KR102201162B1 - 오이모자이크바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents
오이모자이크바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 다양한 작물에 감염하는 오이모자이크바이러스(Cucumber mosaic virus, CMV)를 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 검출방법에 관한 것으로, 본 발명의 재조합-중합효소 증폭법(RPA)에 최적화된 프라이머 세트를 이용하면 기존의 PCR을 이용한 검출 방법보다 빠른고 신속하게 오이모자이크바이러스(CMV)를 검출할 수 있으며, 소량의 시료로도 현장에서 오이모자이크바이러스(CMV)를 진단하므로 매우 유용하다.
Description
본 발명은 다양한 작물에 감염하는 오이모자이크바이러스(Cucumber mosaic virus, CMV)를 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 검출방법에 관한 것이다.
식물바이러스는 작물에 이상증상을 일으켜 작물의 생산량 및 품질저하를 야기하여 작물의 경제적 가치를 떨어뜨린다. 작물에 피해를 끼치는 다른 병원균들과 달리 식물바이러스는 치료 및 화학적 방제가 불가능하다고 알려져 있다. 때문에 식물바이러스에 감염된 작물은 발견 즉시 제거 및 격리하여 바이러스 전파에 의한 2차 피해를 막는 것이 중요하며, 신속하고 정확한 바이러스의 진단이 식물바이러스에 의한 피해와 확산을 막기 위해 필요하다.
오이모자이크바이러스(CMV)는 Bromoviridae의 Cucumovirus genus에 속하는 식물바이러스로 전 세계적으로 85과 1000종 이상의 식물에 감염하는 것으로 알려져 있으며, 국내에도 다양한 종의 식물에 감염한다는 보고가 많이 존재한다. 오이모자이크바이러스(CMV)는 이렇듯 다양한 작물에 감염하여 작물의 품질 저하 및 생산량을 감소시켜 많은 경제적 피해를 야기한다. 또한 이러한 넓은 기주범위를 바탕으로 CMV는 종내의 유전적 다양성이 크기 때문에 혈청학적 유연관계 및 외피단백질 염기서열의 특이성에 따라 subgroup I 과 II로 구분된다.
종래의 바이러스 진단법으로는 전자현미경을 통한 직접관찰, 혈청학적방법 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay; ELISA) 및 PCR 중합효소 연쇄 반응(Polymerase chain reaction; PCR) 기법을 사용하였다. 전자현미경을 통한 직접 관찰은 바이러스 입자의 유무로 바이러스의 존재는 확인 가능하지만 바이러스의 종단위의 구분은 불가능하다. ELISA는 가장 일반적으로 사용되는 혈청학적방법으로 PCR 진단법보다 검출 감도가 약 1000배 이하로 낮으며, 비특이적 반응이 자주 발견되어 정확한 진단에는 적합하지 못하다.
따라서 최근에는 식물바이러스의 진단에 PCR 진단법을 많이 사용하고 있다. PCR 진단법은 RNA 바이러스의 경우 역전사 과정까지 포함하여 평균적으로 2시간 이상의 반응시간이 필요하며, 효소의 작용을 위해 온도조절이 가능한 전문장비가 필요하다. 또한 바이러스에 맞는 특이적인 프라이머(primer)의 개발이 매우 중요하며, 증폭된 반응산물을 전기영동으로 확인할 때 추가적인 시간 및 장비가 필요로 하게 된다. 이렇듯 진단의 확인까지 일련의 전문적인 과정이 존재하며 이를 실행할 수 있는 전문 인력 및 시간이 요구되므로 현장에서의 활용성은 현저히 떨어진다.
이에 본 발명자들은 기존의 PCR의 단점을 보완하는 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification, RPA)을 이용하여 오이모자이크바이러스(CMV)를 진단할 수 있는 프라이머 세트를 선발하여 본 발명을 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프라이머를 포함하는 오이모자이크바이러스(Cucumber mosaic virus, CMV) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 식물 시료에서 전체 RNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 RNA를 주형으로 하고, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프라이머를 이용하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 오이모자이크바이러스(CMV) 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프라이머; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 오이모자이크바이러스(CMV) 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 재조합-중합효소 증폭법(RPA)에 최적화된 프라이머 세트를 이용하면 기존의 PCR을 이용한 검출 방법보다 빠르고 신속하게 오이모자이크바이러스(CMV)를 검출할 수 있으며, 소량의 시료로도 현장에서 오이모자이크바이러스(CMV)를 진단하므로 매우 유용하다.
도 1은 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification, RPA) 원리를 나타낸 모식도이다.
도 2는 오이모자이크바이러스(CMV)의 서열내의 프라이머 위치를 나타낸 그림이다.
도 3은 제작한 프라이머를 이용한 (A) RT-PCR 및 (B) RT-RPA 증폭산물을 전기영동한 결과를 나타낸 사진이다.
도 4는 제작한 프라이머를 이용한 (A) RT-PCR 및 (B) RT-RPA 증폭산물을 전기영동하여 RNA의 민감도를 확인한 사진이다.
도 5는 오이모자이크바이러스(CMV)가 접종된 식물체에서 추출한 RNA로 RT-RPA를 수행한 다음 RT-RPA 증폭산물을 SYBR Green I을 이용하여 자연광원 및 UV 하에서 확인하여 그 민감도를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 오이모자이크바이러스(CMV)가 접종된 식물체에서 추출한 RNA로 RT-RPA를 수행한 다음 RT-RPA 증폭산물에 제합효소(EcoR I, Xho I)를 처리하여 CMV subgroup I과 subgroup II를 구분 및 확인한 사진이다.
도 2는 오이모자이크바이러스(CMV)의 서열내의 프라이머 위치를 나타낸 그림이다.
도 3은 제작한 프라이머를 이용한 (A) RT-PCR 및 (B) RT-RPA 증폭산물을 전기영동한 결과를 나타낸 사진이다.
도 4는 제작한 프라이머를 이용한 (A) RT-PCR 및 (B) RT-RPA 증폭산물을 전기영동하여 RNA의 민감도를 확인한 사진이다.
도 5는 오이모자이크바이러스(CMV)가 접종된 식물체에서 추출한 RNA로 RT-RPA를 수행한 다음 RT-RPA 증폭산물을 SYBR Green I을 이용하여 자연광원 및 UV 하에서 확인하여 그 민감도를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 오이모자이크바이러스(CMV)가 접종된 식물체에서 추출한 RNA로 RT-RPA를 수행한 다음 RT-RPA 증폭산물에 제합효소(EcoR I, Xho I)를 처리하여 CMV subgroup I과 subgroup II를 구분 및 확인한 사진이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 기존의 PCR(polymerase chain reaction)의 단점을 보완하기 위하여 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification, RPA)을 이용하였다. RPA 방법은 PCR 기술 기반의 DNA 및 RNA 증폭을 확인할 수 있는 기술이다. 기존 PCR 방법과는 다르게 RPA 방법은 DNA 결합 단백질(binding protein)과 재조합효소(recombinase)를 이용하여 빠르고 정확하게 타겟 시퀀스(target sequence)를 증폭시킬 수 있고, 등온의 중합효소(mesophilic polymerase)를 이용하여 등온조건에서도 증폭이 가능하므로 특별한 장비 없이 등온장치만 있으면 빠른 시간 안에 바이러스를 검출 및 진단할 수 있다(도 1 참조). 이러한 RPA 방법에는 비특이적 반응이 종종 발생하므로 이를 방지하기 위한 적합한 프라이머의 제작이 중요하다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프라이머를 포함하는 오이모자이크바이러스(Cucumber mosaic virus, CMV) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프라이머는 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification, RPA)에 이용하기 적합하게 제작하였으며(도 2 참조), 특히 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프라이머는 재조합-중합효소 증폭법(RPA)을 이용하였을 때 나타나는 비특이적 반응이 일어나지 않은 최적의 프라이머 세트이다(도 3 참조).
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다
또한, 본 발명은 식물 시료에서 전체 RNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 RNA를 주형으로 하고, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프라이머를 이용하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 오이모자이크바이러스(CMV) 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 증폭 반응은 재조합-중합효소 증폭법(RPA)에 이용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프라이머는 시료에 포함된 RNA 양이 3000×10-8까지 검출이 가능하므로 민감도가 매우 높음을 확인하여 극소량의 바이러스도 검출이 가능하다(도 4 참조).
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기 영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 상기 증폭 산물의 검출은 SYBR Green I을 이용하여 자연광원 및 UV하에서 쉽게 결과를 육안으로 확인할 수 있다(도 5 참조).
본 발명의 증폭산물에 직접 제한효소를 처리할 수 있으며 본 발명의 제한효소는 EcoR I 또는 Xho I를 이용할 수 있고, 본 발명의 제한효소를 이용하면 오이모자이크바이러스(CMV) subgroup I과 subgroup II를 구별할 수 있다(도 6 참조)
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프라이머; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 오이모자이크바이러스(CMV) 검출용 키트를 제공한다.
서열번호 1의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프라이머를 포함하는 오이모자이크바이러스(CMV) 검출용 프라이머 세트를 이용하면 가지과(고추, 가지, 토마토, 파프리카 등), 박과(오이, 쥬키니, 호박 등), 십자화과(배추, 무, 적갓 등), 콩과(대두, 완두, 팥 등), 화훼류(백합, 백일홍, 천일홍 등), 특용작물(들깨, 명월초, 초석잠, 황기 등)과 같은 다양한 작물들에서 오이모자이크바이러스(CMV)를 신속하고 정확하게 검정하며 오이모자이크바이러스(CMV)의 subgroup을 구분하는 것까지 가능하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 오이모자이크바이러스(CMV) 바이러스 추출
담배(Nicotiana benthamiana)에서 증식된 subgroup I에 속하는 CMV-Rs1 및 subgroup II에 속하는 CMV-Gyp의 전체 RNA를 추출하여 실험에 사용하였다.
<실시예 2> 프라이머 세트 제작
바이러스를 검출하기 위한 프라이머 세트를 제작하기 위해 NCBI Basic Local Alignment Search Tool를 이용하여 오이모자이크바이러스(CMV) 13개(subgroup I, 10개; subgroup II, 3개)로 분리하여 정리했다. 이를 ClustalW multiple sequence alignment를 통해 보존이 잘 된 지역(region)을 정하고 subgroup I, II를 모두 검출할 수 있는 5' 프라이머 2개 및 3' 프라이머 1개를 제작하였다(표 1 및 도 2).
<실시예 3> 프라이머 세트 검정
상기 실시예 1에서 오이모자이크바이러스(CMV)를 단독 접종 시킨 담배로부터 RNA를 추출하고 추출한 RNA를 각각 약 1,500ng을 실시예 2에서 제작한 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR 및 RT-RPA 반응을 진행하였다.
구체적으로, RT-PCR은 역전사를 42℃에서 1시간 하고, 92℃에서 5분 동안 진행하며, PCR은 95℃ 3분, 95℃에서 30초간 변성(denaturation), 65℃에서 결합(annealing), 72℃에서 신장(elongation)을 35 사이클 반복하고, 72℃에서 5분간 두었다. RPA은 40℃에서 40분간 진행하였다. 3% 아가로스 겔에 50분 동안 로딩하여 증폭산물을 확인하였다. RPA은 40℃에서 40분간 진행하였다. 그런 다음 3% 아가로스 겔에 50분 동안 로딩하여 증폭산물을 확인하였다.
그 결과, "RPA CMV F-2"를 5' 프라이머로 사용하였을 때, PCR에서는 정확한 타겟 바이러스가 검출되었지만, RPA 반응에서는 비특이적 반응이 다수 나타났고 타겟 바이러스도 검출할 수 없었다. "RPA CMV F-1"을 5' 프라이머로 사용하였을 때, PCR과 RPA 모두에서 타겟 바이러스를 검출하였다(도 3).
따라서 "RPA CMV F-1(서열번호 1)"가 RPA를 이용한 오이모자이크바이러스(CMV) 검출을 위한 프라이머로 선정하였다.
또한, 상기 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR 및 RT-RPA의 RNA양에 대한 민감도를 비교하기 위하여 다른 실험조건은 모두 동일하게 한 뒤, 전체 RNA의 양을 3000ng에서부터 멸균수를 100배씩 희석하여 PCR과 RPA를 진행하였다.
구체적으로, 상기 오이모자이크바이러스(CMV)에서 분리한 RNA의 양을 3000ng에서부터 멸균수를 100배씩 희석한 다음 RT-PCR 및 RT-RPA을 수행하였다. RT-PCR는 역전사를 42℃에서 1시간 하고, 92℃에서 5분 동안 진행하며, PCR은 95℃ 3분, 95℃에서 30초간 변성(denaturation), 65℃에서 결합(annealing), 72℃에서 신장(elongation)을 35 사이클 반복하고, 72℃에서 5분간 둔다. RPA은 40℃에서 40분간 진행한다. 그런 다음 3% 아가로스 겔에 50분 동안 로딩하여 증폭산물을 확인하였다. RPA은 40℃에서 40분간 진행하였다. 그런 다음 3% 아가로스 겔에 50분 동안 로딩하여 증폭산물을 확인하였다.
그 결과, 상기 표 1에서 제작한 오이모자이크바이러스(CMV)를 검출하기 위한 프라이머 세트는 RNA가 3000 x 10-8 ng까지 PCR과 RPA 모두 검출이 가능하였고, 특히 검출까지 걸리는 시간은 RPA가 PCR에 비하여 월등히 짧았다(도 4).
또한, 증폭산물을 전기영동으로 관찰하면 여러 장비와 많은 시간이 필요하게 된다. 따라서 본 발명자는 전기영동에 소모되는 자원과 시간을 줄이기 위하여 RT-RPA 진단결과를 보다 빠르고 쉽게 육안으로 확인하기 위하여 SYBR Green I을 사용하여 자연광과 UV하에서 RT-RPA 증폭산물을 관찰하였다.
또한, SYBR Green I 반응의 RNA양에 대한 민감도를 확인하기 위하여 다른 실험조건은 모두 동일하게 한 뒤, 오이모자이크바이러스(CMV) RNA의 양을 3000ng에서부터 멸균수를 100배씩 희석하여 SYBR Green I 반응을 관찰하였다.
그 결과, SYBR Green I 반응은 RNA가 3000 x 10-10 ng까지 육안으로 관찰이 가능하였다(도 5).
또한, 오이모자이크바이러스(CMV)의 subgroup을 구분하기 위하여, 프라이머에 의하여 증폭되는 오이모자이크바이러스(CMV)의 서열 내에 제한효소 처리를 하였을 때 오이모자이크바이러스(CMV)의 subgroup 따라 다른 절편을 형성하는 부위를 포함시켰으며, RPA 증폭산물을 TA-Cloning하여 염기서열을 분석해본 결과 제한효소 서열에 이상 없음을 확인하였다. 또한, RT-RPA 증폭산물을 직접 제한효소 처리하여 전기영동상에서 오이모자이크바이러스(CMV)의 subgroup I과 II를 특정하였다.
그 결과, EcoR I 처리시 subgroup I은 273bp의 단일밴드, subgroup II는 180bp와 107bp의 밴드를 확인하였고, Xho I 처리시 subgroup I은 212bp, 61bp, subgroup II는 287bp의 단일밴드를 확인하였다. 오이모자이크바이러스(CMV)의 subgroup I인 CMV-Rs1의 RPA 증폭산물은 EcoR I 처리시 절단되지 않으며, Xho I 처리시 212bp와 61bp의 절편 두개가 생성된다. 오이모자이크바이러스(CMV)의 subgroup II인 CMV-GYP의 RPA증폭산물은 EcoR I 처리시 180bp와 107bp의 절편 두 개가 생성되고, Xho I 처리시 절단되지 않았다(도 6).
따라서 오이모자이크바이러스(CMV)는 RT-RPA 증폭산물을 직접 제한효소 처리하여 subgroup I과 subgroup II를 구별할 수 있다.
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gaaatttgat tctaccgtgt gggttacagt 30
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<212> DNA
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<220>
<223> RPA CMV R
<400> 3
ccatccagct tacggctaaa atggtcagtc 30
Claims (6)
- 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프라이머를 포함하는 오이모자이크바이러스(Cucumber mosaic virus, CMV) 검출용 프라이머 세트.
- 제 1항에 있어서, 상기 오이모자이크바이러스(CMV) 검출용 프라이머 세트는 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification, RPA)에 이용하는 것인 오이모자이크바이러스(CMV) 검출용 프라이머 세트.
- 식물 시료에서 총 RNA(Ribonucleic acid)를 분리하는 단계;
상기 분리된 RNA를 주형으로 하고, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프라이머를 이용하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 오이모자이크바이러스(CMV) 검출 방법. - 제 3항에 있어서, 상기 증폭은 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification, RPA)인 것인 오이모자이크바이러스(CMV) 검출 방법.
- 제 3항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 겔 전기영동, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 오이모자이크바이러스(CMV) 검출 방법.
- 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프라이머; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 오이모자이크바이러스(CMV) 검출용 키트.
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| KR1020190106290A KR102201162B1 (ko) | 2019-08-29 | 2019-08-29 | 오이모자이크바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 |
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- 2019-08-29 KR KR1020190106290A patent/KR102201162B1/ko active IP Right Grant
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