KR20120043927A - 컬토바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 컬토바이러스 검출방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트로 이루어진 컬토바이러스 (curtovirus)에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머 세트는 컬토바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 새로운 프라이머 세트로서, 이를 이용하여 PCR을 수행하는 경우 컬토바이러스 감염이 의심되는 식물 시료들로부터 컬토바이러스 감염을 정확하고 신속하게 진단할 수 있으므로 산업 및 검역 현장 등에서 유용하게 사용할 수 있다. 특히 컬토바이러스는 주요 경제작물에 발생하기 때문에, 본 바이러스의 조기 검출로 인한 농가에 피해를 최소화하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

컬토바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 컬토바이러스 검출방법{Primer Set for Detecting Curtovirus and Method for Detecting Curtovirus Using The Same}
본 발명은 컬토바이러스를 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 이용하여 식물체로부터 컬토바이러스를 검출하는 방법에 관한 것이다.
바이러스 진단법으로 과거에는 전자현미경과 혈청학적 방법 (ELISA)을 주로 사용하였다. 전자현미경을 이용한 방법은 바이러스의 존재를 확인할 수는 있지만 형태학적 특징으로 종을 진단하기는 거의 불가능하다. 혈청학적 방법 중 ELISA 방법은 가장 일반적으로 사용하는 진단 방법이나 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, 이하에서는 간단하게 ‘PCR’이라 함) 진단법보다 검출감도가 약 1000배 정도 낮으며, 항체와 검사시료의 예상하지 못한 비특이적 반응으로 진단이 실패하는 경우가 종종 발생한다.
현재 바이러스 진단에서는 높은 검출감도와 편리성을 가지고 있는 PCR 방법을 가장 일반적으로 사용하고 있는데, 병원체의 PCR 진단을 위해서는 종 특이 프라이머의 개발이 매우 중요하다.
한편 제미니바이러스 (Geminivirus)는 네 개의 속 (genus-Mastrevirus, Curtovirus, Topocuvirus, Begomovirus)으로 나뉘며, 주요 경제작물에 피해를 주는 것으로 알려져 있다.
제미니바이러스의 한 속 (genus)인 마스트레바이러스 (Mastrevirus)는 매미충 (leafhopper)에 의해 매개되며 2.7kb 크기의 단일 게놈으로 구성된다. 마스트레바이러스는 옥수수, 사탕수수와 같이 외떡잎 식물에 감염되며, 몇몇 종은 쌍떡잎 식물에도 감염되는 것으로 알려져 있다. 토포쿠바이러스 (Topocuvirus)도 제미니바이러스의 한 속으로 뿔매미 (treehopper)에 의해 매개되며 쌍떡잎 식물에 피해를 주는 것으로 알려져 있다.
또 다른 제미니바이러스의 한 속 (genus)인 베고모바이러스 (Begomovirus)는 제미니바이러스 중 가장 많은 바이러스들을 포함하고 있으며 담배가루이 (whitefly)에 의해 매개되는 특징을 갖고 있다. 따라서, 제미니바이러스에 관련된 연구는 담배가루이가 서식하기 알맞은 열대 또는 아열대 기후 지역에서 보고된 것이 많다. 아시아 지역에서는 1960년대에 중국의 토마토 재배 지역에서 제미니바이러스가 관찰된다는 보고가 있었으나 일부 지역에 국한되어 있었고 피해 정도가 경미해 연구가 거의 이루어지지 않았다. 그러나 최근 10년 사이에는 아시아 지역 주요 국가들의 토마토 재배 지역에서 담배가루이가 관찰되었고 이 후 제미니바이러스가 검출된다는 보고가 급증하였다. 중국, 일본, 대만 등 아시아 지역에서 보고되는 베고모바이러스들에는 토마토잎말림바이러스 (ToLCV: Tomato leaf curl virus), 토마토황화잎말림바이러스 (TYLCV: Tomato yellow leaf curl virus), 담배잎말림바이러스 (TbLCV: Tobacco leaf curl virus), 무늬인동식물감염바이러스 (HYVV: Honeysuckle yellow vein virus), 고구마잎말림바이러스 (SPLCV: Sweet potato leaf curl virus) 등이 주를 이루고 있다.
한편 제미니바이러스의 또 하나의 속 (genus)인 컬토바이러스 (Curtovirus)는 단일 가닥 DNA로 구성된 환형 바이러스로 유전자의 분자량은 2.6-2.8kb이다. 컬토바이러스는 매미충 (leafhopper)에 의해 매개되며, 쌍떡잎 식물에 감염되어 주요 경제작물에 피해를 주는 것으로 알려져 있다.
최근 국내에서 베고모바이러스인 토마토잎말림바이러스 (ToLCV: Tomato leaf curl virus), 토마토황화잎말림바이러스 (TYLCV: Tomato yellow leaf curl virus), 담배잎말림바이러스 (TbLCV: Tobacco leaf curl virus), 무늬인동식물감염바이러스 (HYVV: Honeysuckle yellow vein virus) 및 고구마잎말림바이러스 (SPLCV: Sweet potato leaf curl virus)가 발견되었고, 앞으로 새로운 제미니바이러스들이 유입되어 바이러스 간의 변이주 및 새로운 재조합 바이러스들이 출현할 것으로 예상된다.
이와 같이 다양한 하위 그룹 (속)을 갖는 제미니바이러스에 의한 주요 경제작물의 피해는 계속해서 증가하고 있는 실정이나, 제미니바이러스의 한 속 (genus)인 베고모바이러스를 검출하는 몇몇 기술 이외에, 컬토바이러스를 간단하면서도 신속 정확하게 검출할 수 있는 방법은 전무한 상태이다.
본 발명자들은 식물 감염 바이러스의 일종인 컬토바이러스의 정밀 검출 체계를 확립하고자 연구를 거듭한 결과, 컬토바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 새로운 프라이머 세트를 개발하고, 이를 이용하여 식물 시료에서 컬토바이러스를 효과적으로 검출할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은
서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트로 이루어진 컬토바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
또한 본 발명은
식물 시료에서 전체 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 전체 DNA를 주형으로 제1항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 컬토바이러스 검출방법을 제공한다.
본 발명의 프라이머 세트는 컬토바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 새로운 프라이머 세트로서, 이를 이용하여 PCR을 수행하는 경우 컬토바이러스 감염이 의심되는 식물 시료들로부터 컬토바이러스 감염을 정확하고 신속하게 진단할 수 있으므로 산업 및 검역 현장 등에서 유용하게 사용할 수 있다. 특히 컬토바이러스는 주요 경제작물에 발생하기 때문에, 본 바이러스의 조기 검출로 인한 농가에 피해를 최소화하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 컬토바이러스 게놈의 대략적인 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 컬토바이러스에 감염된 식물에서 컬토바이러스를 검출하기 위해 수행된 PCR 결과를 보여주는 사진이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은
서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트로 이루어진 컬토바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
컬토바이러스를 좀더 상세히 설명하면 다음과 같다.
컬토바이러스는 매미충 (leafhopper)에 의해 매개되며, 주로 쌍떡잎 식물을 감염시키는 바이러스이다. 이들은 하나의 게놈을 (monopartite)을 가지며, 환형의 단일 가닥 DNA를 유전체로 하는 특징을 가진다. 도 1은 컬토바이러스 게놈의 대략적인 모식도를 나타낸 것이다.
본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 검출될 수 있는 컬토바이러스는 구체적으로 비트컬리탑바이러스 (BCTV: Beet curly top virus), 비트마일드컬리탑바이러스 (BMCTV: Beet mild curly top virus), 비트시비어컬리탑바이러스 (BSCTV: Beet severe curly top virus), 호스래디쉬컬리탑바이러스 (HrCTV: Horseradish curly top virus), 페퍼컬리탑바이러스 (PepCTV: Pepper curly top virus), 스피니치컬리탑바이러스 (SpCTV: Spinach curly top virus) 및 페퍼옐로우드워프바이러스 (PeYDV: Pepper yellow dwarf virus) 등이 있다.
본 발명은 또한
식물 시료에서 전체 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 전체 DNA를 주형으로 제1항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 컬토바이러스 검출방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 식물은 컬토바이러스에 감염될 수 있는 식물이면 특별히 제한하는 것은 아니나, 사탕무우, 겨자무 (horseradish), 고추, 시금치, 토마토 및 담배 등일 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 식물 시료에서 전체 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다.
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 본 발명의 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 표적 서열을 증폭하기 위해 이용할 수 있는 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트이다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사선 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 하기 실시예에서는 겔 전기영동을 통해 수행되었다.
본 발명의 방법에 있어서, 검출되는 컬토바이러스의 종류로는 비트컬리탑바이러스 (BCTV: Beet curly top virus), 비트마일드컬리탑바이러스 (BMCTV: Beet mild curly top virus), 비트시비어컬리탑바이러스 (BSCTV: Beet severe curly top virus), 호스래디쉬컬리탑바이러스 (HrCTV: Horseradish curly top virus), 페퍼컬리탑바이러스 (PepCTV: Pepper curly top virus), 스피니치컬리탑바이러스 (SpCTV: Spinach curly top virus) 및 페퍼옐로우드워프바이러스 (PeYDV: Pepper yellow dwarf virus) 등이 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예를 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
[ 실시예 ]
실시예 1- 컬토바이러스 검출용 프라이머 세트 설계
본 발명의 프라이머 세트는 컬토바이러스들의 염기서열들을 수집하여 공통적으로 존재하는 염기서열을 전사해독틀인 ORF C1과 V2 유전자의 공통된 서열부분들을 이용하여 제작하였다. 각 프라이머 세트의 포워드는 ORF C1유전자를 리버스는 ORF V2 유전자의 염기서열 중 공통된 부분을 바탕으로 제작하였다. 즉, 제미니바이러스에서ORF C1유전자의 경우 복제에 관여하는 유전자로서 매우 보존적인 염기서열을 갖는 것으로 알려져 있기 때문에 포워드 부분으로 제작을 하였고, 바이러스를 분류하는데 이용되는 유전자 변이가 심한 유전자간 영역 (intergenic region)까지 포함하여 검출하기 위해서 유전자간 영역 (intergenic region) 다음으로 위치하는 ORF V2 유전자를 리버스로 제작하여 새로운 바이러스 또는 재조합된 바이러스도 검출할 수 있도록 제작하였다.
실시예 2- 본 발명의 프라이머 세트의 유용성 확인
실시예 2-1: 식물 시료의 확보
본 발명자들은 재배시설을 중심으로 제미니바이러스에 감염되었을 것으로 예상되는 식물 시료들을 확보하였다. 토마토황화잎말림바이러스 (TYLCV: Tomato yellow leaf curl virus)와 담배잎말림바이러스 (TbLCV: Tobacco leaf curl virus)에 감염된 식물시료들은 토마토 재배시설을 중심으로 하여 확보하였으며, 고구마 식물에서 고구마잎말림바이러스 (SPLCV: Sweet potato leaf curl virus)가 감염된 식물조직을, 무늬인동식물에서 무늬인동식물감염바이러스 (HYVV: Honeysuckle yellow vein virus)에 감염된 식물시료를 각각 확보하였다. 또한 비트시비어컬리탑바이러스 (BSCTV: Beet severe curly top virus)에 감염된 식물은 실험 배양조건에서 감염하여 시료를 확보하였다. BSCTV의 경우 우리나라에서는 아직 발견되지 않는 바이러스로서 인위적인 감염 시스템 (infectious clone)을 제작하여 식물에 감염한 후 시료를 확보하였다.
실시예 2-2: 전체 DNA 분리
제미니바이러스에 감염되었을 것으로 생각되는 식물시료들은 Dellaporta 방법을 이용하여 게놈 DNA를 추출하였다.
실시예 2-3: 중합효소연쇄반응 ( PCR : polymerase chain reaction )
상기 실시 예 2-1에서 확보한 식물 시료들의 조직에서 게놈 DNA를 추출한 후 50㎕에 희석하여 1㎕를 주형으로 사용하여 PCR을 시행하였다. PCR은 아래의 조건으로 실시하였다.
PCR은 반응완충액 (10배 농축액) 2㎕, 표 1의 프라이머 세트 5 pmol을 2㎕ (포워드와 리버스 각 1㎕), Taq DNA polymerase 1㎕, 2.5 mM dNTPs 3㎕를 넣고 증류수 11㎕를 첨가하여 총 20㎕의 반응액으로 만들었다. PCR은 반응액을 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 1분간 반응시킨 후 72℃에서 1분 동안 합성하는 과정을 35회 반복하였다.
본 발명의 프라이머 세트
종류 프라이머 염기서열(5'→3') 크기
( bp ) 		유전자영역 반응생성물
사이즈( bp )
포워드 서열번호1 ACG TCA TCA ATG ACG TTA TA 20 C
~1000
리버스 서열번호2 GTA GAC AGA CCA TCA TTT ATA 21 V
PCR 산물은 1% 아가로스 겔에서 분석하였다.
그 결과 도 2에 나타난 바와 같이 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 을 시행한 결과, 베고모바이러스의 종류에 속하는 토마토황화잎말림바이러스 (TYLCV: Tomato yellow leaf curl virus), 담배잎말림바이러스 (TbLCV: Tobacco leaf curl virus), 무늬인동식물감염바이러스 (HYVV: Honeysuckle yellow vein virus) 및 고구마잎말림바이러스 (SPLCV: Sweet potato leaf curl virus)에 감염된 식물의 게놈 DNA에서는 PCR을 통해 증폭산물을 확인할 수 없는 반면, 컬토바이러스에 속하는 대표 바이러스인 비트시비어컬리탑바이러스 (BSCTV: Beet severe curly top virus)가 감염된 식물 게놈 DNA에서만 PCR을 통해 증폭산물을 확인할 수 있었다. 이를 통해 본 발명의 프라이머 세트는 컬토바이러스를 특이적으로 검출할 수 있음이 판명되었다.
<110> SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration <120> Primer Set for Detecting Curtovirus and Method for Detecting Curtovirus Using The Same <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for detecting curtovirus <400> 1 acgtcatcaa tgacgttata 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for detecting curtovirus <400> 2 gtagacagac catcatttat a 21

Claims (4)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트로 이루어진 컬토바이러스 검출용 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 컬토바이러스는 비트컬리탑바이러스 (BCTV: Beet curly top virus), 비트마일드컬리탑바이러스 (BMCTV: Beet mild curly top virus), 비트시비어컬리탑바이러스 (BSCTV: Beet severe curly top virus), 호스래디쉬컬리탑바이러스 (HrCTV: Horseradish curly top virus), 페퍼컬리탑바이러스 (PepCTV: Pepper curly top virus), 스피니치컬리탑바이러스 (SpCTV: Spinach curly top virus) 및 페퍼옐로우드워프바이러스 (PeYDV: Pepper yellow dwarf virus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 컬토바이러스 검출용 프라이머 세트.
  3. 식물 시료에서 전체 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 전체 DNA를 주형으로 제1항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 컬토바이러스 검출방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 컬토바이러스는 비트컬리탑바이러스 (BCTV: Beet curly top virus), 비트마일드컬리탑바이러스 (BMCTV: Beet mild curly top virus), 비트시비어컬리탑바이러스 (BSCTV: Beet severe curly top virus), 호스래디쉬컬리탑바이러스 (HrCTV: Horseradish curly top virus), 페퍼컬리탑바이러스 (PepCTV: Pepper curly top virus), 스피니치컬리탑바이러스 (SpCTV: Spinach curly top virus) 및 페퍼옐로우드워프바이러스 (PeYDV: Pepper yellow dwarf virus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 컬토바이러스 검출용 프라이머 세트.
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CN110129339B (zh) * 2019-05-10 2020-11-03 中国计量大学 龙葵曲顶病毒全基因组序列及其检测方法

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