其中：

①PCR反应体系20μl如下：

DNA模板1μl，

dNTPs，2mM，2μl，

Buffer，含Mg²⁺，10×，2μl，

Taq酶，2U/μl，0.5μl，

H₂O13.5μl；

②PCR反应条件：

(1)特异性分子标记sg1温度反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，共36个循环；最后72℃延伸10min；

4.根据权利要求1所述的检测水稻植株早衰的分子标记方法，其特征在于对PCR反应产物检测判断水稻植株早衰性状的基因型的方法如下：将扩增产物，经溴化乙锭染色后上样在1％琼脂糖凝胶上，电泳，在UVP凝胶成像仪上成像；根据特异性分子标记sg1和sg2有无条带，检测显性基因A和隐性基因a的存在与否。