CN110129339B

CN110129339B - 龙葵曲顶病毒全基因组序列及其检测方法

Info

Publication number: CN110129339B
Application number: CN201910391634.7A
Authority: CN
Inventors: 孙凯; 俞晓平; 叶子弘
Original assignee: China Jiliang University
Current assignee: China Jiliang University
Priority date: 2019-05-10
Filing date: 2019-05-10
Publication date: 2020-11-03
Anticipated expiration: 2039-05-10
Also published as: CN110129339A

Abstract

本发明提供了龙葵曲顶病毒全基因组序列及其检测方法，龙葵曲顶病毒全基因组序列全长2867bp，包含7个ORF，编码V1‑V3、C1‑C4七个蛋白，龙葵曲顶病毒全基因组序列、ORF序列及编码蛋白氨基酸序列如SEQ NO：1‑NO：15所示；根据龙葵曲顶病毒全基因组序列设计了两对检测引物，用于检测植物龙葵曲顶病毒；本发明鉴定了引起龙葵曲顶症状的病毒病原为一种新的双生病毒，并获取了该病毒的全基因组序列，ORF序列及编码氨基酸序列，另外设计了两对特异性强、稳定可靠的检测引物，能够高效可靠检测该病毒，为龙葵曲顶病毒的研究及病害防治打下基础。

Description

龙葵曲顶病毒全基因组序列及其检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物工程技术领域，具体涉及一种龙葵曲顶病毒全基因组序列及其检测方法。

背景技术

龙葵是我国传统中药材，历史悠久。近年来由于其药用成分具有显著的抗肿瘤功效，龙葵逐渐引起国内外专家学者的高度重视。随着相关品的不断研发与生产，龙葵作为一种新兴经济作物，逐渐实行人工种植。加工型龙葵作为东北、山东等地的新兴产业，产品品质优良，效益显著、市场前景广阔，在区域经济发展、农业产业结构调整、农业增效和农民增收中的作用日益显著。

近期发现一种龙葵病害普遍发生，呈爆发趋势，感病植株呈现症状植株矮小、叶片扭曲、果实萎缩的症状，严重影响龙葵采收，防治形势不容乐观。龙葵在我国分布广泛，如果任由该病害进一步传播蔓延，将会对我国龙葵产业带来很大影响。此外龙葵属茄科，同科很多重要经济作物(如番茄、马铃薯、茄子)，该病害有可能在茄科经济作物上传播引发新病害。然而，目前暂无龙葵病毒病害报道，缺少对龙葵病害的有效检测手段，导致对该病害无针对性防治方法，造成严重的经济损失。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何确定引起龙葵曲顶症状的病毒病原及如何有效地检测该病毒。

为解决上述问题，一方面，本发明提供引起龙葵曲顶症状的龙葵曲顶病毒全基因组序列，具体序列如序列表SEQ NO：1所示，龙葵曲顶病毒全基因组序列长2867bp。

进一步的，龙葵曲顶病毒全基因组序列包含V1、V2、V3、C1、C2、C3和C4 7个ORF(开放阅读框)，所述V1、V2、V3、C1、C2、C3和C4序列如序列表SEQ NO：2-8所示。

进一步的，所述V1、V2、V3、C1、C2、C3和C4编码的氨基酸序列如SEQ NO：9-15所示，各氨基酸序列长度分别为95aa、242aa、82aa、347aa、158aa、134aa、85aa。

另一方面，发明还提供了一种用于扩增所述龙葵曲顶病毒全基因组序列的扩增引物，引物序列如下：

NCTV-F：GCGTTTATAGTGAAATGTTTAGGCAT

NCTV-R：CAAGAATATCTTCCTCACATATCCCAG。

另一方面，本发明还提供了上述扩增引物的获取方法，包括如下步骤：

(1)样品采集与RNA提取：将田间发现有病毒症状的龙葵的发病部位剪下，提取植物总RNA；

(2)siRNA深度测序：将提取的样品总RNA进行siRNA建库与测序；

(3)siRNA深度测序数据处理与分析：利用生物信息学软件对测序数据进行原始数据过滤、序列拼接，得到若干contigs；

(4)根据病毒来源的上述contigs使用引物设计软件设计特异性病毒全长基因组扩增引物，获得扩增引物序列。

另一方面，本发明还提供了一种利用上述扩增引物获取所述龙葵曲顶病毒全基因组序列的方法，包括如下步骤：

(1)提取病毒侵染的龙葵组织总DNA；

(2)采用所述扩增引物，以所述龙葵组织总DNA为模板，进行PCR扩增；

(3)回收PCR扩增得到的DNA产物，并将其连接到pLB平末端载体，进行DNA测序，得到龙葵曲顶病毒全基因组序列。

另一方面，本发明还提供了一种用于检测所述龙葵曲顶病毒的特异性检测引物，两对所述检测引物序列如下：

另一方面，本发明还提供了一种检测所述龙葵曲顶病毒的方法，使用上述特异性检测引物进行PCR检测。

进一步的，检测方法包括如下步骤：

(1)采集疑似感病植物材料，提取疑似感病的植物总DNA；

(2)将步骤(1)终产物植物总DNA稀释到100ng/μl，用所述检测引物进行普通定性PCR扩增；

(3)检测，用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物条带，用1kb DNAmarker作为片段大小对照标准，根据电泳图确定检测结果。

进一步的，PCR体系如下：

PCR反应循环的设置如下：

本发明有益效果如下：

1)本发明鉴定了引起龙葵曲顶症状的病毒病原为一种新的双生病毒，并获取了该病毒的全基因组序列，ORF序列及编码氨基酸序列，为后期该病毒的研究及病害的防治打下基础。

2)本发明提供了用于龙葵曲顶病毒基因序列扩增的扩增引物及其获取方法，采用siRNA深度测序，测序数据经处理分析，获得若干contigs，采用病毒来源的contigs设计特异性病毒全长基因组扩增引物，该引物特异性强，扩增效率高，能可靠获得长度为2867bp的DNA产物。

3)本发明设计的龙葵曲顶病毒检测引物具有特异性强、检测结果可靠的优点，使用该检测引物通过PCR能够准确可靠地检测该病毒。

附图说明

图1为感染龙葵曲顶病毒的龙葵叶片；`

图2为龙葵曲顶病毒环状DNA结构示意图；

图3为利用检测引物对疑似感染病毒的植物材料进行龙葵病毒PCR检测电泳图(注：M代表DNA Marker；数字1和2分别代表引物NCTV-1和NCTV-2；Sample1-3代表三个检测样品；CK代表阴性对照)。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。

实施例一基于siRNA深度测序的植物病毒鉴定

(1)样品采集

将田间发现有病毒症状(如花叶、卷叶、黄化、皱缩等)的龙葵发病部位剪下，放入采集袋中，做好标记；回到实验室后，立即用液氮研磨，提取植物总RNA，或者用液氮速冻后，立即保存于-80度冰箱备用。

(2)植物总RNA提取

1)取0.1g植物叶片，液氮中快速研磨至粉末；

2)粉末转移至1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，振荡混匀，室温静置5min；

3)向离心管中加入0.2mL氯仿，剧烈摇晃15sec后室温静置3min；

4)4℃12,000rpm离心15min，小心吸取上清转移至新的1.5mL离心管中，重复步骤3到4一到两遍；

5)将上清转移到新的1.5mL离心管中，加入等体积预冷的异丙醇后颠倒数次混匀，室温放置20～30min；

6)4℃12,000rpm离心10min，弃上清，用1mL 70％酒精洗涤沉淀两次；

7)4℃12,000rpm离心5min，弃上清，室温干燥沉淀；

8)用50μL DEPC处理水溶解沉淀；

9)取适量样品进行琼脂糖凝胶电泳检测提取RNA的质量；

10)将样品置于-80℃冰箱保存。

(2)siRNA深度测序

将提取的样品总RNA送至测序公司进行siRNA建库与测序。

(3)siRNA深度测序数据处理与分析

利用生物信息学软件对测序数据进行原始数据过滤，去除原始数据中包含的接头信息、低质量序列。然后根据病毒来源的siRNA之间具有overlap的特点，用Velvet软件对上述小RNA进行序列拼接，得到若干contigs。将上述contigs在NCBI数据库中进行BLASTn和BLASTx比对，得到这些contigs在病毒基因组上的位置。

实施例二龙葵曲顶病毒的全基因组序列测定

(1)植物DNA提取

采用CTAB法抽提病毒侵染龙葵组织的总DNA，具体方法为：取0.2g植物组织叶片，在液氮中磨成粉末，将粉末转移至1.5ml离心管中，加入600μL 65℃预热的CTAB提取液，快速混匀，65℃条件下保温30min，不时颠倒混匀；待冷至室温后加入500μL氯仿/异戊醇(24：1)，颠倒混匀，12000rpm，离心5min；取上清液，加入600μL预冷的异丙醇，颠倒混匀，12000rpm，离心5min；弃去上清液，沉淀用800μL70％的乙醇洗涤沉淀两次；稍干燥，将DNA沉淀溶解于30μL灭菌的双蒸水，4℃保存。

(2)扩增引物设计

根据上述病毒来源的contigs序列，通过引物设计软件设计特异性病毒全长基因组扩增引物，扩增引物序列如下：

NCTV-F：GCGTTTATAGTGAAATGTTTAGGCAT

NCTV-R：CAAGAATATCTTCCTCACATATCCCAG

(3)病毒序列扩增

PCR反应体系如下：采用上述扩增引物，以步骤(1)提取的龙葵组织总DNA作为模板，选择KOD-Plus-Neo高保真DNA聚合酶进行目的片段的扩增，反应体系如下：

PCR反应循环的设置如下：

PCR反应结束后获得病毒序列扩增产物。

(4)回收测序

回收长度为2867bp的DNA产物，并将其连接到pLB平末端载体，pLB平末端连接反应体系如下：

轻弹离心管以混匀反应液，短暂离心3-5sec，将混合反应液放置室温(22℃)反应5min。反应结束后，将离心管置于冰上，进行后续的转化反应，终载体送测序公司进行DNA测序，测序结果如序列表SEQ NO：1所示。

实施例三病毒基因组生物信息学分析

(1)病毒基因组结构分析：利用NCBI ORF finder软件以及SnapGene软件预测病毒编码ORF及编码蛋白，结果如图1及序列表SEQ NO：2-8和SEQ NO：9-15所示，该病毒全基因组序列包含7个ORF，该病毒的病毒链编码V1(运动蛋白，MP)、V2(外壳蛋白，CP)、以及未知功能蛋白V3，互补链编码C1(复制相关蛋白Rep)、C2(复制增强蛋白REn)、C3、C4四个蛋白。

(2)病毒分子变异进化分析：病毒基因组序列之间的变异进化利用MEGA6分析软件进行分析，病毒基因组核苷酸序列分析显示该病毒与番茄伪曲顶病毒(Tomato pseudo-curly top virus，TPCTV)基因组序列具有72％的相似性。

氨基酸同源性比对发现病毒编码的V1、V2、C1、C2、C3核苷酸序列与TPCTV编码核苷酸序列相似性在63％～89％之间；而C4、V4以及C2中的87bp片段与TPCTV基因组序列无显著相似性。进一步比对发现NCTV编码的C4与巴豆黄脉花叶病毒(Croton yellow vein mosaicvirus，CYVMV)编码的C4具有89.9％的相似性。以上结果说明NCTV可能是由两种不同属的双生病毒通过病毒基因组重组获得的。

实施例四病毒检测方法

(1)采集疑似感病植物材料，提取疑似感病的植物总DNA，方法同实施例二步骤(1)；

(2)根据龙葵曲顶病毒全基因组序列设计龙葵曲顶病毒的特异性检测引物，两对所

述检测引物序列如下：

其中，引物NCTV-1的扩增产物长139bp；引物NCTV-2的扩增产物长276bp；

(3)将步骤(1)终产物稀释到100ng/μl，用步骤(2)所述检测引物进行普通定性PCR扩增，以2×Taq PCR Mix含燃料产品为例(南京喏维赞Green Taq Mix)普通PCR体系如下：

PCR反应循环的设置：

(4)检测，用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物条带，用1 kb DNA marker(ThermoFisher GeneRuler 1 kb DNA Ladder)作为片段大小对照标准，凝胶电泳检测结果如图3所示，可以看出两对引物均能扩增出三个样品中该病毒的基因片段，说明两对检测引物特异性强、检测结果准确可靠。

虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。

序列表

<110> 中国计量大学

<120> 龙葵曲顶病毒全基因组序列及其检测方法

<130> 19-100233-00012707

<141> 2019-05-10

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2867

<212> DNA

<213> 龙葵曲顶病毒(Solanum nigrum curly top virus)

<400> 1

accggagtgc cctccccgcc ctcttaaata gtgggccccg cataggggtg ttgttgtctt 60

ttcactagtt caataatgcg taaaaagccg ctattatgat tgggccactg tttataatgg 120

ccttataagg cccttaatta attgggcccc aagtttgtcc ttatctgcag ctttatataa 180

agctgcagtc cccttattaa agtaatggcc accatcaatt gtcggatatg tgggtctgag 240

tcctgtccag tcaatgaacg ctttagcgtt tgtgaatctc gaggcgctac tctgagcgat 300

ttcctcttgt attttcgtag aaaatacata gaaacttcac ctggcttgat ctactatctc 360

aatgccttac aagcggaaat taacgagtta ttttccgcaa tcaaagaagt ttcgagggtc 420

gaagtcgggt ctggcgcttg tgaaaacaag tgccagtcgt cgggtgtaca gaaagggaaa 480

acgcaagcct gatcgtataa agacttatac gtattccttt tccagtattg ctaatgataa 540

gggtacaatt gtgtatatga atagctggtc tttgggcctt ggcccaaatc agcgtgggag 600

tgacatcgag atcttgaagt ccatgtatct tcgtctgtgt gtctctttgt cggaggctgc 660

tgctgctcag gttaagtctt atatggttaa gtgggctttg atcgtggatc aaatccctgg 720

tgaaaccctt gttggtgttg gggatgtctt taagacatgc ccggcccctt atcaatatgt 780

gcaatgtgca tacattgcag atgataatca cggtcgcttt caagtcttga ggagtggttt 840

cttaacctta aatgctaatg gccttgctgt tggatcaaca acaagaactg gatgtgcagc 900

tatgaagaat atggcgtctg ttaataaatt ttgtaaaaat ttaaatgtta ggtgtgtata 960

tgatgctgat agtgcaaccg gtgacatcgc taatattaag cgtggagccg tttatcttgt 1020

aatttggccg gatattgaga tccggtatgg attttcatgt actatgtatc atagaaatgg 1080

aaattcataa taattgaatt aataaagtct catttttata ttataataaa aacttggagc 1140

ataaaataca cgatcatcaa atagatcgat aaaatgattt atcgatctaa ttacattgtt 1200

aatactaata acacccaaat tatttaaata tttcattaca tgaaatctaa atctctttaa 1260

taatgcttct ccactcagac gaggtgatac tgaaagtacc accaagttca gccagcatat 1320

ctggagatcc aacgctttcc gaaggttgtg gtttgctctg atctggagag ttattatctg 1380

gttccctgtt gacagggttg ttgtgttgtg tagtttgaag tatatcgggt tctggagatc 1440

gtcgaaatag cagccattct ggcattgtgt gtacgtgagt gactcccctg tgcgtgaatc 1500

catctggaca gttgatgccc ccgtaatatg agcacccaca agcaaggtga actgccttgc 1560

gtctttgctt ctttggggcc caagtttgtt tggggggtct cttccttatc ttaggtggtg 1620

gtggaagtct ctcgtttacg tcgtcgggat gttcgcaatt ccagcagaat cctgaagtct 1680

cttcttctaa ttcgtgaatg ccgttgtcac agagtgtgat cattgtatag aggctctgtt 1740

agtttgatga acacagcatt tgagagtgtc caccttttta aagcctcatt ttcttccttc 1800

tcgaggaagt cttgaaaaga tgtgtcccca ccagggttgc acagtataat tgatgggacc 1860

ccgcctttaa tttgaactgg ttttccatat ttacaatttg actgccagtc cttctgggcc 1920

ccaataagct ctttccagtg ctttaacttt agatagtgcg gtgtgacgtc atctatgacg 1980

ttgtactccg cattatttga atacactctg ctgttgaaat ccaggtgacc ggaaaggtaa 2040

ttatgtgaac caagacttct tgcccacatt gttttgccgg tcctagaatc gccttctata 2100

ataattccta taggtcttat aggccgcgca gcggcactaa catcgaaata attatcagcc 2160

cactcttgca tatcttcagg aacgttagta aatgaagata attcaaacgg agggacaaac 2220

ggagttggtg ccggagtaaa aatcttatct aaattacaaa ctaaattatg ataacaaaat 2280

aaaaaatctt taggtagctt ttcttttatt atttgtagag cttcctcttt tgaggaagcg 2340

tttaacgcct ctgcgcatgc atcgttagct gtctgctgac ctcctctagc agatcgtcca 2400

tcgatctgaa aactacccca gtcgatgtaa tctccgtcct tctcgatgta ggacttgaca 2460

tcagatgcgg actttgcccc ctgaaagttg gggtggaatt gggtgctagt agaaggatgg 2520

gtgatgtcga aatgtctggg gtttctgaat ttggccttac ccttgaactg gatgagggca 2580

tggatatgca attccccatc gtcgtggtgt tctgaggaaa ccctaataaa taatttatct 2640

gaaggacaag aaatgttctt cagtaattct aaaacttgtt cttttggtaa tgggcatctg 2700

ggatatgtga ggaagatatt cttggcgttt atagtgaaat gtttaggcat tttgatgtcg 2760

ttttgtgtgt aaagctctgc gttttgtatc ggggacgttc taaaactctg agaaatgggg 2820

gactttgggg acgcatttat agggggaggg cactccgtat taatatt 2867

<210> 2

<211> 288

<212> DNA

<213> 龙葵曲顶病毒(Solanum nigrum curly top virus)

<400> 2

atggccacca tcaattgtcg gatatgtggg tctgagtcct gtccagtcaa tgaacgcttt 60

agcgtttgtg aatctcgagg cgctactctg agcgatttcc tcttgtattt tcgtagaaaa 120

tacatagaaa cttcacctgg cttgatctac tatctcaatg ccttacaagc ggaaattaac 180

gagttatttt ccgcaatcaa agaagtttcg agggtcgaag tcgggtctgg cgcttgtgaa 240

aacaagtgcc agtcgtcggg tgtacagaaa gggaaaacgc aagcctga 288

<210> 3

<211> 729

<212> DNA

<213> 龙葵曲顶病毒(Solanum nigrum curly top virus)

<400> 3

atgccttaca agcggaaatt aacgagttat tttccgcaat caaagaagtt tcgagggtcg 60

aagtcgggtc tggcgcttgt gaaaacaagt gccagtcgtc gggtgtacag aaagggaaaa 120

cgcaagcctg atcgtataaa gacttatacg tattcctttt ccagtattgc taatgataag 180

ggtacaattg tgtatatgaa tagctggtct ttgggccttg gcccaaatca gcgtgggagt 240

gacatcgaga tcttgaagtc catgtatctt cgtctgtgtg tctctttgtc ggaggctgct 300

gctgctcagg ttaagtctta tatggttaag tgggctttga tcgtggatca aatccctggt 360

gaaacccttg ttggtgttgg ggatgtcttt aagacatgcc cggcccctta tcaatatgtg 420

caatgtgcat acattgcaga tgataatcac ggtcgctttc aagtcttgag gagtggtttc 480

ttaaccttaa atgctaatgg ccttgctgtt ggatcaacaa caagaactgg atgtgcagct 540

atgaagaata tggcgtctgt taataaattt tgtaaaaatt taaatgttag gtgtgtatat 600

gatgctgata gtgcaaccgg tgacatcgct aatattaagc gtggagccgt ttatcttgta 660

atttggccgg atattgagat ccggtatgga ttttcatgta ctatgtatca tagaaatgga 720

aattcataa 729

<210> 4

<211> 249

<212> DNA

<213> 龙葵曲顶病毒(Solanum nigrum curly top virus)

<400> 4

atgtcgaaat gtctggggtt tctgaatttg gccttaccct tgaactggat gagggcatgg 60

atatgcaatt ccccatcgtc gtggtgttct gaggaaaccc taataaataa tttatctgaa 120

ggacaagaaa tgttcttcag taattctaaa acttgttctt ttggtaatgg gcatctggga 180

tatgtgagga agatattctt ggcgtttata gtgaaatgtt taggcatttt gatgtcgttt 240

tgtgtgtaa 249

<210> 5

<211> 1044

<212> DNA

<213> 龙葵曲顶病毒(Solanum nigrum curly top virus)

<400> 5

atgcctaaac atttcactat aaacgccaag aatatcttcc tcacatatcc cagatgccca 60

ttaccaaaag aacaagtttt agaattactg aagaacattt cttgtccttc agataaatta 120

tttattaggg tttcctcaga acaccacgac gatggggaat tgcatatcca tgccctcatc 180

cagttcaagg gtaaggccaa attcagaaac cccagacatt tcgacatcac ccatccttct 240

actagcaccc aattccaccc caactttcag ggggcaaagt ccgcatctga tgtcaagtcc 300

tacatcgaga aggacggaga ttacatcgac tggggtagtt ttcagatcga tggacgatct 360

gctagaggag gtcagcagac agctaacgat gcatgcgcag aggcgttaaa cgcttcctca 420

aaagaggaag ctctacaaat aataaaagaa aagctaccta aagatttttt attttgttat 480

cataatttag tttgtaattt agataagatt tttactccgg caccaactcc gtttgtccct 540

ccgtttgaat tatcttcatt tactaacgtt cctgaagata tgcaagagtg ggctgataat 600

tatttcgatg ttagtgccgc tgcgcggcct ataagaccta taggaattat tatagaaggc 660

gattctagga ccggcaaaac aatgtgggca agaagtcttg gttcacataa ttacctttcc 720

ggtcacctgg atttcaacag cagagtgtat tcaaataatg cggagtacaa cgtcatagat 780

gacgtcacac cgcactatct aaagttaaag cactggaaag agcttattgg ggcccagaag 840

gactggcagt caaattgtaa atatggaaaa ccagttcaaa ttaaaggcgg ggtcccatca 900

attatactgt gcaaccctgg tggggacaca tcttttcaag acttcctcga gaaggaagaa 960

aatgaggctt taaaaaggtg gacactctca aatgctgtgt tcatcaaact aacagagcct 1020

ctatacaatg atcacactct gtga 1044

<210> 6

<211> 477

<212> DNA

<213> 龙葵曲顶病毒(Solanum nigrum curly top virus)

<400> 6

atgatcacac tctgtgacaa cggcattcac gaattagaag aagagacttc aggattctgc 60

tggaattgcg aacatcccga cgacgtaaac gagagacttc caccaccacc taagataagg 120

aagagacccc ccaaacaaac ttgggcccca aagaagcaaa gacgcaaggc agttcacctt 180

gcttgtgggt gctcatatta cgggggcatc aactgtccag atggattcac gcacagggga 240

gtcactcacg tacacacaat gccagaatgg ctgctatttc gacgatctcc agaacccgat 300

atacttcaaa ctacacaaca caacaaccct gtcaacaggg aaccagataa taactctcca 360

gatcagagca aaccacaacc ttcggaaagc gttggatctc cagatatgct ggctgaactt 420

ggtggtactt tcagtatcac ctcgtctgag tggagaagca ttattaaaga gatttag 477

<210> 7

<211> 405

<212> DNA

<213> 龙葵曲顶病毒(Solanum nigrum curly top virus)

<400> 7

atggattcac gcacagggga gtcactcacg tacacacaat gccagaatgg ctgctatttc 60

gacgatctcc agaacccgat atacttcaaa ctacacaaca caacaaccct gtcaacaggg 120

aaccagataa taactctcca gatcagagca aaccacaacc ttcggaaagc gttggatctc 180

cagatatgct ggctgaactt ggtggtactt tcagtatcac ctcgtctgag tggagaagca 240

ttattaaaga gatttagatt tcatgtaatg aaatatttaa ataatttggg tgttattagt 300

attaacaatg taattagatc gataaatcat tttatcgatc tatttgatga tcgtgtattt 360

tatgctccaa gtttttatta taatataaaa atgagacttt attaa 405

<210> 8

<211> 258

<212> DNA

<213> 龙葵曲顶病毒(Solanum nigrum curly top virus)

<400> 8

atggggaatt gcatatccat gccctcatcc agttcaaggg taaggccaaa ttcagaaacc 60

ccagacattt cgacatcacc catccttcta ctagcaccca attccacccc aactttcagg 120

gggcaaagtc cgcatctgat gtcaagtcct acatcgagaa ggacggagat tacatcgact 180

ggggtagttt tcagatcgat ggacgatctg ctagaggagg tcagcagaca gctaacgatg 240

catgcgcaga ggcgttaa 258

<210> 9

<211> 95

<212> PRT

<213> 龙葵曲顶病毒(Solanum nigrum curly top virus)

<400> 9

Met Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ile Cys Gly Ser Glu Ser Cys Pro Val

1 5 10 15

Asn Glu Arg Phe Ser Val Cys Glu Ser Arg Gly Ala Thr Leu Ser Asp

20 25 30

Phe Leu Leu Tyr Phe Arg Arg Lys Tyr Ile Glu Thr Ser Pro Gly Leu

35 40 45

Ile Tyr Tyr Leu Asn Ala Leu Gln Ala Glu Ile Asn Glu Leu Phe Ser

50 55 60

Ala Ile Lys Glu Val Ser Arg Val Glu Val Gly Ser Gly Ala Cys Glu

65 70 75 80

Asn Lys Cys Gln Ser Ser Gly Val Gln Lys Gly Lys Thr Gln Ala

85 90 95

<210> 10

<211> 242

<212> PRT

<213> 龙葵曲顶病毒(Solanum nigrum curly top virus)

<400> 10

Met Pro Tyr Lys Arg Lys Leu Thr Ser Tyr Phe Pro Gln Ser Lys Lys

1 5 10 15

Phe Arg Gly Ser Lys Ser Gly Leu Ala Leu Val Lys Thr Ser Ala Ser

20 25 30

Arg Arg Val Tyr Arg Lys Gly Lys Arg Lys Pro Asp Arg Ile Lys Thr

35 40 45

Tyr Thr Tyr Ser Phe Ser Ser Ile Ala Asn Asp Lys Gly Thr Ile Val

50 55 60

Tyr Met Asn Ser Trp Ser Leu Gly Leu Gly Pro Asn Gln Arg Gly Ser

65 70 75 80

Asp Ile Glu Ile Leu Lys Ser Met Tyr Leu Arg Leu Cys Val Ser Leu

85 90 95

Ser Glu Ala Ala Ala Ala Gln Val Lys Ser Tyr Met Val Lys Trp Ala

100 105 110

Leu Ile Val Asp Gln Ile Pro Gly Glu Thr Leu Val Gly Val Gly Asp

115 120 125

Val Phe Lys Thr Cys Pro Ala Pro Tyr Gln Tyr Val Gln Cys Ala Tyr

130 135 140

Ile Ala Asp Asp Asn His Gly Arg Phe Gln Val Leu Arg Ser Gly Phe

145 150 155 160

Leu Thr Leu Asn Ala Asn Gly Leu Ala Val Gly Ser Thr Thr Arg Thr

165 170 175

Gly Cys Ala Ala Met Lys Asn Met Ala Ser Val Asn Lys Phe Cys Lys

180 185 190

Asn Leu Asn Val Arg Cys Val Tyr Asp Ala Asp Ser Ala Thr Gly Asp

195 200 205

Ile Ala Asn Ile Lys Arg Gly Ala Val Tyr Leu Val Ile Trp Pro Asp

210 215 220

Ile Glu Ile Arg Tyr Gly Phe Ser Cys Thr Met Tyr His Arg Asn Gly

225 230 235 240

Asn Ser

<210> 11

<211> 82

<212> PRT

<213> 龙葵曲顶病毒(Solanum nigrum curly top virus)

<400> 11

Met Ser Lys Cys Leu Gly Phe Leu Asn Leu Ala Leu Pro Leu Asn Trp

1 5 10 15

Met Arg Ala Trp Ile Cys Asn Ser Pro Ser Ser Trp Cys Ser Glu Glu

20 25 30

Thr Leu Ile Asn Asn Leu Ser Glu Gly Gln Glu Met Phe Phe Ser Asn

35 40 45

Ser Lys Thr Cys Ser Phe Gly Asn Gly His Leu Gly Tyr Val Arg Lys

50 55 60

Ile Phe Leu Ala Phe Ile Val Lys Cys Leu Gly Ile Leu Met Ser Phe

65 70 75 80

Cys Val

<210> 12

<211> 347

<212> PRT

<213> 龙葵曲顶病毒(Solanum nigrum curly top virus)

<400> 12

Met Pro Lys His Phe Thr Ile Asn Ala Lys Asn Ile Phe Leu Thr Tyr

1 5 10 15

Pro Arg Cys Pro Leu Pro Lys Glu Gln Val Leu Glu Leu Leu Lys Asn

20 25 30

Ile Ser Cys Pro Ser Asp Lys Leu Phe Ile Arg Val Ser Ser Glu His

35 40 45

His Asp Asp Gly Glu Leu His Ile His Ala Leu Ile Gln Phe Lys Gly

50 55 60

Lys Ala Lys Phe Arg Asn Pro Arg His Phe Asp Ile Thr His Pro Ser

65 70 75 80

Thr Ser Thr Gln Phe His Pro Asn Phe Gln Gly Ala Lys Ser Ala Ser

85 90 95

Asp Val Lys Ser Tyr Ile Glu Lys Asp Gly Asp Tyr Ile Asp Trp Gly

100 105 110

Ser Phe Gln Ile Asp Gly Arg Ser Ala Arg Gly Gly Gln Gln Thr Ala

115 120 125

Asn Asp Ala Cys Ala Glu Ala Leu Asn Ala Ser Ser Lys Glu Glu Ala

130 135 140

Leu Gln Ile Ile Lys Glu Lys Leu Pro Lys Asp Phe Leu Phe Cys Tyr

145 150 155 160

His Asn Leu Val Cys Asn Leu Asp Lys Ile Phe Thr Pro Ala Pro Thr

165 170 175

Pro Phe Val Pro Pro Phe Glu Leu Ser Ser Phe Thr Asn Val Pro Glu

180 185 190

Asp Met Gln Glu Trp Ala Asp Asn Tyr Phe Asp Val Ser Ala Ala Ala

195 200 205

Arg Pro Ile Arg Pro Ile Gly Ile Ile Ile Glu Gly Asp Ser Arg Thr

210 215 220

Gly Lys Thr Met Trp Ala Arg Ser Leu Gly Ser His Asn Tyr Leu Ser

225 230 235 240

Gly His Leu Asp Phe Asn Ser Arg Val Tyr Ser Asn Asn Ala Glu Tyr

245 250 255

Asn Val Ile Asp Asp Val Thr Pro His Tyr Leu Lys Leu Lys His Trp

260 265 270

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275 280 285

Gly Lys Pro Val Gln Ile Lys Gly Gly Val Pro Ser Ile Ile Leu Cys

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Asn Pro Gly Gly Asp Thr Ser Phe Gln Asp Phe Leu Glu Lys Glu Glu

305 310 315 320

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325 330 335

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<210> 13

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<212> PRT

<213> 龙葵曲顶病毒(Solanum nigrum curly top virus)

<400> 13

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20 25 30

Leu Pro Pro Pro Pro Lys Ile Arg Lys Arg Pro Pro Lys Gln Thr Trp

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50 55 60

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115 120 125

Glu Ser Val Gly Ser Pro Asp Met Leu Ala Glu Leu Gly Gly Thr Phe

130 135 140

Ser Ile Thr Ser Ser Glu Trp Arg Ser Ile Ile Lys Glu Ile

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<210> 14

<211> 134

<212> PRT

<213> 龙葵曲顶病毒(Solanum nigrum curly top virus)

<400> 14

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1 5 10 15

Gly Cys Tyr Phe Asp Asp Leu Gln Asn Pro Ile Tyr Phe Lys Leu His

20 25 30

Asn Thr Thr Thr Leu Ser Thr Gly Asn Gln Ile Ile Thr Leu Gln Ile

35 40 45

Arg Ala Asn His Asn Leu Arg Lys Ala Leu Asp Leu Gln Ile Cys Trp

50 55 60

Leu Asn Leu Val Val Leu Ser Val Ser Pro Arg Leu Ser Gly Glu Ala

65 70 75 80

Leu Leu Lys Arg Phe Arg Phe His Val Met Lys Tyr Leu Asn Asn Leu

85 90 95

Gly Val Ile Ser Ile Asn Asn Val Ile Arg Ser Ile Asn His Phe Ile

100 105 110

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115 120 125

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<210> 15

<211> 85

<212> PRT

<213> 龙葵曲顶病毒(Solanum nigrum curly top virus)

<400> 15

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Asn Ser Glu Thr Pro Asp Ile Ser Thr Ser Pro Ile Leu Leu Leu Ala

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Pro Asn Ser Thr Pro Thr Phe Arg Gly Gln Ser Pro His Leu Met Ser

35 40 45

Ser Pro Thr Ser Arg Arg Thr Glu Ile Thr Ser Thr Gly Val Val Phe

50 55 60

Arg Ser Met Asp Asp Leu Leu Glu Glu Val Ser Arg Gln Leu Thr Met

65 70 75 80

His Ala Gln Arg Arg

85

Claims

1.一种人工分离获得的龙葵曲顶病毒，其特征在于，该病毒全基因组序列如序列表SEQNO:1所示；该病毒全基因组序列包含V1、V2、V3、C1、C2、C3和C4共7个ORF，所述V1、V2、V3、C1、C2、C3和C4的核苷酸序列分别如序列表SEQ NO:2-8所示；所述V1、V2、V3、C1、C2、C3和C4编码的氨基酸序列分别如SEQ NO:9-15所示。

2.一种用于扩增权利要求1所述龙葵曲顶病毒全基因组序列的扩增引物，其特征在于，所述扩增引物序列如下：

NCTV-F：GCGTTTATAGTGAAATGTTTAGGCAT

NCTV-R：CAAGAATATCTTCCTCACATATCCCAG。

3.一种如权利要求2所述扩增引物的获取方法，其特征在于，包括如下步骤：

(2)siRNA深度测序：将提取的样品总RNA进行siRNA建库与测序；

(4)引物设计：根据病毒来源的上述contigs使用引物设计软件设计特异性病毒全长基因组扩增引物，获得扩增引物序列。

4.一种如权利要求1所述龙葵曲顶病毒全基因组序列获取方法，其特征在于，使用权利要求2所述扩增引物进行扩增，包括如下步骤：

(1)提取病毒侵染的龙葵组织总DNA；

5.一种用于检测权利要求1所述龙葵曲顶病毒的特异性检测引物，其特征在于，两对所述检测引物序列如下：