KR101446728B1 - 파보바이러스 ｂ１９의 검출방법 - Google Patents

파보바이러스 ｂ１９의 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 파보바이러스 B19의 검출방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 파보바이러스의 VP1과 VP2 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 파보바이러스 B19 검출용 프라이머쌍, 상기 프라이머쌍을 이용한 파보바이러스 B19의 검출방법 및 상기 프라이머쌍을 포함하는 파보바이러스 B19 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 파보바이러스 B19 검출법은 온건성(robustness), 분석특이성, 반복성, 재현성, 민감도 (sensitivity)가 우수하고, 특히, 104 IU (6,500 게놈 카피)이하의 범위인 약 78 카피까지 검출할 수 있어, 세포은행 및 세포기반 의약품 제조시에, 높은 민감도로 파보바이러스 B19를 검출할 수 있다.

Description

파보바이러스 Ｂ１９의 검출방법{Methods for Detecting Parvovirus B19}
본 발명은 파보바이러스 B19의 검출방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 파보바이러스의 VP1과 VP2 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 파보바이러스 B19 검출용 프라이머쌍, 상기 프라이머쌍을 이용한 파보바이러스 B19의 검출방법 및 상기 프라이머쌍을 포함하는 파보바이러스 B19 검출용 키트에 관한 것이다.
파보바이러스 B19(Parvovirus B19 혹은 erythrovirus B19)는 parvoviridae목, erythrovirus속이며, non-enveloped, icosahedrons 형태의 단일가닥 선형 DNA 게놈으로 구성되어 있다. 파보바이러스 B19는 사람에만 감염되는 것으로 알려져 있으며, 감염홍반(fifth disease), 관절염, 골수무형성발증(aplastic crisis), 태아수종(hydrops fetalis) 등의 질환을 일으킨다. 특히, 면역능력이 저하된 사람이 B19 바이러스에 감염되었을 때 약 7%가 사망에 이르기도 하며, 유럽과 미국에서는 년간 3,000 명 이상의 임신중인 태아가 사망한다고 보고되었다.
미국 FDA 에서는 in vitro 검출법으로 쉽게 검출할 수 없는 바이러스 (예, 파보바이러스 B19)의 경우 PCR 방법을 사용하도록 권고하고 있다.
파보바이러스 B19에 감염된 환자의 호흡관련 분비물 또는 파보바이러스 B19에 오염된 혈액제제를 통해 B19 감염이 발생할 수 있으나, 감염에 필요한 초기 농도는 아직 보고된 바가 없다. 하지만, US FDA “Guidance for industry: nucleic acid testing to reduce the possible risk of Parvovirus B19 transmission by plasma-derived products (2009)”에서는 혈청 풀(pool)에서 104 국제유니트(international units, IU)/mL을 넘지 않도록 제안하고 있으며, B19 DNA의 1 IU는 0.65 게놈에 해당하는 것으로 보고되었다 (J. Virol. Methods 92: 183-191, 2001). 즉, B19 검출을 위해서 적용되는 분석법은 최소 104 IU (6,500 게놈)를 검출할 수 있어야 한다.
이에, 본 발명자들은 높은 민감도로 파보바이러스 B19를 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 파보바이러스 B19의 VP1과 VP2 캡시드 단백질 암호와 부위 유래의 유전자 특이적 부위를 프라이머로 사용하여, 검체 DNA를 PCR 할 경우, 비특이반응이 없이 고감도로 파보바이러스 B19를 검출할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 높은 민감도로 검체 DNA에서 파보바이러스 B19를 검출할 수 있는 프라이머쌍을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 높은 민감도로 검체 DNA에서 파보바이러스 B19를 검출하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 파보바이러스 B19를 검출용 키트를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1과 서열번호 2로 구성되는 파보바이러스 B19 검출용 프라이머 쌍을 제공한다.
본 발명은 또한, 검체의 DNA를 서열번호 1과 서열번호 2로 구성되는 파보바이러스 B19 검출용 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 수행하는 것을 특징으로 하는 파보바이러스 B19를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1과 서열번호 2로 구성되는 프라이머 쌍을 포함하는 파보바이러스 B19 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 파보바이러스 B19 검출법은 온건성(robustness), 분석특이성, 반복성, 재현성, 민감도 (sensitivity)가 우수하고, 특히, 104 IU (6,500 게놈 카피)이하의 범위인 약 78 카피까지 검출할 수 있어, 세포은행 및 세포기반 의약품 제조시에, 높은 민감도로 파보바이러스 B19를 검출할 수 있다.
도 1은 파보바이러스 B19 유전체 구조 및 양성대조군 pGEM-T-B19 플라스미드 맵을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 파보바이러스 B19 검출용 프라이머 선정에 사용된 프라이머의 증폭위치(A)와 파보바이러스 B19 검출용 프라이머를 이용하여 293게놈 DNA 및 양성대조군 pGEM-T-B19를 PCR하였을때의 비특이적 증폭 및 특이적 증폭을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 F2/R2 프라이머쌍을 이용한 파보바이러스 B19 검출의 분석 특이성, 반복성 및 재현성을 확인한 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 F2/R2 프라이머쌍의 파보바이러스 B19 검출 민감도를 확인한 것이다.
일 관점에서, 본 발명은 서열번호 1과 서열번호 2로 구성되는 파보바이러스 B19 검출용 프라이머 쌍에 관한 것이다.
파보바이러스 B19는 사람에게만 감염되는 치사율이 7%의 위험도가 높은 바이러스이며, 이러한 파보바이러스 B19의 검출은 높은 민감도가 요구된다.
아울러, 바이러스의 감염위험도가 높기 때문에, 바이러스 자체를 이용하여 검출방법을 시험하기가 어려우며, 본 발명에서는 파보바이러스 B19의 VP1과 VP2의 캡시드 단백질의 암호화 부위 중 4085~4384 뉴클레오티드 부위를 pGEM-T 벡터에 클로닝한 비병원성 플라스미드를 이용하여 파보바이러스 B19의 검출효율 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 파보바이러스 B19의 VP1과 VP2의 캡시드 단백질의 암호화 부위 중 4085~4384 뉴클레오티드 부위를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 제작하고, 이 들 중 인간 게놈 DNA와 비특이적 반응을 일으키지 않고, 파보바이러스 B19의 VP1과 VP2의 캡시드 단백질의 암호화 부위 중 4085~4384 뉴클레오티드 부위만을 특이적으로 증폭하는 프라이머를 선별하였다.
다른 관점에서, 본 발명은 검체의 DNA를 서열번호 1과 서열번호 2로 구성되는 파보바이러스 B19 검출용 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 것을 특징으로 하는 파보바이러스 B19의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태로, 검체 DNA를 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍과 함께, 94℃로 5분 반응 후, 35 cycles (94℃ for 30 sec, 50~68℃ for 30 sec, 72℃, 30 sec)을 수행하였으며, 72℃, 5 분 최종 신장시킨 후, 아가로즈 젤 전기영동을 통하여, PCR 산물의 생성 여부를 확인하여 파보바이러스 B19를 검출할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 서열번호 1과 서열번호 2로 구성되는 프라이머 쌍을 포함하는 파보바이러스 B19 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 파보바이러스 B19 검출방법은 세포은행 (cell bank) 및 세포기반의 최종의약품에 외래성 바이러스 B19의 오염여부를 검증하는데 사용될 수 있으며, 상기 세포은행은 master cell bank 및 working cell bank 일 수 있고, 세포치료제의 최종의약품도 적용 대상에 해당된다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 자세하게 설명한다. 다만 하기 실시예는 본 발명을 상세히 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 파보바이러스 B19에 대한 양성대조군 플라스미드의 제작
야생형 파보바이러스 B19 게놈 (Genbank accession number AY386330.1, 도 1A)의 VP1과 VP2의 캡시드 단백질의 암호화 부위 중 4085~4384 bp에 해당하는 부위가 유전자 특이적인 부위로 분석되어(), 상기 부위를 합성한 후 pGEM-T Easy 벡터(Promega, USA)의 EcoRI과 SpeI 사이트에 삽입하여 클로닝하고, pGEM-T-B19로 명명하였다. 상기 pGEM-T-B19는 이후, 파보바이러스 B19의 증폭용 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 데 있어서, 정량을 위한 양성대조군으로 사용하였다(도 1B).
실시예 2: 파보바이러스 B19 증폭용 프라이머 제작
파보바이러스 B19 유전체 증폭에 특이적인 우수한 프라이머를 선택하기 위하여, B19의 VP1과 VP2의 캡시드 단백질의 암호화 부위 중 4085~4384 bp에 해당하는 부위를 증폭할 수 있는 두 종류의 프라이머쌍인 F1/R1과 F2/R2를 제작하였다.
F1: 5'-CTG ACA CAT TAG GAG GTG ACC CAA-3'(서열번호 3)
R1: 5'-TGT TAA GGC TTT CCC AGC TCC AGT-3'(서열번호 4)
F2: 5'-atg cca ggg cca cta gta aac tca-3'(서열번호 1)
R2: 5'-ttt atc tgt gtc cca gtg gtg gta cg-3'(서열번호 2)
상기 프라이머들의 잠재적인 어닐링 특이성을 결정하기 위해 BLAST search homology database로 분석하였다. F1/R1 프라이머쌍은 152 bp, F2/R2 프라이머쌍을 사용하였을 때는 168 bp의 B19 특이적인 PCR product 증폭이 예상되었다.
파보바이러스 B19의 오염 여부를 분석하기 위한 세포은행의 검체 (sample, test material)로는 아데노바이러스 및 AAV 생산에 사용되는 293 세포 (ATCC, Cat # CRL-1573, USA)의 게놈 DNA를 사용하였으며, genomic DNA extraction kit (Promega, Cat# A1120)을 이용하여 제작자가 제시한 방법에 따라 분리하였다.
파보바이러스 B19의 검출을 위한 PCR반응은 icycler (Bio-rad, USA)와 Takara Ex Taq Hot starter (Cat# RR006A, Japan) kit을 사용하였다. PCR 반응용액의 최종부피는 50㎕로 5 ㎕의 10X buffer (Mg2+ plus), 4 ㎕의 2.5 mM dNTP, 각 0.5㎕의 10 μM primers, 0.25㎕의 Ex Taq (5 units/μl)로 구성하였으며, 시험군에 따라 1 ㎕의 293 genomic DNA (0.5 μg, 약 7.5 x 104 cells) 또는 1 ㎕의 pGEM-T-B19 (1.2~1,000 copies)를 첨가하였다. Thermal cycling은 94℃로 5분 반응 후, 35 cycles (94℃ for 30 sec, 50~68℃ for 30 sec, 72℃, 30 sec)을 수행하였으며, 최종 신장은 72℃, 5 분 수행한 후 4℃에서 반응을 종료하였다.
실시예 3: 파보바이러스 B19 특이적 검출을 위한 최적 프라이머 선정
검체로 사용한 293세포의 게놈 DNA을 사용하므로, PCR 프라이머는 B19특이적인 증폭뿐 아니라, 293세포 게놈 DNA와의 비특이적인 증폭도 가능하므로, PCR반응에 검체가 포함되어도 B19특이적인 증폭만 하는 프라이머쌍과 반응조건을 선정하는 것이 필요하다. 따라서 이러한 최적 프라이머쌍은 최적의 PCR반응조건에서 검체인 293 게놈 DNA (B19 negative) 만을 사용하여 수행된 PCR 반응에서는 비특이적인 반응이 일어나지 않아야 하며, 양성대조군인 pGEM-T-B19 플라스미드가 검체와 함께 포함된 PCR반응 (spiked control)에서는 B19 특이적인 증폭만 일어나야 한다.
파보바이러스 B19의 오염여부를 확인하기 위한 양성대조군인 pGEM-T-B19 플라스미드는 파보바이러스 B19의 VP1과 VP2 암호화 부위 중 4085~4384 nt부위를 포함하고 있고, 파보바이러스 B19 특이적인 증폭을 하는 최적의 프라이머쌍을 선정하기 위해 도 2A와 같이 프라이머들을 제작하였다. 또한, B19 특이적인 PCR반응조건을 선정하기 위해서는 gradient PCR방법을 통해 최적의 annealing조건을 분석하였다 (그림 2B). PCR 주형으로는 0.5 μg의 293 genomic DNA (B19 negative) 또는 “293 genomic DNA (0.5 μg) + pGEM-T-B19 (1,000 copies)”를 사용하였으며, annealing 온도범위는 50~68ㅀC이다.
그 결과, 도 2B의 top panel 처럼, F1/R1프라이머쌍을 사용한 경우는 293 게놈 DNA만 포함한 PCR 반응에서도 비특이적인 DNA 증폭이 관찰되었으나, F2/R2 프라이머쌍 (도 2B, bottom panel)은 gradient 전 범위 (50~68ㅀC)에서 비특이적인 DNA 증폭이 관찰되지 않았다. 한편, 두 종류 프라이머쌍 모두 spiked control(293 게놈DNA + pGEM-T-B19)에서는 파보바이러스 B19에 특이적인 DNA 증폭만 일어난 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, F2/R2 프라이머쌍을 사용하였을 경우, 비특이적 증폭없이, annealing 온도는 50~68ㅀC 범위가 모두 비슷한 증폭효율을 보였으며 (robustness), 이러한 결과를 기준으로 하여 이 후의 실시예에서는 F2/R2 프라이머쌍을 이용한 61ㅀC의 annealing조건에서 PCR반응을 수행하였다.
실시예 4: 파보바이러스 B19 검출의 분석특이성, 반복성 및 재현성 확인
실시예 3에서 확인한 F2/R2 프라이머쌍을 이용한 파보바이러스 B19 검출방법의 분석특이성을 검증하기 위하여, 검체 단독 (293 genomic DNA, lane 1~3), 양성대조군 단독 (pGEM-T-B19, lane 4~6), spiked control (검체 + 양성대조군, lane 7~9), 음성대조군 (no template, lane 10~12) 형태로 PCR 반응을 수행하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 파보바이러스 B19 특이적인 증폭은 양성대조군 단독과 spiked control 에서만 관찰되었으며, 검체 단독 또는 음성대조군에서는 DNA 증폭이 관찰되지 않았다 (도 3A~C).
F2/R2 프라이머쌍을 이용한 파보바이러스 B19 검출방법의 반복성과 재현성을 검증하기 위해서 각 시험군당 3회 반복시험 (lane 1~3, lane 4~6, lane 7~9, lane 10~12)과 독립적인 3회 실험 (도 3A~C)을 수행하였다. 각 PCR조건에 따라 0.5μg의 293 게놈 DNA (293 gDNA) 또는 1,000 카피의 pGEM-T-B19를 첨가하였다. F2/R2 프라이머를 이용하여 35 싸이클로 B19 DNA를 증폭한 후, PCR 산물 10μl를 2% 아가로즈 젤에 전기영동하였다.
그 결과, 파보바이러스 B19 특이적인 PCR 증폭이 관찰되어야 하는 양성대조군 단독 (100%, 9/9)과 spiked control (100%, 9/9)에서 모두 예상되는 크기(168 bp)의 PCR 산물이 관찰되었으며, 한 시험자에 의해 수행된 3회 반복실험에서 모두 동일한 결과를 확인하였다.
실시예 5:파보바이러스 B19 검출의 민감도 확인
생물학적 제제, 특히 세포기질 또는 혈장에 존재할 수 있는 B19은 최소 104 IU (6,500 genomes)까지 검출할 수 있어야 한다. 따라서 민감도 실험에서는 검체인 293 게놈 DNA 0.5μg이 존재하는 조건에서 10,000~1.2 카피의 pGEM-T-B19를 spike하여 검출한계를 조사하였다. PCR반응의 주형은 293 세포로부터 분리한 0.5 μg의 genomic DNA에 pGEM-T-B19 (10,000~1.2 copies)를 spike하여 사용하였다. F2/R2 프라이머를 이용하여 35 싸이클로 B19 DNA를 증폭한 후, PCR product의 10μl를 2% 아가로즈 젤에 전기영동하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, pGEM-T-B19을 78 카피까지 검출할 수 있었으며, 이는 미국 FDA에서 제한하는 검출 민감도인 104 IU (6,500 genomes)이하의 범위에 해당한다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> SCT Co., LTD <120> Methods for Detecting Parvovirus B19 <130> P12-B020 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 atgccagggc cactagtaaa ctca 24 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tttatctgtg tcccagtggt ggtacg 26 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ctgacacatt aggaggtgac ccaa 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tgttaaggct ttcccagctc cagt 24

Claims (3)

  1. 서열번호 1과 서열번호 2로 구성되는 파보바이러스 B19 검출용 프라이머 쌍.
  2. 검체의 DNA를 서열번호 1과 서열번호 2로 구성되는 파보바이러스 B19 검출용 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 것을 특징으로 하는 파보바이러스 B19의 검출방법.
  3. 서열번호 1과 서열번호 2로 구성되는 프라이머 쌍을 포함하는 파보바이러스 B19 검출용 키트.
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