CN110904136A - 一种龙葵曲顶病毒侵染性克隆的构建方法 - Google Patents

一种龙葵曲顶病毒侵染性克隆的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种龙葵曲顶病毒侵染性克隆的构建方法，分别设计引物P1与P2，P3与P4，以pLB‑NCTV作为模板，PCR扩增NCTV的第一拷贝片段和NCTV的第二拷贝片段；设计引物P5与P6，以pCB301载体为模板，进行PCR，其产物作为NCTV侵染性克隆的载体骨架；采用多片段同源重组技术将第一和第二拷贝片段构建到所述载体骨架上，获得包含NCTV两个拷贝片段的侵染性克隆；本发明建立了龙葵曲顶病毒侵染性克隆构建体系，保证了病毒序列高保真度，致病性高，病毒侵染性克隆构建的成功率高，侵染效率高，同时还提供了龙葵曲顶病毒冻干阳性样品，对龙葵曲顶病毒的进一步研究具有重要意义。

Description

一种龙葵曲顶病毒侵染性克隆的构建方法
技术领域
本发明涉及微生物工程技术领域，具体而言，涉及一种龙葵曲顶病毒侵染性克隆的构建方法。
背景技术
龙葵是我国传统中药材，历史悠久。近年来由于其药用成分具有显著的抗肿瘤功效，龙葵逐渐引起国内外专家学者的高度重视。近期发现一种龙葵病害普遍发生，呈爆发趋势，感病植株呈现症状植株矮小、叶片扭曲、果实萎缩的症状，严重影响龙葵采收，防治形势不容乐观。
龙葵曲顶病毒自然条件下可大规模侵染茄科龙葵，表明该病毒具有入侵番茄、茄子、马铃薯、烟草等茄科作物的风险，但其传毒介体和寄主范围仍不清楚，需尽快明确。此外田间调查显示，浙江省某些地块的龙葵NCTV感染率高达70％；感病龙葵呈现植株矮小、新叶皱缩、果实凋零等症状，严重影响龙葵采收。一旦该病毒病蔓延到我国龙葵种植产区，将会对当地的龙葵产业带来较大影响。因此明确建立龙葵曲顶病毒快速检测手段符合我国龙葵产业的发展需求。
然而，目前产业上，我国暂无龙葵病毒病害发生报道。经文献查阅，未有发现龙葵曲顶病毒相关研究，缺乏龙葵曲顶病毒反向遗传学操作体系构建的报道；病毒检测上，也缺少龙葵曲顶病毒的阳性对照植物材料，导致相关病毒学研究无法开展。
发明内容
为解决上述问题，本发明第一方面提供一种龙葵曲顶病毒侵染性克隆构建方法，包括如下步骤：
(1)提取染病龙葵组织总DNA，设计特异性病毒全长基因组扩增引物，进行病毒序列扩增，回收扩增产物，构建pLB-NCTV，转化，测序，获得龙葵曲顶病毒全基因组序列；
(2)分别设计引物P1与P2，P3与P4，以pLB-NCTV作为模板，PCR扩增NCTV的第一拷贝片段和NCTV的第二拷贝片段；设计引物P5与P6，以pCB301载体为模板，进行PCR，其产物作为NCTV侵染性克隆的载体骨架；所述载体骨架、第一拷贝片段、第二拷贝片段彼此之间含有15bp的同源序列；
(3)采用多片段同源重组技术将第一和第二拷贝片段构建到所述载体骨架上，获得包含NCTV两个拷贝片段的侵染性克隆。
优选的，引物P1-P6序列分别如SEQ NO:1-SEQ NO:6所示。
优选的，所述方法还包括步骤(4)，将步骤(3)获得的侵染性克隆转化至大肠杆菌中，PCR筛选阳性克隆，提取阳性质粒；步骤(5)，采用电击法将步骤(4)所述阳性质粒转化至EHA105农杆菌感受态中并培养。
本发明第二方面，还提供了一种龙葵曲顶病毒侵染性克隆，采用上述龙葵曲顶病毒侵染性克隆构建方法构建获得。
本发明第三方面，还提供了一种上述龙葵曲顶病毒侵染性克隆的接种方法，包括如下步骤：
(1)挑取农杆菌单斑或农杆菌甘油菌于含相应抗生素的YEP液体培养基中，28℃230rpm振荡培养24～48h；
(2)配制诱导培养基，基础YEP培养基中加入MES和乙酰丁香酮至终浓度10mMMES和20μM乙酰丁香酮；
(3)4,000rpm离心15min收集菌体，去上清，用浸润缓冲液悬浮沉淀，菌悬浮液室温放置饥饿处理3h；
(4)选取5叶期左右的待接种植株，叶片扎孔，1mL注射器将农杆菌菌液沿小孔注入叶片中；
(5)浸润后的植物置于22℃温室中培养。
本发明第四方面，还提供了一种上述龙葵曲顶病毒侵染性克隆的鉴定方法，包括如下步骤：
(1)提取接种龙葵曲顶病毒侵染性克隆的植物总DNA；
(2)根据龙葵曲顶病毒全基因组序列设计检测引物P9与P10，所述检测引物P9与P10序列分别如SEQ NO:9和SEQ NO:10所示；
(3)以植物DNA为模板，P9与P10为检测引物进行PCR检测。
本发明第五方面，还提供了一种检测用NCTV冻干阳性样品的制备方法，包括如下步骤：
(1)在待接种植株上接种权利要求5所述龙葵曲顶病毒侵染性克隆；
(2)取感染显症系统叶片0.2g，放入装有颗粒状无水CaCl2容器中，CaCl2体积占容器一半以上，CaCl2上垫4层无菌纱布，均匀放入病叶；
(3)先将冷冻干燥机开机后预冻到-40℃以下，再将病叶分装上机真空干燥，开机时间约连续10～12h，当真空达到2×10-2mbar时，容器加盖并用胶布密封；
(4)处理完成后，样品置于-20℃冰箱中长期保存。
本发明第六方面，还提供了一种检测用NCTV冻干阳性样品，采用接种了上述龙葵曲顶病毒侵染性克隆的植株的感染显症系统叶片制得。
本发明的有益效果在于：本发明建立了龙葵曲顶病毒侵染性克隆构建体系，通过引物设计获得两对特异性引物，扩增得到的两个病毒拷贝包含了双生病毒两个病毒基因间隔区序列，保证了病毒序列高保真度，致病性高；另外本发明采用特殊的引物设计，扩增出的龙葵曲顶病毒两个拷贝片段及载体骨架相互含有一段同源序列，首次通过多片段同源重组方法将病毒两个拷贝片段构建到载体上构建病毒侵染性克隆，相较传统的酶切构建方法，本发明方法不依赖酶切位点，一步即可将病毒两个拷贝片段构建到载体上，操作简便并大大提高了病毒侵染性克隆构建的成功率；另外本发明还建立了龙葵曲顶病毒本氏烟侵染体系，方法简便，接种试验显示，侵染效率超过80％。
附图说明
图1为龙葵曲顶病毒侵染性克隆构建流程图；`
图2为接种龙葵曲顶病毒侵染性克隆本氏烟样本PCR产物胶图；
图3为接种龙葵曲顶病毒侵染性克隆15天后本氏烟植株叶片图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。
实施例1：龙葵曲顶病毒的全基因组序列测定
(1)植物DNA提取
采用CTAB法抽提病毒侵染组织的总DNA，具体方法为：取0.2g植物组织叶片，在液氮中磨成粉末，将粉末转移至1.5ml离心管中，加入600μL 65℃预热的CTAB提取液，快速混匀，65℃条件下保温30min，不时颠倒混匀；待冷至室温后加入500μL氯仿/异戊醇(24：1)，颠倒混匀，12000rpm，离心5min；取上清液，加入600μL预冷的异丙醇，颠倒混匀，12000rpm，离心5min；弃去上清液，沉淀用800μL，70％的乙醇洗涤沉淀两次；稍干燥，将DNA沉淀溶解于30μL灭菌的双蒸水，4℃保存。
(2)病毒序列的扩增
根据病毒全长基因组扩增引物P7和P8(引物序列参见表1)，利用PCR技术获得病毒全长2867bp序列。PCR反应体系如下：以发病植物总DNA作为模板，选择KOD-Plus-Neo高保真DNA聚合酶进行目的片段的扩增，反应体系如下：
Figure BDA0002256237640000041
PCR反应循环的设置：
98℃ 3min
98℃ 10sec
56℃ 10sec
68℃ 2min
30循环数
68℃ 5min
(3)回收测序
回收长度为2867bp的DNA产物，并将其连接到pLB平末端载体，pLB平末端连接反应体系如下：
Figure BDA0002256237640000051
轻弹离心管以混匀反应液，短暂离心3-5sec，将混合反应液放置室温(22℃)反应5min。反应结束后，将离心管置于冰上，进行后续的转化反应，转化步骤如下：
1)取100μL大肠杆菌感受态细胞于冰上解冻；
2)加入质粒或者连接产物，混匀后冰上静置20min；
3)将菌42℃水浴热激90sec，立即放入冰上4min；
4)加入800μL LB恢复培养基，37℃培养1h；
5)8,000rpm离心2min，弃上清，留100μL上清悬浮沉淀，均匀涂布于含相应抗生素的固体LB平板，37℃培养过夜。
PCR筛选阳性大肠杆菌，提质粒，质粒小量提取试剂盒购自Axygen公司，步骤如下：
1)收集1～4mL过夜培养菌液，12,000rpm离心1min，去上清；
2)加沉淀入250μL Buffer S1，涡旋振荡，充分悬浮细菌沉淀；
3)加入250μL Buffer S2，上下翻转离心管6～8次，直至溶液清澈透亮；
4)加入350μL Buffer S3，温和上下翻转离心管6～8次，至有白色絮状沉淀产生；12,000rpm离心10min；
5)小心吸取上清转移到DNA离心柱中，12,000rpm离心1min，弃滤液；
6)500μL W1缓冲液，12,000rpm离心1min，弃滤液；
7)加700μL W2缓冲液，12,000rpm离心1min，弃滤液。重复步骤6一次；
8)12,000rpm空离1min；
9)加入60μL的65℃预热的ddH2O，室温静置1min后12,000rpm离心1min。
终载体送测序公司进行DNA测序，测序结果如序列表SEQ NO:11所示，命名测序正确的载体为pLB-NCTV。
实施例2：龙葵曲顶病毒侵染性克隆的构建
构建流程参见图1，双生病毒侵染性克隆需要将病毒的1.3–2.0个全长拷贝(需携带两个病毒基因间隔区序列，即IR区)。以pCB301载体为模板，以P1与P2为引物，进行PCR，其产物作为NCTV侵染性克隆的载体骨架。以pLB-NCTV作为模板，P3与P4为引物，PCR扩增NCTV的第一个拷贝片段(长度2867bp)。以pLB-NCTV作为模板，P5与P6为引物，PCR扩增NCTV的第二个拷贝片段(长度2867bp)。通过引物设计确保以上载体、两个拷贝片段彼此之间含有15bp的同源序列，利用多片段同源重组克隆技术(Infusion)获得包含NCTV两个拷贝的侵染性克隆载体，PCB301-NCTV 2.0。P1-P6引物序列参见表1。
多片段同源重组克隆(Infusion)体系如下：
Figure BDA0002256237640000061
轻轻混合，50℃反应15min。反应后产物置于冰上冷却，可直接用于大肠杆菌的转化实验。
PCR筛选阳性克隆，提取阳性质粒，并将阳性质粒转化至EHA105农杆菌感受态中。农杆菌转化采用电击法，方法如下：
1)取100μL农杆菌感受态细胞，冰上融化；
2)取2～5μL质粒加入到感受态细胞中，混匀，转移至2mm电击杯中，冰上放置10min；
3)BIO-RAD公司电击仪设置：电压：2,500V，电阻：200欧，电容：25μF，直径：2mm；
4)擦干电击杯，将电击杯正确插入电击槽中，进行电击；
5)电击完成后将电击置于冰上；
6)电击杯置于室温2min，加入适量YEP恢复培养基，28℃静置培养1～3h；
7)8,000rpm离心2min，弃上清，剩余200μL上清用以悬浮沉淀。最后悬浮溶液涂布于含相应抗生素的YEP固体培养基，28℃培养箱2-3天。
实施例3：侵染性克隆的接种与鉴定
1农杆菌介导的NCTV侵染性克隆的接种
1)农杆菌培养：挑取农杆菌单斑或农杆菌甘油菌于含相应抗生素的YEP液体培养基中，28℃230rpm振荡培养24～48h；
2)农杆菌转接：配制诱导培养基，基础YEP培养基中加入MES和乙酰丁香酮至终浓度10mM MES(pH＝5.6，母液浓度为100mM)和20μM乙酰丁香酮(母液浓度为200mM)；
3)4,000rpm离心15min收集菌体，去上清，用浸润缓冲液(10mM MgCl2，10mM MES，200μM乙酰丁香酮)悬浮沉淀，菌悬浮液室温放置饥饿处理3h；
4)选取5叶期左右的本氏烟植株，叶片扎孔，1mL注射器将农杆菌菌液沿小孔注入叶片中；
5)浸润后的植物置于22℃温室中培养。
2NCTV侵染性克隆在本氏烟上的致病性分析
接种本氏烟后进行症状观察，对所有接种植株进行PCR检测。症状分析发现，接种10本氏烟其系统叶产生上卷皱缩现象，PCR检测均为阳性(图2)，引物为P9与P10(引物序列参见表1)，15天后成熟叶片边缘呈现上卷(图3)。多次接种实验数据显示(参见表2)，NCTV在本氏烟上的侵染效率较高(>80％)。
表1引物序列
序号 序列表序号 引物名称 引物序列
P1 SEQ NO:1 NCTV/copy1/F GCATGCCTGCAGGTCCATTGTGTGTACGTGAGTGAC
P2 SEQ NO:2 NCTV/copy1/R CACGTACACACAATGCCAGAATGGCTGCTATTTCG
P3 SEQ NO:3 NCTV/copy2/F TAGCAGCCATTCTGGCATTGTGTGTACGTGAGTGAC
P4 SEQ NO:4 NCTV/copy2/R TAACATAGATGACACCCAGAATGGCTGCTATTTCG
P5 SEQ NO:5 pCB301/NCTV/BB/F GTGTCATCTATGTTACTAGATCGGAATTC
P6 SEQ NO:6 pCB301/NCTV/BB/R GACCTGCAGGCATGCAAGCT
P7 SEQ NO:7 NCTV-F GCGTTTATAGTGAAATGTTTAGGCAT
P8 SEQ NO:8 NCTV-R CAAGAATATCTTCCTCACATATCCCAG
P9 SEQ NO:9 NCTV/T1/F ATGTCGAAATGTCTGGGGTT
P10 SEQ NO:10 NCTV/T1/R ACTTCGACCCTCGAAACTTC
表2接种效率数据
实验1 实验2 实验3 总接种效率
16/20 15/20 19/20 50/60(83.3％)
实施例4：检测用NCTV冻干阳性样品的制备
取感染显症系统叶片0.2g，放入装有颗粒状无水CaCl2容器中，CaCl2体积占容器一半以上，CaCl2上垫4层无菌纱布，均匀放入病叶，然后对样品进行冷冻干燥处理，步骤如下：先将冷冻干燥机开机后预冻到-40℃以下，再将病叶分装上机真空干燥，开机时间约连续10～12h，当真空达到2×10-2mbar时，容器加盖并用胶布密封，样品置于-20℃冰箱中长期保存。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
序列表
<110> 中国计量大学
<120> 一种龙葵曲顶病毒侵染性克隆的构建方法
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcatgcctgc aggtccattg tgtgtacgtg agtgac 36
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cacgtacaca caatgccaga atggctgcta tttcg 35
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tagcagccat tctggcattg tgtgtacgtg agtgac 36
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
taacatagat gacacccaga atggctgcta tttcg 35
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgtcatcta tgttactaga tcggaattc 29
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gacctgcagg catgcaagct 20
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcgtttatag tgaaatgttt aggcat 26
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caagaatatc ttcctcacat atcccag 27
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgtcgaaat gtctggggtt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acttcgaccc tcgaaacttc 20
<210> 11
<211> 2867
<212> DNA
<213> 龙葵曲顶病毒全基因组序列(Nightshade Curly Top Virus)
<400> 11
accggagtgc cctccccgcc ctcttaaata gtgggccccg cataggggtg ttgttgtctt 60
ttcactagtt caataatgcg taaaaagccg ctattatgat tgggccactg tttataatgg 120
ccttataagg cccttaatta attgggcccc aagtttgtcc ttatctgcag ctttatataa 180
agctgcagtc cccttattaa agtaatggcc accatcaatt gtcggatatg tgggtctgag 240
tcctgtccag tcaatgaacg ctttagcgtt tgtgaatctc gaggcgctac tctgagcgat 300
ttcctcttgt attttcgtag aaaatacata gaaacttcac ctggcttgat ctactatctc 360
aatgccttac aagcggaaat taacgagtta ttttccgcaa tcaaagaagt ttcgagggtc 420
gaagtcgggt ctggcgcttg tgaaaacaag tgccagtcgt cgggtgtaca gaaagggaaa 480
acgcaagcct gatcgtataa agacttatac gtattccttt tccagtattg ctaatgataa 540
gggtacaatt gtgtatatga atagctggtc tttgggcctt ggcccaaatc agcgtgggag 600
tgacatcgag atcttgaagt ccatgtatct tcgtctgtgt gtctctttgt cggaggctgc 660
tgctgctcag gttaagtctt atatggttaa gtgggctttg atcgtggatc aaatccctgg 720
tgaaaccctt gttggtgttg gggatgtctt taagacatgc ccggcccctt atcaatatgt 780
gcaatgtgca tacattgcag atgataatca cggtcgcttt caagtcttga ggagtggttt 840
cttaacctta aatgctaatg gccttgctgt tggatcaaca acaagaactg gatgtgcagc 900
tatgaagaat atggcgtctg ttaataaatt ttgtaaaaat ttaaatgtta ggtgtgtata 960
tgatgctgat agtgcaaccg gtgacatcgc taatattaag cgtggagccg tttatcttgt 1020
aatttggccg gatattgaga tccggtatgg attttcatgt actatgtatc atagaaatgg 1080
aaattcataa taattgaatt aataaagtct catttttata ttataataaa aacttggagc 1140
ataaaataca cgatcatcaa atagatcgat aaaatgattt atcgatctaa ttacattgtt 1200
aatactaata acacccaaat tatttaaata tttcattaca tgaaatctaa atctctttaa 1260
taatgcttct ccactcagac gaggtgatac tgaaagtacc accaagttca gccagcatat 1320
ctggagatcc aacgctttcc gaaggttgtg gtttgctctg atctggagag ttattatctg 1380
gttccctgtt gacagggttg ttgtgttgtg tagtttgaag tatatcgggt tctggagatc 1440
gtcgaaatag cagccattct ggcattgtgt gtacgtgagt gactcccctg tgcgtgaatc 1500
catctggaca gttgatgccc ccgtaatatg agcacccaca agcaaggtga actgccttgc 1560
gtctttgctt ctttggggcc caagtttgtt tggggggtct cttccttatc ttaggtggtg 1620
gtggaagtct ctcgtttacg tcgtcgggat gttcgcaatt ccagcagaat cctgaagtct 1680
cttcttctaa ttcgtgaatg ccgttgtcac agagtgtgat cattgtatag aggctctgtt 1740
agtttgatga acacagcatt tgagagtgtc caccttttta aagcctcatt ttcttccttc 1800
tcgaggaagt cttgaaaaga tgtgtcccca ccagggttgc acagtataat tgatgggacc 1860
ccgcctttaa tttgaactgg ttttccatat ttacaatttg actgccagtc cttctgggcc 1920
ccaataagct ctttccagtg ctttaacttt agatagtgcg gtgtgacgtc atctatgacg 1980
ttgtactccg cattatttga atacactctg ctgttgaaat ccaggtgacc ggaaaggtaa 2040
ttatgtgaac caagacttct tgcccacatt gttttgccgg tcctagaatc gccttctata 2100
ataattccta taggtcttat aggccgcgca gcggcactaa catcgaaata attatcagcc 2160
cactcttgca tatcttcagg aacgttagta aatgaagata attcaaacgg agggacaaac 2220
ggagttggtg ccggagtaaa aatcttatct aaattacaaa ctaaattatg ataacaaaat 2280
aaaaaatctt taggtagctt ttcttttatt atttgtagag cttcctcttt tgaggaagcg 2340
tttaacgcct ctgcgcatgc atcgttagct gtctgctgac ctcctctagc agatcgtcca 2400
tcgatctgaa aactacccca gtcgatgtaa tctccgtcct tctcgatgta ggacttgaca 2460
tcagatgcgg actttgcccc ctgaaagttg gggtggaatt gggtgctagt agaaggatgg 2520
gtgatgtcga aatgtctggg gtttctgaat ttggccttac ccttgaactg gatgagggca 2580
tggatatgca attccccatc gtcgtggtgt tctgaggaaa ccctaataaa taatttatct 2640
gaaggacaag aaatgttctt cagtaattct aaaacttgtt cttttggtaa tgggcatctg 2700
ggatatgtga ggaagatatt cttggcgttt atagtgaaat gtttaggcat tttgatgtcg 2760
ttttgtgtgt aaagctctgc gttttgtatc ggggacgttc taaaactctg agaaatgggg 2820
gactttgggg acgcatttat agggggaggg cactccgtat taatatt 2867

Claims (8)

1.一种龙葵曲顶病毒侵染性克隆的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取染病龙葵组织总DNA，设计特异性病毒全长基因组扩增引物，进行病毒序列扩增，回收扩增产物，构建pLB-NCTV，转化，测序，获得龙葵曲顶病毒全基因组序列，如SEQ NO:11所示；
(2)分别设计引物P1与P2，P3与P4，以pLB-NCTV作为模板，PCR扩增NCTV的第一拷贝片段和NCTV的第二拷贝片段；设计引物P5与P6，以pCB301载体为模板，进行PCR，其产物作为NCTV侵染性克隆的载体骨架；所述载体骨架、第一拷贝片段、第二拷贝片段彼此之间含有15bp的同源序列；
(3)采用多片段同源重组技术将第一和第二拷贝片段构建到所述载体骨架上，获得包含NCTV两个拷贝片段的侵染性克隆。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引物P1-P6序列分别如SEQ NO:1-SEQNO:6所示。
3.如权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(4)，将步骤(3)获得的侵染性克隆转化至大肠杆菌中，PCR筛选阳性克隆，提取阳性质粒；步骤(5)，采用电击法将步骤(4)所述阳性质粒转化至EHA105农杆菌感受态中并培养。
4.一种龙葵曲顶病毒侵染性克隆，其特征在于，采用权利要求1-3任一项所述方法构建获得。
5.一种如权利要求4所述龙葵曲顶病毒侵染性克隆的接种方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)挑取农杆菌单斑或农杆菌甘油菌于含相应抗生素的YEP液体培养基中，28℃230rpm振荡培养24～48h；
(2)配制诱导培养基，基础YEP培养基中加入MES和乙酰丁香酮至终浓度10mM MES和20μM乙酰丁香酮；
(3)4,000rpm离心15min收集菌体，去上清，用浸润缓冲液悬浮沉淀，菌悬浮液室温放置饥饿处理3h；
(4)选取5叶期左右的待接种植株，叶片扎孔，1mL注射器将农杆菌菌液沿小孔注入叶片中；
(5)浸润后的植物置于22℃温室中培养。
6.一种如权利要求4所述龙葵曲顶病毒侵染性克隆的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取接种龙葵曲顶病毒侵染性克隆的植物总DNA；
(2)根据龙葵曲顶病毒全基因组序列设计检测引物P9与P10，所述检测引物P9与P10序列分别如SEQ NO:9和SEQ NO:10所示；
(3)以植物DNA为模板，P9与P10为检测引物进行PCR检测。
7.一种检测用NCTV冻干阳性样品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)在待接种植株上接种权利要求5所述龙葵曲顶病毒侵染性克隆；
(2)取感染显症系统叶片0.2g，放入装有颗粒状无水CaCl2容器中，CaCl2体积占容器一半以上，CaCl2上垫4层无菌纱布，均匀放入病叶；
(3)先将冷冻干燥机开机后预冻到-40℃以下，再将病叶分装上机真空干燥，开机时间约连续10～12h，当真空达到2×10-2mbar时，容器加盖并用胶布密封；
(4)处理完成后，样品置于-20℃冰箱中长期保存。
8.一种检测用NCTV冻干阳性样品，其特征在于，采用接种了权利要求4所述龙葵曲顶病毒侵染性克隆的植株的感染显症系统叶片制得。
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