CN117089632B - 一种基于CRISPR/Cas12a-RPA快速检测草地贪夜蛾的序列组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于CRISPR/Cas12a‑RPA快速检测草地贪夜蛾的序列组合及其应用，属于生物检测技术领域，一种基于CRISPR/Cas12a‑RPA快速检测草地贪夜蛾的序列组合包括检测草地贪夜蛾的RPA引物对和特异性crRNA序列，以及利用该序列组合制成的试剂盒和利用该试剂盒在检测田间草地贪夜蛾的检测方法。本发明的检测方法将RPA扩增方法与CRISPR/Cas12a的检测方法相结合来检测草地贪夜蛾，通过蓝光切胶仪和侧流层析试纸条实现了可视化检测；本发明的检测方法简单快速，具有良好的特异性和敏感性，只需要简单的恒温加热便可以进行检测，具有在现场和田间快速对草地贪夜蛾核酸进行检测的优势。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种基于CRISPR/Cas12a-RPA快速检测草地贪夜蛾的序列组合及其应用，具体地是一种基于CRISPR/Cas12a-RPA快速检测草地贪夜蛾的序列组合、检测试剂盒、检测方法和应用。
背景技术
草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）别名又叫秋粘虫，最初分布在美洲热带和亚热带地区，是美洲的本地物种，它于2016年初在西部和中部非洲首次被发现，现已成为许多非洲和亚洲国家最严重的入侵鳞翅目害虫之一（Sparks et al 1979；陆耀辉等2023）。草地贪夜蛾是一种多食性迁徙性害虫，由于其出色的飞行能力，可以利用季节性风或台风进行长距离飞行能力，对许多农作物造成严重损害。2019年从缅甸侵入我国云南后迅速在我国传播（姜玉英2019），主要危害玉米、小麦等我国的主要粮食作物以及其它多种农作物，严重危害到了我国的农业生产（Sun et al 2019；孙小旭等2019；杨现明等2020）。
随着新的检测技术的发展和更新，对于入侵型的检疫性有害生物的检测方法也在随之拓展。如等温扩增技术的出现和发展打破了传统检测手段的空间限制，将检测技术带到了实验室之外，极大的简化了操作流程，降低了设备要求，允许检测者在相对较短的时间内以肉眼观察检测结果。基因编辑检测技术自出现至今，一直为生物领域的热门研究，基因编辑系统中有些酶如Cas12a酶等具侧切能力，当在引导序列sgRNA引导下切割到靶标DNA后，能启动他非靶标的切割反应体系中的单链DNA，通过加入标记后的单链DNA，标记DNA被切割后就能可视化切割反应的发生，促使Cas12a也成为了一种基因检测工具。但目前对于草地贪夜蛾的检测主要是采用PCR扩增的方法进行检测，其检测过程复杂、检测时间长、样本要求高、精确度相对较低。
发明内容
针对上述问题，本发明提供是一种基于CRISPR/Cas12a-RPA快速检测草地贪夜蛾的序列组合及其应用，具体地是一种基于CRISPR/Cas12a技术结合RPA技术快速检测草地贪夜蛾的序列组合、检测试剂盒、检测方法和应用，具有特异性好、灵敏度高、简单快速、样本要求低、高效等特点，可以实现在田间快速检测的要求，提高了检测效率，为草地贪夜蛾的检测方法提供一种新的选择。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一种基于CRISPR/Cas12a-RPA快速检测草地贪夜蛾的序列组合，包括根据COI基因设计的RPA引物对序列和crRNA序列，
其中，RPA引物对序列为：
正向引物RPA-COI-F1的序列为：5’- CTAGTAGCATTGTAGAAAATGGAGCAGGAACTGG -3’（SEQ ID NO：1）；
反向引物RPA-COI-R2的序列为：5’- CGATCAGTAA GTAATATAGT AATAGCTCCA G -3’（SEQ ID NO：2）；
crRNA序列为：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCCCCCCCCUCUCCUCUAAUAUUG （SEQ ID NO：3）。
进一步的，所述序列组合还包括ssDNA探针序列；
所述ssDNA探针序列是用于荧光定量PCR仪器检测的草地贪夜蛾的ssDNA探针序列、用于可视化荧光检测的草地贪夜蛾的ssDNA探针序列或用于侧流层析试纸条检测的草地贪夜蛾的ssDNA探针序列。
进一步的，用于荧光定量PCR仪器检测的草地贪夜蛾的ssDNA探针序列为ssDNA-reporter-FAM或ssDNA-reporter-CY5；
其中，ssDNA-reporter-FAM为：5’-FAM-TTATT-BHQ1-3’；
ssDNA-reporter-CY5为：5’-CY5-TGTCTTATcccccATAAGACA-BHQ1-
3’；
用于可视化荧光检测的草地贪夜蛾的ssDNA探针序列为ssDNA-reporter-FAM-2，具体为：5’-FAM-TGTCTTATcccccATAAGACA-BH
Q1-3’；
用于侧流层析试纸条检测的草地贪夜蛾的ssDNA探针序列为FB-reporter，具体为：5’-FAM-TTTTTTTTT-Biotin-3’。
一种快速检测草地贪夜蛾的检测试剂盒，所述试剂盒包含上述RPA引物对序列和crRNA序列。
进一步的，所述试剂盒还包含水合Buffer、MgOAC、酶干粉、Cas12a酶和ddH2O。
进一步的，所述试剂盒含有多个独立单元的八连排PCR反应管，所述PCR反应管中含有酶干粉；
所述试剂盒包括用于进行RPA扩增反应的反应体系和用于进行CRISPR/Cas12a反应的体系；
用于进行RPA扩增反应的反应体系的总体积为50μL，反应体系中包括：正向引物RPA-COI-F1、反向引物RPA-COI-R2、水合buffer、ddH2O和模板DNA，混匀后迅速放入含有酶干粉的PCR反应管中，将酶干粉溶解后，最后加入MgOAC；其中，模板DNA即为对待测样本提取获得；
具体的用于进行RPA扩增反应的反应体系为：2.4μL浓度为10μM的正向引物RPA-COI-F1、2.4μL浓度为10μM的反向引物RPA-COI-R2、29.5μL水合buffer、11.2μL的ddH2O和2μL模板DNA，混匀后迅速放入含有酶干粉的PCR反应管中，将酶干粉溶解后，最后加入2.5μL的MgOAC；
用于进行CRISPR/Cas12a反应的体系总体积为20μL；用于进行CRISPR/Cas12a反应的体系为用于进行RPA/Cas12a可视化荧光检测的反应体系、用于进行RPA/Cas12a-LFA反应的反应体系或者用于进行RPA/Cas12a荧光检测的反应体系；所述体系选自如下任一种：
用于进行RPA/Cas12a可视化荧光检测的反应体系包括：SF缓冲液、crRNA序列、RNA酶抑制剂、ssDNA-reporter-FAM-2、LbCas12a、RPA扩增产物和DEPC处理水；具体的是：2μL的SF缓冲液、1μL浓度为10μM的crRNA序列、1μL的酶活力为40U/μL的RNA酶抑制剂、2μL浓度为10μM的ssDNA-reporter-FAM-2、1μL浓度为1μM的LbCas12a、2μL的RPA扩增产物和11μL的DEPC处理水；
或者，用于进行RPA/Cas12a-LFA反应的反应体系包括：SF缓冲液、crRNA序列、RNA酶抑制剂、FB-reporter、LbCas12a、RPA扩增产物和DEPC处理水；具体的是：2μL的SF缓冲液、1μL浓度为10μM的crRNA序列、1μL酶活力为40U/μL的RNA酶抑制剂、2.5μL浓度为100nm的FB-reporter、1μL浓度为1μM的LbCas12a、2μL的RPA扩增产物和10.5μL的DEPC处理水；
再或者，用于进行RPA/Cas12a荧光检测的反应体系包括：SF缓冲液、crRNA序列、RNA酶抑制剂、ssDNA-reporter-CY5或者ssDNA-reporter-FAM、LbCas12a、RPA扩增产物和DEPC处理水；具体的是：2μL的SF缓冲液（Tris-OAC、MgOAC、BSA和DTT）、1μL浓度为10μM的crRNA序列、1μL酶活力为40 U/μL的RNA酶抑制剂、2μL浓度为10μM的ssDNA-reporter-CY5或者2μL浓度为10μM的ssDNA-reporter-FAM、1μL浓度为1μM的LbCas12a、2μL的RPA扩增产物和11μL的DEPC处理水。
一种上述快速检测草地贪夜蛾的检测试剂盒在检测田间草地贪夜蛾中的应用。
一种快速检测草地贪夜蛾的检测方法，包括以下步骤：
1）提取草地贪夜蛾疑似样品的基因组DNA；
2）以基因组DNA为模板DNA，利用上述检测试剂盒进行RPA扩增反应，得RPA扩增产物；
3）取RPA扩增产物进行CRISPR/Cas12a反应，然后进行荧光检测（即RPA/Cas12a可视化荧光检测或RPA/Cas12a荧光检测）或者侧流层析试纸条检测（即RPA/Cas12a-LFA反应）。
进一步的，步骤1）中，提取草地贪夜蛾疑似样品的基因组DNA的方法是取草地贪夜蛾的疑似样品，放在干净的1.5mL无菌离心管中，在各管中加入100μL的DNA提取缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5；300mM NaCl；300mM Sucrose)，用灭菌的研磨棒将样品捣烂，然后置于98℃金属浴上加热10min，即得草地贪夜蛾疑似样品的基因组DNA；
步骤2）中，用于进行RPA扩增反应的反应体系的总体积为50μL，具体的反应体系为：2.4μL浓度为10μM的正向引物RPA-COI-F1、2.4μL浓度为10μM的反向引物RPA-COI-R2、29.5μL水合buffer、11.2μL的ddH2O和2μL模板DNA，混匀后迅速放入含有酶干粉的PCR反应管中，将酶干粉溶解后，最后在管盖上加入2.5μL的MgOAC，迅速离心到管底，RPA扩增反应条件为：39℃扩增10 min；
步骤3）中，用于进行CRISPR/Cas12a反应的体系总体积为20μL；用于进行CRISPR/Cas12a反应的体系为用于进行RPA/Cas12a可视化荧光检测的反应体系、用于进行RPA/Cas12a-LFA反应的反应体系或者用于进行RPA/Cas12a荧光检测的反应体系；具体的所述体系选自如下任一种：
用于进行RPA/Cas12a可视化荧光检测的反应体系为：2μL的SF缓冲液、1μL浓度为10μM的crRNA序列、1μL的酶活力为40 U/μL的RNA酶抑制剂、2μL浓度为10μM的ssDNA-reporter-FAM-2、1μL浓度为1μM的LbCas12a、2μL的RPA扩增产物和11μL的DEPC处理水，反应条件为：37℃反应10 min，在470nm蓝光切胶仪观察荧光结果；
或者，用于进行RPA/Cas12a-LFA反应的反应体系为：2μL的SF缓冲液、1μL浓度为10μM的crRNA序列、1μL酶活力为40U/μL的RNA酶抑制剂、2.5μL浓度为100nm的FB-reporter、1μL浓度为1μM的LbCas12a、2μL的RPA扩增产物和10.5μL的DEPC处理水，37℃反应10 min，用DEPC处理水补足至50μL，混匀，将其滴入Cas12a核酸检测试纸条的结合垫端，观察试纸条上检测线（T线）和控制线（C线）的颜色；
再或者，用于进行RPA/Cas12a荧光检测的反应体系为：2μL的SF缓冲液（Tris-OAC、MgOAC、BSA和DTT）、1μL浓度为10μM的crRNA序列、1μL酶活力为40 U/μL的RNA酶抑制剂、2μL浓度为10μM的ssDNA-reporter-CY5或者2μL浓度为10μM的ssDNA-reporter-FAM、1μL浓度为1μM的LbCas12a、2μL的RPA扩增产物和11μL的DEPC处理水，37℃反应1h，并实时进行荧光检测。
一种上述快速检测草地贪夜蛾的检测方法在草地贪夜蛾检测方面的应用。
本发明的一种基于CRISPR/Cas12a-RPA快速检测草地贪夜蛾的序列组合及应用的有益效果为：
本发明在前人检测技术的基础上，引入CRISPR/Cas12a检测技术，并结合现有开发较快的重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification, RPA）技术。通过筛选特异性基因靶点，设计出特异性RPA引物，扩增之后进行Cas12a切割反应，偶联两级扩增达到高效和可视化的检测目的；利用等温扩增技术与CRISPR/Cas12a检测技术相结合能够更好的适应草地贪夜蛾等入侵性害虫的田间快速检测技术，并且相比单独的等温扩增技术而言，能够进一步缩短检测时间，检测精确度进一步提高，并且结果可视化，从而能够在有限的时间中完成更多的检测样品，为采取更好的防控措施提供参考，保护本土生态环境以及农业经济发展；
本发明提供了一种基于CRISPR/Cas12a-RPA快速检测草地贪夜蛾的序列组合及其应用，利用本发明的序列组合制成的检测试剂盒在检测田间草地贪夜蛾时，该检测方法将RPA的扩增方法与CRISPR/Cas12的检测方法结合，具有良好的特异性、敏感性，不需要昂贵的仪器设备，简便快速、具有快速检测的优势，更有利于对草地贪夜蛾的分子检测技术在农田间的推广和应用，可以做到对草地贪夜蛾的有效监测和防控。
附图说明
图1是本发明实施例1中COI基因的 crRNA序列的间隔序列比对结果；
图2是本发明实施例2中Cas12a荧光检测系统针对草地贪夜蛾基因特异性高效靶点检测效率比较，其中荧光比值：通过酶标仪每隔5 min反应时检测到的荧光强度与0min时检测到的荧光强度的比值；
图3是本发明实施例2中RPA引物的琼脂糖凝胶电泳结果；
图4是本发明实施例2中基于RPA/Cas12a的草地贪夜蛾荧光曲线分析图；
图5是本发明实施例3中RPA/Cas12a可视化荧光检测结果图；
图6是本发明实施例4中侧流层析试纸条检测结果图；
图7是本发明实施例6中RPA Cas12a荧光检测的灵敏度分析；
图8是本发明实施例6中草地贪夜蛾、玉米螟和ddH2O的琼脂糖凝胶电泳结果。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
另，实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂未注明生产厂商者，均为常规可购买产品。
本发明所提供的基于CRISPR/Cas12a检测草地贪夜蛾的检测操作流程示意图如图1：首先采集疑似样品并进行DNA的粗提，然后通过RPA扩增技术扩增靶标序列，再通过CRISPR/Cas12a反应，非特异性切割ssDNA探针，最后通过荧光定量PCR仪器、试纸条和蓝光灯来读取结果。
实施例1 特异性基因的靶标保守性分析和引物设计
如图1所示，通过查阅文献和在NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上查找草地贪夜蛾特异的基因，经过进行同源性分析以及在NCBI网站BLAST，筛选出草地贪夜蛾特有的基因：COI基因。
crRNA序列由直接重复序列和间隔序列等两部分组成。将COI基因序列在CRISPOR（http://crispor.tefor.net/）网站进行打靶，为了保证crRNA序列的工作的高效性，选取了分值高的间隔序列来设计crRNA序列，该间隔序列为： CCCCCCCCUCUCCUCUAAUAUUG送去生工生物公司合成crRNA序列：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCCCCCCCCUCUCCUCUAAUAUUG （SEQ IDNO：3），然后通过Primer Primer 5.0软件设计COI基因的RPA引物和PCR引物，其包含PAM序列，具体设计的RPA引物和PCR引物见下表：
表1 本实施例中设计的PCR引物和RPA引物一览表
由此，获得引物对为RPA-COI-F1/R1、RPA-COI-F1/R2、RPA-COI-F1/R3。
其中，RPA-COI-F1（SEQ ID NO：1）为正向引物，RPA-COI-R1、RPA-COI-R2（SEQ IDNO：2）、RPA-COI-R3均为反向引物。
实施例2 crRNA序列的有效性验证和RPA扩增反应
S1、草地贪夜蛾DNA快速提取的方法
取草地贪夜蛾样品，放在干净的1.5mL无菌离心管中，在各管中加入100μL的DNA提取缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5、300mM NaCl、300mM Sucrose)，用灭菌的研磨棒将草地贪夜蛾样品捣烂，然后将所得样品置于98℃金属浴加热10min，得草地贪夜蛾基因组DNA模板。
S2、crRNA序列的有效性验证
根据草地贪夜蛾基因组筛选的理论上具有高效特异性的靶点基因RPL18基因和COI基因，并根据RPL18基因和COI基因按照实施例1的方式设计合成获得相应的引物对。其中，根据COI基因设计合成的引物对即为实施例1中设计合成的引物对RPA-COI-F1/R1、RPA-COI-F1/R2、RPA-COI-F1/R3。
根据各基因对应的引物对分别设计合成相应的荧光定量PCR仪器检测的草地贪夜蛾的ssDNA探针序列（其中ssDNA探针序列为ssDNA-reporter-FAM，本实施例中用于检测的ssDNA探针序列均通用），通过PCR反应扩增含PAM序列的靶标序列；
PCR反应体系为：Green Master Mix酶12.5μL、10μM的相应的引物对各1μL（即正向引物1μL、反向引物1μL），草地贪夜蛾基因组DNA模板1μL，用ddH2O补足至25μL。
PCR反应程序设置为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保存。
然后进行CRISPR/Cas12a反应。其中，CRISPR/Cas12a反应的反应体系（20μL）为：2μL的10×Buffer 2.1、1μL的crRNA序列（10μM）、1μL的RNA酶抑制剂（40U/μL）、2μL相应的ssDNA探针序列（10μM）、1μL的LbCas12a（1μM）、2 μL的PCR产物，11μL的DEPC处理水，于酶标仪（λex: 485nm；λem: 535nm）上进行反应，每隔5min检测一次荧光值，37℃反应1h，每组实验重复三次，使用GraphPad Prism 8作图。
分别采用ddH2O作为RPL18基因对照和COI基因对照，以保证实验未被污染。
结果如图2所示，根据COI基因设计的引物对在10min左右开始出峰，并且在40min左右可以达到最高值，荧光比值达到10左右，说明该crRNA序列具有活性，可以用于后续的CRISPR/Cas12a实验中。
并且，图2中仅选择了针对各基因设计的引物对检测效率较高的结果进行制图，其中根据COI基因设计的引物对实际上选择的是引物对RPA-COI-F1/R2测定的检测效率结果进行制图。
S3、RPA扩增反应
取草地贪夜蛾基因组DNA模板分别采用实施例1中获得的各相应的引物对进行RPA扩增反应；
其中，RPA扩增反应过程如下：
RPA反应体系的总体积为50 μL，反应体系为：2.4μL正向引物（10μM）、2.4μL反向引物（10 μM）、29.5μL水合Buffer、11.2μL的ddH2O、2μL草地贪夜蛾基因组DNA模板，混匀后迅速放入含有酶干粉的PCR反应管中，将酶干粉溶解后，在管盖上加入2.5μL的MgOAC，迅速离心到管底，39℃反应20min。
RPA反应结束后，取5μL的RPA扩增产物和1μL的6×loading buffer混匀，加至加样孔中，使用2%的琼脂糖凝胶，设置电压120V，电泳30min后取出琼脂糖凝胶，在凝胶电泳成像系统进行拍照保存，得到引物1~引物3的琼脂糖凝胶电泳结果。其中，引物1~引物3的凝胶电泳结果分别是利用引物对RPA-COI-F1/R1、RPA-COI-F1/R2、RPA-COI-F1/R3扩增后，经琼脂糖凝胶电泳实验测定获得。
同时，分别采用ddH2O作为引物1空白对照~引物3空白对照，以保证实验未被污染。
结果如图3所示，引物1出现的目标产物条带大小为289 bp，引物2出现的目标产物条带大小为169bp，引物3出现的目标产物条带大小为233bp，其中，目标产物在100-250bp之间，本实施例中引物2和引物3均对应出现目标产物条带，且条带大小符合引物大小，引物1未出现目标产物条带。因此，选择RPA-COI-F1/R2和RPA-COI-F1/R3进行进一步实验。
S4、效率筛选
根据实施例1中的引物对RPA-COI-F1/R2、RPA-COI-F1/R3分别设计合成对应的用于荧光定量PCR仪器检测的草地贪夜蛾的ssDNA探针序列（其中根据RPA-COI-F1/R2设计合成的ssDNA探针序列为ssDNA-reporter-CY5）。由于RPA-COI-F1/R1引物对在凝胶电泳成像时，未产生目标产物条带，说明其无法特异性检测到草地贪夜蛾，这里不再进行效率筛选实验。
取步骤S3中获得的RPA扩增产物进行RPA/Cas12a荧光检测。
其中，RPA/Cas12a荧光检测的反应体系的总体积为20μL，反应体系为：2μL的SF缓冲液（Tris-OAC、MgOAC、BSA 和 DTT）、1μL的crRNA序列（10μM）、1μL酶活力为40U/μL的RNA酶抑制剂、2μL相应的ssDNA探针序列（10μM）、1μL的LbCas12a（1μM）、2μL的RPA扩增产物、11μL的DEPC处理水，置于荧光定量PCR仪器上进行反应，将程序设置为37℃ 30s，37℃ 30s，反应过程中每隔1 min收集荧光一次，60个循环，共1h，得到利用引物对RPA-COI-F1/R2和引物对RPA-COI-F1/R3扩增出的草地贪夜蛾RPA样品1（即对应引物对RPA-COI-F1/R2）和草地贪夜蛾RPA样品2（即对应引物对RPA-COI-F1/R3）相应的荧光曲线。
同时以水作为空白对照1和空白对照2分别与草地贪夜蛾RPA样品1和草地贪夜蛾RPA样品2进行对照，以保证实验未被污染。
结果如图4所示，可以看出，实验开始时，草地贪夜蛾RPA样品1和草地贪夜蛾RPA样品2一直处于扩增状态，但草地贪夜蛾RPA样品1拥有较高的反应效率，因此，选择引物对RPA-COI-F1/R2用于后续实验。
实施例3 一种基于CRISPR/Cas12a RPA快速检测草地贪夜蛾的方法
1）采集草地贪夜蛾和近缘种（玉米螟），放在干净的1.5 mL无菌离心管中，在各管中加入100uL的DNA提取缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5；300mM NaCl；300mM Sucrose)，用灭菌的研磨棒将草地贪夜蛾样品捣烂后，置于98℃金属浴加热10min，得相应的模板DNA。并以ddH2O作为空白对照。
2）取步骤1）中获得的相应的模板DNA采用引物对RPA-COI-F1/R2进行RPA扩增反应；
其中，RPA扩增反应过程如下：
RPA反应体系的总体积为50μL，反应体系为：2.4μL的RPA-COI-F1（10μM）、2.4μL的RPA-COI-R2（10μM）、29.5μL水合Buffer、11.2μL的ddH2O、2μL模板DNA，混匀后迅速放入含有酶干粉的PCR反应管中，将酶干粉溶解后，在管盖上加入2.5μL的MgOAC，迅速离心到管底，39℃反应20min，RPA反应结束后，得相应的RPA扩增产物。
3）根据引物对RPA-COI-F1/R2设计合成用于可视化荧光检测的草地贪夜蛾的ssDNA探针序列ssDNA-reporter-FAM-2，具体为：5’-FAM-TGTCTTATcccccATAAGACA-BHQ1-3’；
取相应的RPA扩增产物进行RPA/Cas12a可视化荧光检测。
用于RPA/Cas12a可视化荧光检测的反应体系的总体积为20μL，反应体系为：2μL的SF缓冲液、1μL浓度为10μM的crRNA序列、1μL酶活力为40U/μL的RNA酶抑制剂、2μL浓度为10μM的ssDNA-reporter-FAM-2、1μL浓度为1μM的LbCas12a、2μL相应的RPA扩增产物，11μL的DEPC处理水，反应条件为：37℃反应10min，在470nm蓝光切胶仪观察荧光结果，具体结果如图5所示，只有草地贪夜蛾样品获得荧光结果，近缘种玉米螟和空白对照均无荧光反应。
实施例4 一种基于CRISPR/Cas12a RPA快速检测草地贪夜蛾的方法
1）采用与实施例3相同的方法快速提取草地贪夜蛾和玉米螟的相应的模板DNA。并以ddH2O作为空白对照。
2）采用与实施例3相同的方法获得相应的RPA扩增产物。
3）根据引物对RPA-COI-F1/R2设计合成用于侧流层析试纸条检测的草地贪夜蛾的ssDNA探针序列FB-reporter，具体为：5’-FAM-TTTTTTTTT-Biotin-3’。
取RPA扩增产物进行RPA/Cas12a-LFA反应（即侧流层析试纸条检测）。
用于进行RPA/Cas12a-LFA反应的反应体系的总体积为20μL，反应体系为：2μL的SF缓冲液、1μL浓度为10μM的crRNA序列、1μL酶活力为40U/μL的RNA酶抑制剂、2.5μL浓度为100nm的FB-reporter、1μL浓度为1μM的LbCas12a、2μL相应的RPA反应产物，10.5μL的DEPC处理水，37℃反应10 min，用DEPC处理水补足至50μL，混匀，将其滴入普通的Cas12a核酸检测试纸条的结合垫端，观察试纸条上检测线（T线）和控制线（C线）的颜色，具体结果见图6，左侧的两个试纸条为示范例，左侧第一个为阳性结果示范例（即检测线消失为阳性），第二个为阴性结果示范例（即检测线显现为阴性），右侧的三个试纸条为本实施例中的检测结果，可以看到草地贪夜蛾样品中检测线消失，为阳性，说明检测的结果是该样品为草地贪夜蛾，玉米螟和空白对照检测线显现，为阴性，说明检测的结果是相应的样品均不是草地贪夜蛾。
实施例5 一种基于CRISPR/Cas12a RPA快速检测草地贪夜蛾的方法
1）采用与实施例3相同的方法快速提取草地贪夜蛾的模板DNA。
2）采用与实施例3相同的方法获得RPA扩增产物。
3）根据引物对RPA-COI-F1/R2设计合成用于荧光定量PCR仪器检测的草地贪夜蛾的ssDNA探针序列ssDNA-reporter-CY5，具体为：5’-CY5-TGTCTTATcccccATAAGACA-BHQ1-3’，其与实施例2步骤S4中根据引物对RPA-COI-F1/R2设计合成的ssDNA探针序列ssDNA-reporter-CY5相同。
取RPA扩增产物进行RPA/Cas12a荧光检测。
其中，用于进行RPA/Cas12a荧光检测的反应体系的总体积为20μL，反应体系为：2μL的SF缓冲液（Tris-OAC、MgOAC、BSA和DTT）、1μL的crRNA序列（10μM）、1μL酶活力为40U/μL的RNA酶抑制剂、2μL相应的ssDNA-reporter-CY5（10μM）、1μL的LbCas12a（1μM）、2μL的RPA扩增产物、11μL的DEPC处理水，置于实时荧光定量PCR仪器上进行反应，37℃反应1h，通过qPCR仪实时观察荧光值变化。
另外，也可以根据引物对RPA-COI-F1/R2设计合成用于荧光定量PCR仪器检测的草地贪夜蛾的ssDNA探针序列ssDNA-reporter-FAM，具体为：5'-FAM-TTATT-BHQ1-3’，其与实施例2步骤S2中根据引物对RPA-COI-F1/R2设计合成的ssDNA探针序列ssDNA-reporter-FAM一致。
且使用探针ssDNA-reporter-FAM的检测方法也与本实施例中使用探针ssDNA-reporter-CY5的检测方法相同，仅探针种类发生改变，因此不再赘述。
实施例6 基于CRISPR/Cas12a RPA快速检测草地贪夜蛾的方法的灵敏度和特异性分析
一、灵敏度分析
取实施例2中提取的草地贪夜蛾基因组DNA模板将其浓度分别稀释至10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL，再利用实施例5中步骤2）至步骤3）中记载的方法进行RPA/Cas12a荧光检测，实现灵敏度评价。
结果如图7所示，可以看到利用本发明的基于CRISPR/Cas12a-RPA快速检测草地贪夜蛾的序列组合进行的草地贪夜蛾RPA/Cas12a荧光检测体系对草地贪夜蛾的DNA浓度检测极限在0.1ng/μL以上。
二、特异性分析
分别以草地贪夜蛾和玉米螟提取的DNA作为RPA扩增的模板，以ddH2O作为空白对照，利用实施例3步骤2）中的RPA反应体系进行PRA扩增反应，以利于后期进行RPA/Cas12a荧光检测评价特异性。
按照RPA试剂盒要求，将RPA初始产物放入PCR仪器中孵育20min后，将RPA扩增后的产物放于置于琼脂糖凝胶上，电泳20min后，得电泳结果，如图8所示，草地贪夜蛾提取的DNA成功扩增出条带，且条带符合引物大小（100-250bp），玉米螟提取的DNA无扩增条带，空白对照也无条带出现。因此，本发明设计的引物对RPA-COI-F1/R2进行的RPA/Cas12a的荧光检测具有较强的特异性。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，本领域普通技术人员还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其它实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (8)
1.一种基于CRISPR/Cas12a-RPA快速检测草地贪夜蛾的序列组合，其特征在于，包括根据COI基因设计的RPA引物对序列和crRNA序列；
RPA引物对序列为：
正向引物RPA-COI-F1的序列如SEQ ID NO：1所示；
反向引物RPA-COI-R2的序列如SEQ ID NO：2所示；
crRNA序列如SEQ ID NO：3所示；
所述序列组合还包括ssDNA探针序列；
所述ssDNA探针序列是用于荧光定量PCR仪器检测的草地贪夜蛾的ssDNA探针序列、用于可视化荧光检测的草地贪夜蛾的ssDNA探针序列或用于侧流层析试纸条检测的草地贪夜蛾的ssDNA探针序列；
用于荧光定量PCR仪器检测的草地贪夜蛾的ssDNA探针序列为ssDNA-reporter-FAM或ssDNA-reporter-CY5；
其中，ssDNA-reporter-FAM为：5’-FAM-TTATT-BHQ1-3’；
ssDNA-reporter-CY5为：5’-CY5-TGTCTTATcccccATAAGACA-BHQ1-3’；
用于可视化荧光检测的草地贪夜蛾的ssDNA探针序列为ssDNA-reporter-FAM-2，具体为：5’-FAM-TGTCTTATcccccATAAGACA-BHQ1-3’；
用于侧流层析试纸条检测的草地贪夜蛾的ssDNA探针序列为FB-reporter，具体为：5’-FAM-TTTTTTTTT-Biotin-3’。
2.一种快速检测草地贪夜蛾的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas12a-RPA快速检测草地贪夜蛾的序列组合。
3.根据权利要求2所述的一种快速检测草地贪夜蛾的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含水合Buffer、MgOAC、酶干粉、Cas12a酶和ddH2O；
所述酶干粉用于RPA扩增反应。
4.根据权利要求2或3所述的一种快速检测草地贪夜蛾的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于进行RPA扩增反应的反应体系和用于进行CRISPR/Cas12a反应的体系；
用于进行RPA扩增反应的反应体系的总体积为50μL，反应体系包括：正向引物RPA-COI-F1、反向引物RPA-COI-R2、水合buffer、ddH2O和模板DNA，混匀后迅速放入含有酶干粉的PCR反应管中，将酶干粉溶解后，最后加入MgOAC；
用于进行CRISPR/Cas12a反应的体系总体积为20μL，所述体系选自如下任一种：
所述体系包括：SF缓冲液、crRNA序列、RNA酶抑制剂、ssDNA-reporter-FAM-2、LbCas12a、RPA扩增产物和DEPC处理水；
或者，所述体系包括：SF缓冲液、crRNA序列、RNA酶抑制剂、FB-reporter、LbCas12a、RPA扩增产物和DEPC处理水；
再或者，所述体系包括：SF缓冲液、crRNA序列、RNA酶抑制剂、ssDNA-reporter-CY5或者ssDNA-reporter-FAM、LbCas12a、RPA扩增产物和DEPC处理水。
5.权利要求2-4中任一项所述的一种快速检测草地贪夜蛾的检测试剂盒在检测田间草地贪夜蛾中的应用。
6.一种快速检测草地贪夜蛾的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）提取草地贪夜蛾疑似样品的基因组DNA；
2）以基因组DNA为模板，利用权利要求2-4中任一项所述的检测试剂盒进行RPA扩增反应，得RPA扩增产物；
3）取RPA扩增产物进行CRISPR/Cas12a反应，然后进行荧光检测或者侧流层析试纸条检测。
7.根据权利要求6所述的一种快速检测草地贪夜蛾的检测方法，其特征在于，
步骤1）中，提取草地贪夜蛾疑似样品的基因组DNA的方法是取草地贪夜蛾的疑似样品，加入100μL的DNA提取缓冲液，捣烂，然后置于98℃环境中10min，即得草地贪夜蛾疑似样品的基因组DNA；
步骤2）中，用于进行RPA扩增反应的反应体系的总体积为50μL，反应体系包括：正向引物RPA-COI-F1、反向引物RPA-COI-R2、水合buffer、ddH2O和模板DNA，混匀后迅速放入含有酶干粉的PCR反应管中，将酶干粉溶解后，最后加入MgOAC，迅速离心到管底，RPA扩增反应条件为：39℃扩增10min；
步骤3）中，用于进行CRISPR/Cas12a反应的体系总体积为20μL；具体的所述体系选自如下任一种：
所述体系包括：SF缓冲液、crRNA序列、RNA酶抑制剂、ssDNA-reporter-FAM-2、LbCas12a、RPA扩增产物和DEPC处理水，反应条件为：37℃反应10 min，在470nm蓝光切胶仪观察荧光结果；
或者，所述体系包括：SF缓冲液、crRNA序列、RNA酶抑制剂、FB-reporter、LbCas12a、RPA扩增产物和DEPC处理水，37℃反应10 min，用DEPC处理水补足至50μL，混匀，利用试纸条进行检测；
再或者，所述体系包括：SF缓冲液、crRNA序列、RNA酶抑制剂、ssDNA-reporter-CY5或者ssDNA-reporter-FAM、LbCas12a、RPA扩增产物和DEPC处理水，37℃反应1h，并实时进行荧光检测。
8.权利要求6或7所述的一种快速检测草地贪夜蛾的检测方法在草地贪夜蛾检测方面的应用。
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Citations (5)
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| CN113308552A (zh) * | 2021-06-10 | 2021-08-27 | 四川大学 | 一种草地贪夜蛾种特异性引物对及试剂盒和鉴别方法 |
| CN115039612A (zh) * | 2022-06-16 | 2022-09-13 | 中国农业科学院深圳农业基因组研究所 | 鉴别草地贪夜蛾品系的方法和验证方法 |
-
2023
- 2023-10-19 CN CN202311352346.3A patent/CN117089632B/zh active Active
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Detection of the occurrence of the fall armyworm, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) strains on maize in Southern Rajasthan India;S. Ramesh Babu et al.;Springer link;第129卷;1491-1496 * |
| 利用mtCOI PCR-RFLP技术鉴别草地贪夜蛾与其他3种形态相近昆虫;孔子艺 等;生物安全学报(第1期);20-26 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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