CN108823174B - 番木瓜环斑病毒西瓜株系弱毒疫苗的研制及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种PRSV‑W弱毒疫苗及其应用。本发明以PRSV‑W全长侵染性cDNA克隆为基础，通过定点突变技术在PRSV‑W的HC‑Pro基因中定点引入突变，明确了调控病毒致病力的氨基酸位点，获得了致病力显著下降的PRSV‑W弱毒突变体；本发明发现弱毒疫苗K125D、G317K和N137A对PRSV‑W强毒株系有良好的交叉保护效果，可保护甜瓜和西葫芦植株免受强毒株系侵染。

Description

番木瓜环斑病毒西瓜株系弱毒疫苗的研制及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种番木瓜环斑病毒西瓜株系弱毒疫苗及其应用。
背景技术
病毒病在葫芦科作物生产上发生普遍，显著降低作物品质和产量，发生严重时可导致绝产。目前已鉴定危害葫芦科作物的病毒近50种，其中番木瓜环斑病毒西瓜株系(Papaya ringspot virus-watermelon strain，PRSV-W)属于马铃薯Y病毒属，主要侵染西葫芦、甜瓜等葫芦科作物，引起叶片卷曲、畸形、花叶、泡斑以及植株矮化等症状，甚至造成果实畸形。PRSV-W在我国山东、河南、广东、四川等地葫芦科作物上均有发生，已成为危害葫芦科作物的重要病毒。
种植抗病品种是防治作物病毒病最经济有效的方式。但目前市场上缺乏高抗PRSV-W的优良葫芦科作物品种，也没有对PRSV-W有效的抗病毒药剂。因此，生产上缺少防治PRSV-W的有效技术。
交叉保护是防治植物病毒病危害的一种重要的方法，是指当作物受到病毒弱毒株系的侵染之后，能够抑制同种或者相近病毒强毒株系侵染的现象。之前有利用亚硝酸诱变美国夏威夷的番木瓜环斑病毒强毒株HA获得其弱毒株HA5-1并进行交叉保护防控PRSV的研究，但弱株系的保护作用存在株系专化性问题，如HA5-1弱株系对夏威夷野生株系的保护作用比对中国台湾株系的强，对中国华南地区PRSV株系的保护作用很差，对泰国株系和墨西哥株系没有保护作用。进一步的研究结果表明，PRSV株系间的交叉保护作用程度与株系间的亲缘关系呈正相关。但目前还未有对番木瓜环斑病毒西瓜株系进行突变筛选弱毒株系以用于交叉保护研究的报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种PRSV-W弱毒疫苗及其应用。本发明以PRSV-W全长侵染性cDNA克隆为基础，通过定点突变技术在PRSV-W的HC-Pro基因中定点引入突变，明确了调控病毒致病力的氨基酸位点，获得了致病力显著下降的PRSV-W弱毒突变体；本发明发现弱毒疫苗K125D、G317K和N137A对PRSV-W强毒株系有良好的交叉保护效果，可保护甜瓜和西葫芦植株免受强毒株系侵染。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供番木瓜环斑病毒西瓜株系弱毒突变体在防治PRSV-W强毒株系侵染方面的应用；
所述番木瓜环斑病毒西瓜株系弱毒突变体包括：弱毒突变体K125D，其氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示；
弱毒突变体G317K，其氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示；
弱毒突变体N137A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示。
所述防治PRSV-W强毒株系侵染是通过提供交叉保护作用实现的。
本发明的第二方面，提供一种番木瓜环斑病毒西瓜株系弱毒疫苗，可通过以下步骤获得：
利用PCR技术在PRSV-W的辅助成分-蛋白酶(Helper component-proteinase，HC-Pro)基因中定点引入突变以获得突变体K125D、G317K和N137A，其氨基酸序列分别如SEQ IDNO.21、SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示；接种寄主植物筛选得到HC-Pro第125位、317位和137位氨基酸发生突变的弱毒疫苗K125D、G317K和N137A。
优选的，通过SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物引入突变以获得突变体K125D；
通过SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的引物引入突变以获得突变体G317K；
通过SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的引物引入突变以获得突变体N137A。
本发明的第三方面，提供上述番木瓜环斑病毒西瓜株系弱毒疫苗在防治PRSV-W强毒株系侵染方面的应用。
具体的，番木瓜环斑病毒西瓜株系弱毒疫苗K125D和G317K可以交叉保护甜瓜植株免受PRSV-W强毒株系的侵染；番木瓜环斑病毒西瓜株系弱毒疫苗N137A可以交叉保护西葫芦植株免受PRSV-W强毒株系的侵染。
本发明的有益效果：
(1)本发明获得了10个致病力明显降低且不回复突变为野生型的PRSV-W弱毒疫苗。
(2)弱毒疫苗K125D、G317K和N137A分别可以保护甜瓜和西葫芦植株免受PRSV-W强毒株系的侵染。
(3)弱毒疫苗K125D、G317K和N137A提前10天接种可有效保护甜瓜和西葫芦植株免受PRSV-W强毒株系的侵染。
附图说明
图1为PRSV-W强毒株系和弱毒突变体接种甜瓜植株后第15天的症状；
图2显示PRSV-W强毒株系和突变体接种15天后在甜瓜系统叶片中的积累水平；
图3显示挑战接种10天后，不同间隔保护期弱毒突变体对甜瓜植株的保护效果；
图4为挑战接种10天后，不同处理的甜瓜植株中病毒的积累水平；
图5显示挑战接种15天后，不同间隔保护期弱毒突变体对西葫芦的保护效果；
图6为挑战接种15天后，间隔保护期为10天的西葫芦植株中病毒积累水平。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分所介绍的，PRSV株系间的交叉保护作用程度与株系间的亲缘关系呈正相关，番木瓜环斑病毒主要有两个株系，其中，番木瓜环斑病毒西瓜株系(Papayaringspot virus-watermelon strain，PRSV-W)主要侵染西葫芦、甜瓜等葫芦科作物；P株系主要侵染番木瓜，这两个株系的致病性不同，针对的作物种类也不同。
利用交叉保护防治植物病毒病害最关键的是弱毒株的获得，通过反向遗传学技术是获得弱毒株的途径之一，但关键在于明确调控病毒致病性的氨基酸位点，然后在此基础上通过定点突变的方法构建病毒全长侵染性克隆突变体，筛选获得病症显著减弱的弱毒株系。对于番木瓜环斑病毒西瓜株系而言，其与病毒致病性相关的氨基酸位点目前还未有报道，因此明确调控病毒致病性的氨基酸位点的难度极大。
本发明以PRSV-W全长侵染性cDNA克隆为基础，通过定点突变技术在PRSV-W的HC-Pro基因中定点引入突变，明确了调控病毒致病力的氨基酸位点，获得了致病力显著下降的PRSV-W弱毒突变体；发现弱毒突变体K125D、G317K和N137A对PRSV-W强毒株系有良好的交叉保护效果，可保护甜瓜和西葫芦植株免受强毒株系侵染。
其中，弱毒突变体K125D是番木瓜环斑病毒西瓜株系HC-Pro基因编码的蛋白第125位氨基酸由K突变为D，其氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示；弱毒突变体G317K是番木瓜环斑病毒西瓜株系HC-Pro基因编码的蛋白第317位氨基酸由G突变为K，其氨基酸序列如SEQ IDNO.22所示；弱毒突变体N137A是番木瓜环斑病毒西瓜株系HC-Pro基因编码的蛋白第137位氨基酸由N突变为A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示。
在本发明的一种实施方案中，为研制番木瓜环斑病毒西瓜株系弱毒疫苗，采用的方法如下：
(1)突变体的获得：根据氨基酸位点保守性及功能结构域预测，选取PRSV-W的HC-Pro第26、57、125、126、137、317、328、346、375和417位共10个保守氨基酸位点。根据Liu等(2008)的方法设计突变引物，以自主构建的PRSV-W侵染性cDNA克隆为基础，通过PCR在这些位点引入突变。
(2)弱毒疫苗的筛选：通过农杆菌浸润法将(1)中获得的突变体接种到甜瓜植株，观察寄主的症状变化，筛选出致病力明显降低的弱毒突变体。
(3)交叉保护效果测定：在接种弱毒疫苗后间隔不同的天数，接种PRSV-W强毒株系，观察弱毒疫苗对强毒株系的交叉保护效果。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
本发明实施例中所采用的引物序列如下表：
Figure BDA0001711423390000041
利用上述引物1和2，可把HC-Pro第26位的C突变为A，引物3和4可将HC-Pro第57位的C突变为A，引物5和6可将HC-Pro第125位的K突变为D，引物7和8可将HC-Pro第126位的K突变为D，引物9和10可将HC-Pro第137位的N突变为A，引物11和12可将HC-Pro第317位的G突变为K，引物13和14可将HC-Pro第328位的P突变为A，引物15和16可将HC-Pro第346位的N突变为A，引物17和18可将HC-Pro第375位的L突变为A，引物19和20可将HC-Pro第417位的V突变为A。粗体字代表突变的核苷酸位点。
实施例1：定点突变
以带有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)标签的番木瓜环斑病毒西瓜株系全长侵染性cDNA克隆pCamPRSV-W-GFP为模板，利用PCR进行突变，所用DNA聚合酶为Phusion高保真聚合酶。
突变PCR反应体系：
Figure BDA0001711423390000051
上述突变PCR反应体系中，引物1和引物2可以分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物，或者SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的引物，……或者SEQ ID No.19和SEQID No.20所示的引物，用于将HC-Pro不同位点的氨基酸进行突变。
PCR反应程序：98℃预变性30s；98℃变性10s，Tm no+3℃退火20s，72℃延伸9min30s，15个循环；98℃变性10s，Tm pp+3℃退火20s，72℃延伸30min，4℃保存。Tm no和Tmpp由引物及所用DNA聚合酶决定。
反应结束后，取10μL进行琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物大小是否正确。加入1μLDpn I，混匀，37℃沙浴4h消解模板DNA，然后加入2.5倍体积的无水乙醇(100μL)，5μL 3MNaAc(pH＝8.0)，混匀后过夜沉淀。10000g 4℃离心10min，弃去上清，用75％的乙醇洗涤后干燥沉淀，加10μL ddH2O溶解。然后将突变产物转化大肠杆菌DH5α超级感受态细胞，挑取单菌落进行摇菌，提取质粒。送测序公司检测是否突变成功。
实施例2：病毒的接种
将pCamPRSV-W-GFP及突变质粒转化农杆菌GV3101感受态细胞，经菌落PCR验证后，挑单斑接种于2mL含有卡那霉素(50μg/mL)、利福霉素(50μg/mL)、四环素(5μg/mL)的液体LB培养基中，28℃180r/min振荡培养24h。取500μL菌液加至5mL含10mM 2-(N-吗啉)-乙基磺酸(MES)和20μM乙酰丁香酮(AS)及与上步相同抗生素的LB培养基中，28℃200r/min振荡培养至对数生长期，需要12h左右。离心收集菌体，用重悬液(10mM MgCl2，10mM MES，0.15mM AS)轻轻重悬菌体，调整OD600值为0.5～0.6，28℃静置3h。用10μL的移液器枪头在植株子叶背面刺一小孔，用1mL无针头的医用一次性注射器吸取菌液，注入子叶，使菌液布满两个子叶即可。处理完的植株放在28℃光照培养箱中培养(16h光照/8h黑暗)。
实施例3：症状观察及病毒积累水平检测
接种后第15天，观察接种植株的症状，并采集系统叶片提取RNA和蛋白，通过RT-PCR检测突变体是否成功侵染寄主，通过Western blotting检测病毒积累水平。带有GFP标签的野生型PRSV-W在甜瓜(Cucumis melo)系统叶片上引起严重的花叶、褪绿、斑驳和畸形等症状，紫外灯下可见明显的绿色荧光；而接种突变体的甜瓜植株无明显症状，紫外灯下荧光较弱，沿叶脉或在叶肉中呈块状分布，甚至观察不到荧光(图1)。检测结果表明突变体没有回复突变为野生型，发明人将这些弱毒突变体分别命名为gC26A、gC57A、gK125D、gK126D、gN137A、gG317K、gP328A、gN346A、gL375A、gV417A。Western blotting检测表明，突变体的病毒积累水平与野生型相比明显降低(图2)。
实施例4：弱毒突变体的交叉保护效果测定
确定能够降低病毒致病力的HC-Pro氨基酸位点后，以不携带绿色荧光蛋白(GFP)标签的番木瓜环斑病毒西瓜株系全长侵染性克隆pCamPRSV为模板，按照实施例1中的方法进行定点突变，得到7个不携带GFP标签的弱毒突变体，命名为C57A、K125D、N137A、G317K、P328A、N346A和V417A。
选取子叶期的甜瓜植株，通过农杆菌浸润将弱毒突变体C57A、K125D、G317K、P328A接种到甜瓜子叶，保护接种第3天、5天和10天后通过汁液摩擦将带有GFP标签的PRSV-W强毒株系挑战接种到甜瓜植株的系统叶片。同样选取子叶完全展开的西葫芦植株，农杆菌浸润接种弱毒突变体N137A、N346A和V417A(保护接种)。保护接种后分别于5天、10天和15天汁液摩擦接种携带GFP标签的PRSV-W强毒株系。每个处理接种6棵，重复3次。
挑战接种强毒株系后第10天观察甜瓜植株症状并采集上部系统叶片检测GFP积累水平。只接种强毒株系的甜瓜植株表现严重的褪绿、花叶和斑驳症状，紫外灯下绿色荧光较强。间隔保护期为3天时，上部系统叶片表现明显的褪绿、花叶、泡斑和卷曲等症状，在紫外灯下绿色荧光较强。间隔保护期为5天时，保护接种弱毒突变体C57A、P328A的植株叶片表现褪绿和花叶症状，在紫外灯下观察到绿色荧光主要沿叶脉分布，少许分布在叶肉组织中；接种弱毒突变体K125D、G317K的植株叶片仅表现轻微的脉明，紫外灯下绿色荧光沿叶脉零星分布。间隔保护期为10天时，保护接种弱毒突变体C57A、P328A的植株叶片表现出轻微的褪绿症状，紫外灯下绿色荧光在叶肉组织中呈块状分布；保护接种弱毒突变体K125D、G317K的植株无明显症状，在紫外灯下仅G317K有微弱荧光，保护效果100％(图3)。
ELISA检测结果表明，间隔保护期为3天时，各突变体的病毒积累水平均比较高；间隔保护期为5天时，病毒积累水平均有所下降，其中弱毒突变体K125D和G317K低于C57A和P328A；间隔保护期为10天时，保护接种弱毒突变体K125D和G317K的植株病毒积累量显著降低，弱毒突变体P328A病毒积累量与野生型相比下降幅度不大(图4)。
在挑战接种后的第15天调查西葫芦发病状况。间隔保护期为5天时，在可见光下接种强毒的西葫芦和预先接种N137A、N346A和V417A三个弱毒突变体的西葫芦顶部叶片症状不显著，但是在紫外灯下均出现明显的绿色荧光，说明N137A、N346A和V417A无保护效果；间隔保护期为10天时，在可见光下预先接种V417A的西葫芦顶部叶片出现较轻微脉明，预先接种N137A和N346A的西葫芦无明显症状，在紫外灯下预先接种N346A、V417A的西葫芦与只接种强毒的西葫芦均有明显的绿色荧光，预先接种N137A的西葫芦无绿色荧光，说明N346A和V417A两个弱毒株系无保护效果，N137A的保护效果为100％；间隔期为15天时，N346A对强毒株系的保护效果为26.6％，N137A的保护效果为100％(图5)。
Western blotting检测表明，间隔保护期为10天的处理中，预先接种弱毒突变体N137A的西葫芦植株的病毒积累水平明显低于只接种强毒的植株，且几乎检测不到GFP的存在，而预先接种弱毒突变体N346A和V417A的西葫芦植株的病毒积累水平与只接种强毒株系的植株差异不显著(图6)。
以上结果表明，在甜瓜植株中，弱毒疫苗K125D(SEQ ID No.21)、G317K(SEQ IDNo.22)在间隔保护期为10天时就能对强毒株系有良好的交叉保护效果，有效保护甜瓜植株免受PRSV-W强毒株系的侵染；在西葫芦植株中，弱毒疫苗N137A(SEQ ID No.23)对PRSV-W强毒株系的交叉保护效果最好。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东农业大学
<120> 番木瓜环斑病毒西瓜株系弱毒疫苗的研制及其应用
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tgcacgcgat tgattcattt ggatctgtag actctg 36
<210> 20
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
caatcgcgtg cattgttttc tgtcggtgat c 31
<210> 21
<211> 457
<212> PRT
<213> 弱毒突变体K125D的辅助成分-蛋白酶（Helper component-proteinase）
<400> 21
Asn Asp Val Ala Glu Lys Phe Trp Leu Gly Phe Asn Arg Ala Phe Leu
1 5 10 15
Arg His Arg Lys Pro Thr Asp His Val Cys Thr Ser Asp Met Asp Val
20 25 30
Thr Met Cys Gly Glu Val Ala Ala Leu Ala Thr Ile Ile Leu Phe Pro
35 40 45
Cys His Lys Ile Thr Cys Asn Thr Cys Met Asn Lys Val Lys Gly Arg
50 55 60
Val Ile Asp Glu Val Gly Glu Asp Leu Asn Cys Glu Leu Glu Arg Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Leu Ser Ser Tyr Gly Gly Ser Phe Gly His Val Ser Thr
85 90 95
Leu Leu Asp Gln Leu Asn Arg Val Leu Asn Ala Arg Asn Met Asn Asp
100 105 110
Gly Ala Phe Lys Glu Ile Ala Lys Lys Ile Asp Glu Asp Lys Glu Ser
115 120 125
Pro Trp Thr His Met Thr Ala Ile Asn Asn Thr Leu Ile Lys Gly Ser
130 135 140
Leu Ala Thr Gly Tyr Glu Phe Glu Arg Ala Ser Asp Ser Leu Arg Glu
145 150 155 160
Ile Val Arg Trp His Leu Lys Arg Thr Glu Ser Ile Lys Ala Gly Ser
165 170 175
Val Glu Ser Phe Arg Asn Lys Arg Ser Gly Lys Ala His Phe Asn Pro
180 185 190
Ala Leu Thr Cys Asp Asn Gln Leu Asp Arg Asn Gly Asn Phe Leu Trp
195 200 205
Gly Glu Arg Gln Tyr His Ala Lys Arg Phe Phe Ala Asn Tyr Phe Glu
210 215 220
Lys Ile Asp His Ser Lys Gly Tyr Glu Tyr Tyr Ser Gln Arg Gln Asn
225 230 235 240
Pro Asn Gly Ile Arg Lys Ile Ala Ile Gly Asn Leu Ile Phe Ser Thr
245 250 255
Asn Leu Glu Arg Phe Arg Gln Gln Met Val Glu His His Ile Asp Gln
260 265 270
Gly Pro Ile Thr Arg Glu Cys Ile Ala Leu Arg Asn Asn Asn Tyr Val
275 280 285
His Val Cys Ser Cys Val Thr Leu Asp Asp Gly Thr Pro Ala Thr Ser
290 295 300
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305 310 315 320
Asp Pro Lys Tyr Val Asp Leu Pro Thr Leu Glu Ser Asp Ser Met Tyr
325 330 335
Ile Ala Lys Lys Gly Tyr Cys Tyr Met Asn Ile Phe Leu Ala Met Leu
340 345 350
Ile Asn Ile Pro Glu Asn Glu Ala Lys Asp Phe Thr Lys Arg Val Arg
355 360 365
Asp Leu Val Gly Ser Lys Leu Gly Glu Trp Pro Thr Met Leu Asp Val
370 375 380
Ala Thr Cys Ala Asn Gln Leu Ile Ile Phe His Pro Asp Ala Ala Asn
385 390 395 400
Ala Glu Leu Pro Arg Ile Leu Val Asp His Arg Gln Lys Thr Met His
405 410 415
Val Ile Asp Ser Phe Gly Ser Val Asp Ser Gly Tyr His Ile Leu Lys
420 425 430
Ala Asn Thr Val Asn Gln Leu Ile Gln Phe Ala Arg Glu Pro Leu Asp
435 440 445
Ser Glu Met Lys His Tyr Ile Val Gly
450 455
<210> 22
<211> 457
<212> PRT
<213> 弱毒突变体G317K的辅助成分-蛋白酶（Helper component-proteinase）
<400> 22
Asn Asp Val Ala Glu Lys Phe Trp Leu Gly Phe Asn Arg Ala Phe Leu
1 5 10 15
Arg His Arg Lys Pro Thr Asp His Val Cys Thr Ser Asp Met Asp Val
20 25 30
Thr Met Cys Gly Glu Val Ala Ala Leu Ala Thr Ile Ile Leu Phe Pro
35 40 45
Cys His Lys Ile Thr Cys Asn Thr Cys Met Asn Lys Val Lys Gly Arg
50 55 60
Val Ile Asp Glu Val Gly Glu Asp Leu Asn Cys Glu Leu Glu Arg Leu
65 70 75 80
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85 90 95
Leu Leu Asp Gln Leu Asn Arg Val Leu Asn Ala Arg Asn Met Asn Asp
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130 135 140
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165 170 175
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210 215 220
Lys Ile Asp His Ser Lys Gly Tyr Glu Tyr Tyr Ser Gln Arg Gln Asn
225 230 235 240
Pro Asn Gly Ile Arg Lys Ile Ala Ile Gly Asn Leu Ile Phe Ser Thr
245 250 255
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275 280 285
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290 295 300
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370 375 380
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385 390 395 400
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450 455
<210> 23
<211> 457
<212> PRT
<213> 弱毒突变体N137A的辅助成分-蛋白酶（Helper component-proteinase）
<400> 23
Asn Asp Val Ala Glu Lys Phe Trp Leu Gly Phe Asn Arg Ala Phe Leu
1 5 10 15
Arg His Arg Lys Pro Thr Asp His Val Cys Thr Ser Asp Met Asp Val
20 25 30
Thr Met Cys Gly Glu Val Ala Ala Leu Ala Thr Ile Ile Leu Phe Pro
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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165 170 175
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225 230 235 240
Pro Asn Gly Ile Arg Lys Ile Ala Ile Gly Asn Leu Ile Phe Ser Thr
245 250 255
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260 265 270
Gly Pro Ile Thr Arg Glu Cys Ile Ala Leu Arg Asn Asn Asn Tyr Val
275 280 285
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290 295 300
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325 330 335
Ile Ala Lys Lys Gly Tyr Cys Tyr Met Asn Ile Phe Leu Ala Met Leu
340 345 350
Ile Asn Ile Pro Glu Asn Glu Ala Lys Asp Phe Thr Lys Arg Val Arg
355 360 365
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405 410 415
Val Ile Asp Ser Phe Gly Ser Val Asp Ser Gly Tyr His Ile Leu Lys
420 425 430
Ala Asn Thr Val Asn Gln Leu Ile Gln Phe Ala Arg Glu Pro Leu Asp
435 440 445
Ser Glu Met Lys His Tyr Ile Val Gly
450 455

Claims (7)

1.番木瓜环斑病毒西瓜株系（Papaya ringspot virus-watermelon strain，PRSV-W）弱毒突变体在防治PRSV-W强毒株系侵染方面的应用；
所述番木瓜环斑病毒西瓜株系弱毒突变体包括：弱毒突变体K125D、弱毒突变体G317K和弱毒突变体N137A；
弱毒突变体K125D是番木瓜环斑病毒西瓜株系辅助成分-蛋白酶HC-Pro基因编码的蛋白第125位氨基酸由K突变为D，其氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示；弱毒突变体G317K是番木瓜环斑病毒西瓜株系HC-Pro基因编码的蛋白第317位氨基酸由G突变为K，其氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示；弱毒突变体N137A是番木瓜环斑病毒西瓜株系HC-Pro基因编码的蛋白第137位氨基酸由N突变为A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述防治PRSV-W强毒株系侵染是通过提供交叉保护作用实现的。
3.一种番木瓜环斑病毒西瓜株系弱毒疫苗，其特征在于，其有效成分为权利要求1所述的番木瓜环斑病毒西瓜株系弱毒突变体。
4.根据权利要求3所述的番木瓜环斑病毒西瓜株系弱毒疫苗，其特征在于，可通过以下步骤获得：
利用PCR技术在PRSV-W的辅助成分-蛋白酶HC-Pro基因中定点引入突变以获得突变体K125D、G317K和N137A，突变体的辅助成分-蛋白酶HC-Pro基因编码的氨基酸序列分别如SEQID NO.21、SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示；接种寄主植物筛选得到HC-Pro第125位、317位和137位氨基酸发生突变的弱毒疫苗K125D、G317K和N137A。
5.权利要求3或4所述的番木瓜环斑病毒西瓜株系弱毒疫苗在防治PRSV-W强毒株系侵染方面的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，番木瓜环斑病毒西瓜株系弱毒疫苗K125D或G317K可以交叉保护甜瓜植株免受PRSV-W强毒株系的侵染。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，番木瓜环斑病毒西瓜株系弱毒疫苗N137A可以交叉保护西葫芦植株免受PRSV-W强毒株系的侵染。
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