CN109266643A - 葡萄浆果内坏死病毒侵染性克隆及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种葡萄浆果内坏死病毒侵染性克隆及其构建方法。该侵染性克隆载体是将分段扩增的葡萄浆果内坏死病毒基因组片段通过无缝克隆方式，连接至含有双35S启动子和核酶HDV‑RZ的pCB301‑2x35S‑HDV_RZ‑NOS载体而获得。通过冻融法将此载体转入农杆菌EHA105感受态细胞，并通过农杆菌接种西方烟草和葡萄验证其侵染性。本发明构建的GINV侵染性克隆能够在农杆菌EHA105菌株中稳定、高效表达，并能成功侵染西方烟草和葡萄寄主。GINV侵染性克隆的获得，使得GINV的研究易于在DNA水平上操作，为后续开展GINV的生物学特性和致病性研究提供有力的工具。

Description

葡萄浆果内坏死病毒侵染性克隆及其构建方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及葡萄浆果内坏死病毒侵染性克隆及其构建方法。

背景技术

1984年于日本巨峰葡萄上首次发现葡萄浆果内坏死病(最早称花叶病)，该病在日本山梨县葡萄园造成严重危害。一些敏感品种(如巨峰、先锋、立川无核、康拜尔早生)感染该病后，植株生长减弱，春季萌芽延迟，并且表现茎内坏死、短节、花叶、果粒小、果外变色和果内坏死等症状。病株摩擦接种菎诺藜后，发现了一种大小为740×12nm的线形病毒，命名为葡萄浆果内坏死病毒(Grapevine berry inner necrosis virus，GINV)。GINV属发状病毒属(Trichovirus)的成员之一，其基因组由3个开放阅读框组成，分别编码复制酶(RP)、移动蛋白(MP)和外壳蛋白(CP)。2016年，该病毒在我国葡萄上首次报道，并初步表明GINV与葡萄表现褪绿斑驳和环斑症状发生相关。对来自我国15个省(市)自治区的195个葡萄样品进行GINV检测，结果显示GINV在我国葡萄上的检出率为35.9％，在表现明显环斑症状的葡萄上的检出率为94.1％，已严重影响了我国葡萄的产量和品质。作为国内新报道的一个葡萄病毒，有必要对其致病性进行深入研究，为其危害规律及综合防控技术研究提供理论依据。

开展病毒致病性研究，对于今后病毒病的防控至关重要。葡萄病毒在田间多复合侵染，因此，很难将一种葡萄病毒与某一特定的症状联系起来。对于一些新的葡萄病毒，往往通过田间症状观察、大量样品的病毒检测、病毒序列分析、嫁接传毒实验等研究，来明确病毒与田间症状的相关性。由于葡萄病毒均难纯培养，很难完成柯赫氏法则的第三条规则(即将纯培养接种到相同品种的健康植株上，出现症状相同的病害)，因此，大部分葡萄病毒与某一病害之间的关系均没有直接的证据证明。

病毒侵染性克隆是病毒致病性研究的有力工具，可用于证明病毒与病害的关系，完成病毒的柯赫氏法则。病毒侵染性克隆的构建是将病毒全长cDNA片段插入到来源花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S强力启动子的下游，从而启动病毒cDNA在真核植物中转录，获得具有侵染性的病毒RNA。采用侵染性克隆接种无病毒植物，可明确病毒与植物病害之间的关系。目前，尚未发现关于构建侵染葡萄的发状病毒属病毒侵染性全长cDNA克隆的报道，且GINV与病害发生的直接关系尚未证明。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何快速、高效的构建得到葡萄浆果内坏死病毒(GINV)侵染性全长cDNA克隆。

第一方面，本发明保护一种葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆的构建方法。

本发明提供的葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆的构建方法包括如下步骤：将葡萄浆果内坏死病毒基因组全长cDNA第1-4978位所示的DNA片段和葡萄浆果内坏死病毒基因组全长cDNA第4962-7229位所示的DNA片段通过无缝克隆方式连接至植物表达载体中，得到含有葡萄浆果内坏死病毒全长cDNA的重组表达载体；所述重组表达载体即为葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆；

所述葡萄浆果内坏死病毒基因组全长cDNA序列如序列表中序列1所示。

上述方法中，所述植物表达载体含有35S启动子和核酶(HDV-RZ)基因。所述35S启动子用于启动所述葡萄浆果内坏死病毒全长cDNA的表达。所述核酶基因的作用是当重组表达载体在植物体内表达后，核酶可在合适的位置切下GINV病毒基因组。

进一步的，所述35S启动子可为双35S启动子(2×35S promoter)。

更进一步的，所述植物表达载体具体可为含有双35S启动子(2×35S promoter)和核酶基因的pCB301-2x35S-HDV_RZ-NOS载体。

上述方法中，将葡萄浆果内坏死病毒基因组全长cDNA第1-4978位所示的DNA片段和葡萄浆果内坏死病毒基因组全长cDNA第4962-7229位所示的DNA片段通过无缝克隆方式连接至植物表达载体中的方法具体如下：

1)以葡萄浆果内坏死病毒的cDNA为模板，分别采用5'half1a/1b和3'half2a/2b进行PCR扩增，分别得到GINV 5'扩增片段(含有序列1第1-4978位所示的DNA分子)和GINV 3'扩增片段(含有序列1第4962-7229位所示的DNA分子)；

2)用限制性内切酶Stu I和Sma I对pCB301-2x35S-HDV_RZ-NOS载体进行双酶切，得到双酶切后的载体；

3)利用无缝克隆试剂盒将所述双酶切的载体与所述GINV 5'扩增片段和所述GINV3'扩增片段进行连接，得到所述重组表达载体。

进一步的，所述连接的条件可为50度连接1h。

第二方面，本发明保护利用上述方法制备得到的葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆。

第三方面，本发明保护含有上述葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆的重组菌。

进一步的，所述重组菌为含有所述葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆的农杆菌。

更进一步的，所述农杆菌具体可为农杆菌EHA105。

第四方面，本发明保护上述葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆或含有上述葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆的重组菌的新用途。

本发明保护上述葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆或含有上述葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆的重组菌在制备单一病毒侵染植物模型中的应用；所述单一病毒为葡萄浆果内坏死病毒。

本发明还保护上述葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆或含有上述葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆的重组菌在研究葡萄浆果内坏死病毒生物学特性和/或致病机理中的应用。

本发明还保护上述葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆或含有上述葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆的重组菌在研究葡萄浆果内坏死病毒与宿主植物互作中的应用。

本发明的有益效果如下：本发明首次成功构建葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆，并经过PCR和病毒粒子观察，证明其可成功侵染烟草和葡萄，而且采用该侵染性全长cDNA克隆侵染葡萄，可引起明显症状，该症状与田间自然感染该病毒的贝达葡萄症状相同。

本发明将分段扩增的葡萄浆果内坏死病毒基因组片段通过无缝克隆方式，连接至含有双35S启动子和核酶HDV-RZ的pCB301-2x35S-HDV_RZ-NOS载体，得到含有GINV基因组全长cDNA的重组载体，通过冻融法将此重组载体转入农杆菌EHA105感受态细胞，并通过农杆菌接种西方烟草和葡萄验证其侵染性。通过实验证明：本发明构建的GINV侵染性全长cDNA克隆能够在农杆菌EHA105菌株中稳定、高效表达，并能成功侵染西方烟草和葡萄寄主。本发明构建的GINV侵染性全长cDNA克隆为首个侵染葡萄的发状病毒属病毒的侵染性克隆，采用该侵染性克隆对无病毒葡萄进行接种，获得GINV单一侵染葡萄的毒源材料，对进一步明确GINV的致病性具有重要理论和实践意义。同时GINV侵染性克隆的获得，也使得GINV的研究易于在DNA水平上操作，为后续开展GINV的生物学特性和致病性研究提供有力的工具。

附图说明

图1为GINV基因组全长cDNA的分段扩增结果。M：DNA marker DL5000；1：引物5'half1a/1b扩增结果；2：引物3’half2a/2b扩增结果。

图2为pCB301-2x35S-HDV_RZ-NOS载体Stu I和Sma I双酶切电泳图。M：DL5000marker；1-6：双酶切结果。

图3为重组质粒的结构图。

图4为农杆菌PCR鉴定。M：DL2000marker；CK-：阴性对照；2-9：农杆菌克隆PCR结果。

图5为农杆菌注射法将GINV侵染性克隆接种西方烟草一周后的症状表现。

图6为采用引物GINVCP1A/1B和GINVMP1A/1B对接种后表现症状的烟草的PCR鉴定。M：DL2000marker；1-20：接种显症的西方烟草；ck+：阳性对照(感染GINV的植株)；ck-：阴性对照(含空载体的农杆菌菌液接种的植株)。

图7为接种后显症烟草中GINV粒子的电镜观察。

图8为GINV侵染性克隆接种葡萄后的PCR鉴定结果。M：DL2000marker；CK-：阴性对照(含空载体的农杆菌菌液接种的植株)；2-7：接种的葡萄组培苗；CK+：阳性对照(感染GINV的植株)。

图9为GINV侵染性克隆接种贝达葡萄的症状表现。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中用于GINV侵染性克隆构建的病毒分离物来源于一株表现明显褪绿斑驳和环斑症状的贝达葡萄样品，经鉴定为GINV分离物LN_BETA_RS，记载于文献：“Identification of a divergent variant of grapevine berry inner necrosisvirus in grapevines showing chlorotic mottling and ring spotsymptoms.Archives of virology”中。

下述实施例中用于扩增GINV基因组全长片段的超保真PCR试剂盒(E0553L)是北京NEB公司的产品；限制性内切酶是宝生物公司(Takara)的产品；DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒、零背景pTOPO-Blunt平末端克隆试剂盒、无缝克隆试剂盒均是北京艾德莱生物科技有限公司的产品；MES溶液、乙酰丁香酮及抗生素均是Sigma公司的产品；引物均由生工生物(上海)股份有限公司合成。

下述实施例中的pCB301-2x35S-HDV_RZ-NOS载体含有2×35S promoter和核酶(HDV-RZ)，记载于文献“姚敏，张天奇，田志超，王源超，陶小荣；农杆菌介导的CMV侵染性克隆及2b缺失突变体构建；中国农业科学；2011，44(14):3060-3068”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的葡萄浆果内坏死病毒(GINV)基因组全长cDNA序列如序列表中序列1所示。

实施例1、葡萄浆果内坏死病毒侵染性克隆的构建及其侵染性验证

一、葡萄浆果内坏死病毒侵染性克隆的构建

1、cDNA的合成

(1)RNA的提取

采集感染葡萄浆果内坏死病毒(GINV)的贝达葡萄叶片，按照文献：范旭东等人，植物病理学报，2014，44(5):455-460中报道的柱式提取方法进行RNA提取，并通过超微量紫外可见分光光度计(SDS-11)测定RNA的浓度。

(2)反转录合成cDNA

反转录在1.5mL灭菌离心管中进行，依次加入灭菌纯水7.0μL、oligodT₁₈(上海生工生物工程技术服务公司合成)1.0μL，总RNA 2.0μL，离心混匀，95℃水浴5min，冰上放置2min；加入5×M-MLV buffer 5.0μL、10mmol·L^-1dNTPs 1.5μL、200U·mL^-1M-MLV逆转录酶0.8μL、灭菌纯水2.7μL，37℃水浴10min，42℃50min，70℃5min。合成的cDNA立即进行PCR扩增或者放-20℃冰箱保存。

2、PCR扩增

(1)引物的设计

设计使扩增产物之间有17nt重叠区域，又分别与载体pCB301-2x35S-HDV_RZ-NOS两端序列有20nt重叠区域的扩增引物。引物序列如下：

5'half1a：catttcatttggagaggcctGATAAGTAGTTGACAGTGATCAATTG；

5'half1b：agacatcaaAGGCCTCGTAATCAGATTC；

3’half2a：cgaggcctTTGATGTCTCACAGGACC；

3’half2b：ccatgccgacccggggatccT₍₄₀₎GGAAATTAATTAAAAC(“T₍₄₀₎”代表碱基T的个数为40)。

(2)PCR扩增

以步骤1合成的cDNA为模板，分别采用5'half1a/1b和3'half2a/2b进行PCR扩增，分别得到GINV 5'扩增片段(含有序列1第1-4978位所示的DNA分子)和GINV 3'扩增片段(含有序列1第4962-7229位所示的DNA分子)。

扩增采用NEB公司的高保真扩增试剂盒进行，PCR反应体系为25μL：5.0μL5×Phution buffer，1μL正向和反向引物混合物(各10μM)，0.5μL dNTPs(10mM)，0.3μLPhusion DNA聚合酶(2U/μL)，2μL cDNA第一链合成产物和15.2μL ddH₂O。PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸1min30s，循环35次；最后72℃10min。扩增产物通过回收试剂盒进行纯化回收。

GINV基因组全长cDNA的分段扩增产物的电泳图如图1所示。

3、重组质粒的构建及鉴定

(1)重组质粒的构建

采用限制性内切酶Stu I和Sma I对pCB301-2x35S-HDV_RZ-NOS载体(pCB301-2x35S-HDV_RZ-NOS载体含有2×35S promoter和核酶HDV-RZ)进行双酶切，经1％的琼脂糖凝胶电泳分离，回收，得到双酶切的pCB301-2x35S-HDV_RZ-NOS载体。pCB301-2x35S-HDV_RZ-NOS载体的Stu I和Sma I双酶切电泳图如图2所示。

利用无缝克隆试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)将双酶切的pCB301-2x35S-HDV_RZ-NOS载体与GINV基因组全长cDNA的2个扩增片段(GINV 5'扩增片段和GINV 3'扩增片段)在50度条件下连接1h。连接完成后，将连接产物通过热激法转化大肠杆菌DH5ɑ，涂布在含有kan抗生素的平板上，37℃培养，筛选含有GINV基因组全长cDNA的重组质粒。

(2)阳性重组质粒的鉴定

对克隆菌液进行质粒抽提，并通过浓度为0.8％琼脂糖胶电泳，根据质粒条带的大小判断阳性克隆。采用两对引物GINVCP1A/1B和GINVMP1A/1B分别对阳性克隆菌液进行PCR鉴定，扩增片段大小分别为585bp和968bp。引物序列如下：

GINVCP1A：5’-ATGTCGATMAGRCAGGAATTG-3’；

GINVCP1B：5’-CATAGTAAAAGCACCCTCGCT-3’；

GINVMP1A：5’-WMGKGTTTCTGGGAAGATTGC-3’；

GINVMP1B：5’-KACSAGATCCCTCAATTCCTG-3’。

阳性重组质粒为将pCB301-2x35S-HDV_RZ-NOS载体的Stu I和Sma I酶切位点间的片段替换为序列1所示的GINV基因组全长cDNA序列，且保持载体pCB301-2x35S-HDV_RZ-NOS的其他序列不变后得到的质粒。重组质粒的结构图如图3所示。

二、重组质粒转化农杆菌感受态细胞

1、阳性重组质粒转化农杆菌EHA105感受态细胞

取-80℃保存的农杆菌感受态EHA105(北京华越洋生物科技有限公司，货号为GX0133-100)于冰上融化。每100μL感受态EHA105加1μg步骤3制备的阳性克隆质粒混匀，依次于冰上静置10分钟、液氮5分钟、37℃孵育5分钟、冰浴5分钟。加入700μL无抗生素的LB液体培养基，于28℃振荡培养2～3小时。5000rpm离心一分钟收菌，留取100μL左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于50μg/mL的Km和50μg/mL的Rif的LB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。

2、阳性克隆鉴定

以步骤1中LB平板上生长的菌落为模板，采用GINVMP1A/1B引物进行PCR鉴定，筛选阳性克隆。结果显示挑取的8个克隆均为阳性(图4)。

三、葡萄浆果内坏死病毒侵染性克隆接种西方烟草及其侵染性验证

1、葡萄浆果内坏死病毒侵染性克隆接种西方烟草

将步骤二中获得的阳性单克隆接种到含有50μg/mL的Km和50μg/mL的Rif的LB液体培养基中，在28℃，200rpm的摇床上摇菌培养至OD600为1.0左右，8000rpm离心10min，收集沉淀。采用接种液(接种液配方：10mM MgCl₂，10mM MES，100μM乙酰丁香酮)溶解沉淀，并调整OD600至1.0。静置4-5h后通过注射器接种4叶期的西方烟苗叶片，使接种液充满整个叶片，每株烟草接种两片叶片。接种后把西方烟苗置于黑暗中12h，然后在25℃隔离温室下培养。接种后每天观察发病情况。采用PCR方法对接种后的烟草进行鉴定，并通过电镜观察确定侵染性克隆接种后可形成的病毒粒子。同时以含有空载体的农杆菌菌液作为阴性对照。

2、侵染性验证

经观察，本发明构建的GINV侵染性克隆通过农杆菌注射法接种西方烟草7天后西方烟草表现明显的褪绿斑驳症状(图5)。为了验证GINV侵染性克隆是否侵染成功，采用GINVCP1A/1B和GINVMP1A/1B对20棵表现褪绿斑驳症状的西方烟草进行PCR鉴定，结果显示20棵烟草中均能扩增出GINV的特异性条带(图6)。为了验证GINV侵染性克隆侵染后是否形成病毒粒子，对显症烟草(表现褪绿斑驳症状的西方烟草)进行了电镜观察，结果显示显症烟草中可观察到GINV病毒粒子(图7)。上述实验表明本发明构建的GINV侵染性克隆具有良好的侵染活性，且对草本植物的侵染率达100％。

四、葡萄浆果内坏死病毒侵染性克隆接种贝达葡萄及其侵染性验证

1、葡萄浆果内坏死病毒侵染性克隆接种贝达葡萄

将步骤二中获得的阳性单克隆接种到含有50μg/mL的Km和50μg/mL的Rif的LB液体培养基中，在28℃，200rpm的摇床中培养至OD600为1.0左右，8000rpm离心10min，收集沉淀。用含100μM的乙酰丁香酮(AS)、1mg/L BA和0.5mg/L NAA的1/2MS培养基溶解沉淀，调OD值约为1.0，超净工作台上分装至试管中，每个试管约20mL。用接种针将组培苗葡萄根扎刺，每个根扎2个部位，用滤纸固定置试管中，使根部完全浸入液体中，放置在光照培养室中培养。培养10天后，转入新鲜的MS液体培养基，再培养15天。之后，转移到含500mg/L头孢噻肟(sigma0.6g溶于12mL无菌水)的新鲜MS固体培养基中，放置在光照培养室中培养，得到葡萄苗。对接种成活的葡萄苗进行PCR鉴定，并将经PCR鉴定为GINV阳性的组培苗移栽至田间。移栽后每天观察发病情况。同时以含有空载体的农杆菌菌液作为阴性对照。

2、侵染性验证

通过农杆菌侵染组培苗根的方法将本发明构建的GINV侵染性克隆接种无病毒贝达葡萄组培苗，采用GINVMP1A/1B引物对接种成活的葡萄苗进行PCR鉴定。结果显示，部分组培苗已感染GINV(图8)。将经PCR鉴定为GINV阳性的组培苗移栽至田间，结果显示移栽成活后，侵染性克隆接种的无病毒贝达葡萄表现明显的褪绿斑驳症状(图9)。上述实验表明本发明构建的GINV侵染性克隆具有良好的侵染活性，对葡萄的侵染率可达33％。

综合所述，本发明所构建的GINV侵染性克隆能够成功侵染烟草和葡萄寄主。采用本发明的GINV侵染性克隆对无病毒葡萄进行接种，可获得GINV单一侵染葡萄的毒源材料，对进一步明确GINV的致病性具有重要理论和实践意义。同时也使得GINV的研究易于在DNA水平上操作，为后续开展GINV的生物学特性和致病性研究提供有力的工具。

序列表

<110>中国农业科学院果树研究所

<120>葡萄浆果内坏死病毒侵染性克隆及其构建方法

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>7229

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

gataagtagt tgacagtgat caattgatcc cgtgtagtgc tttaaaacac gtaagatttg 60

atctagcaaa tcaaatcgcg atttgatctt ttccgtaaca tgacgttctt ctacagaaca 120

ccaacagaag aattgatctc caaattcacc tctgaagagc aaggcagaat ctattcacct 180

gcccagcgtt taatagagaa tattgagaat cagaccgctt ctcttttctt taattaccat 240

ttgaatgaaa atcaaaagaa attttttgtt gcaaatggcg tggaattgtc tcctttttca 300

tttagaccac atagtcaccc ggcgtgcaaa acactagaaa actattttct tttttcgttt 360

ttaccttctt tcctttctca ttcaggtatt aaggaactct tccttttttc catcaaaaag 420

gctaaagttg caagactaaa aaatctatct gataatgtgc aactcaacct tttaaataga 480

ttagtggagg tcaaggacaa aatgaggtat ggaatggatg tctctcctga aaggataatc 540

aagaagaatg ttggcttaga tattttcctt catgatgaat tgcaccattg gtcaaaatct 600

cagctaatct cttttctgga agttcataga cctagaaatc ttttagccac ttttgttttt 660

ccaatagaga ttttaggtgg tttcaaatct tcaatttgca actttctgta tgagtttgag 720

tgtagaaata ataggttaca tttttatcct gatggggtta tgcaagaagc ttacattcaa 780

tccctagaat catcctacct tttcaagacc aatctgatca gaacctcaaa gggttgttat 840

tcagttagcc tacatagatc cattggggct catcatttct tccaaataag caggtatgag 900

tctgaacttc tccaaagtca tcgatctttt ggaccttacg atgtgctgga tgtaggttca 960

ctttttaagg gtaaagtaag ggttccaatt gagggtatca atttgacaag atttaaaaga 1020

atcttgattt atctgttgtc tctcaaaaaa cctgatgtta attctgccgt tgcaaagttg 1080

aggcagttat ctggagacga tgtgtctctg aatgagatgt gggtcatcag agatcttgca 1140

gatagaataa tgagtggggt ttctaagtgg tcatctgaaa gcatcaaaac cataattcgt 1200

gattggatgg ttgatttgtg tccgtttaag aagaatttcg agagattcag actcattgat 1260

gactttgatc gacatcttat gaaggtcaaa cctctttctt tcacattcac atgctctgaa 1320

gatgctgact atgtttttga gccagaggaa gatttacctg attttattga tgactattgg 1380

atgggtacca aggaaaaatt tttccaagat ccattaatta gtcagattgt atctggaaga 1440

tcgaggacac catacacgta tgaacctgac aattttgaag aggcaatgat gtgcccttac 1500

atggaaggag gaacatattc ggactggaag aaaagacctt tgttggttaa acttcgaggg 1560

aaaaattcag aatacaatgt acttcattat cttgacgacg atttcccact ttgtttgcca 1620

gctccagaga gtttcttccc cggagtggat actgaagaca tacctttctt tccttacctc 1680

aaagagggaa tggaacttga tgattatatt ttgagaaaat ctgtcctgga caaactcagg 1740

ttgaaatcac tactttacaa agacggttgt tttgaccctg ctctctttct gaatggagta 1800

ggttcattct ccagatatga aaagccttct tcggttcatt tacctatggc aaaggagaca 1860

cccatctgta aatcaactga atgtggcaaa ggttctccat gcgaaccagc tgtgccatac 1920

aaatctgatc ttctaaataa ggagctaata aattccaaat ctgaattgtt caatgaggac 1980

gccggaacct ccctatctgc tgtaactgca gaaggaaatt tgccggattc atctgaaatt 2040

tctgaagtgc ttacagctga atcccagact gtatgcacca aagggaattc tgctttcact 2100

atttttgaag acaaacagtt ttgcattcat ggctctacat ccatctctgt tgattttgaa 2160

tctgctctga agggtgtgcc gaatataaaa ttgaaaaata gaactgcatt cttcttccat 2220

tctgatggcc tcccttattt tcatgatgtg gtcttgtaca gaaccagtcc tgtggcaagt 2280

tggctacaga aaatatttga tgaggcgaac gaaacttttc aaagtggttt caactcgtgc 2340

cttcttcagg tctataagga ggatgggcaa ataccctggc atttcgatga tgaggattgt 2400

tatgataacg atgatatact aactttgaat ttttctggct catgtttgtt tgaagtgcaa 2460

aatgtcgctg agtacaagct gaacaatgca gaatttgtcc tcatgaagcg tggtttgcag 2520

acattgcata aacatagagt aagatgcaca acggaaggaa gaatttcctt aaccctcagg 2580

cgacaggtac gcccaccaaa cttctctgaa ggtctgcggt ttttaccaaa ggtgggatgc 2640

ttcgtaaaag ctgtttctga acagcttctc atggaacccg aggatgtggc aatgaagttg 2700

ggtcatctct atttcgatct acttgcgaac aatggagtca aaatcactga tgttggaaag 2760

tttgcaaaga aattgggaat tgatttaatt ttgagaaatg gttttgaaac ctcttcattc 2820

aaaaataatg gtccggaggt caagatctca ttcgctctca atcattatcg tcccatgagt 2880

tctagtgaga tgaagaaagg gaagggtatt gaatcactcc caaaggaatt ggccaggaaa 2940

atgtcagatg aagatcaggt tgattgcaat ggacaaatca ttgataatct taaacagatt 3000

tatggtaatt tcttgaatca aaagacctac aggttggatc agaaaagggc ccagaaatta 3060

ctcaaatcgc ttctgactgg aacaacaggt gttcattgta gttcgaagct caaagatggt 3120

tggaaaataa ttccaaatgc aaaatcagaa gaatttgtct tcaaaaatta tattgaaggc 3180

acagacattt ggaagggctc tatgaactgg aatgcaaaaa tgaatatcac agggatcttc 3240

ggttttgctg gctctggcaa atctcatgga attcagaatt tgataaatca gaaattctct 3300

gggtctgatg aggtaatttt gataagccca agggtactcc tattggaaga ttggaaggag 3360

aaaatcaaag gtttgaaagc cctgacattt gaatctgctc ttaaaaattg tttgagcaat 3420

ttcaaatgga tcattttgga tgaagtaacg ctttttccaa atggttatct ggacctttta 3480

atgttgaaga tgtctcacta caatgaaatt cataagagac acatcacatt gataggggat 3540

ccacttcagg cgaattatta ttctgagaga gattgcaatt tgctaggaaa tatcagaatg 3600

gtggaaagtg tctttcagga tgtaaagtac atctatcaat ctcacagaat tccagagaat 3660

gtggtgagaa ggtttgatgt gtttgacaaa aacccacatg ctccacttga taatcatgga 3720

accttttatt ctgacatgtc ttctgcaagg aaacatgcat cctcatttgg ttcgaaaata 3780

gaggttgtgc ttgttgcctc tgaacttgaa aagaaatact tctcagatca ggttagatgc 3840

atcacgtatg gagaatcaca gggtctgaca tttgatttcg gattgatttc tctatctgaa 3900

gaatcaaggt tgtgctctga taatcatata tatgttgcat taactaggtt taagagaggt 3960

tttggtttct atcaaaattt tcgaggggac ctcaggtctt acaaaatgaa tttgggttcg 4020

aaattgttgg ggaggtacat caacctgggt gattctctca aaccatttat gcaacaaatg 4080

ctggatgtga atcttgattt ccttgatgat agatcaaagg ttggagctgg tcatataata 4140

gaagagaaga catcaggtga cccatggctc aagggtttac tggatctgca acaagtggat 4200

gaattcgagg aatggaacgt gcaggagatt gaatcaattg aatccacagg aaaggttcat 4260

ttaccattag cttcattgaa tgatgagttt gagaatataa gggccaggga agagagagaa 4320

tttaaaagtc ttaactttga ctggagcatg caatttgagg attgtggagt caaaatcaaa 4380

agatgtctta atgggaattt ctctgaaaat ttcagttctg tgtaccctgt tcatcaggca 4440

tgcgacgaac ttacatttct cgctgcagtc aagaagcgct tgaggttttc aaatccagcg 4500

aagaatcttc agaaatttcg gggggcaacg acggctggga aaattttgct tgatcgtttt 4560

ctaaagttta tcccgatacc gagtttcaaa ttcccagatc ttttggagga agcaaaaagg 4620

gagtttcaag aagtgaagct taagaagtca gaagggacca ttgcaggaaa ttcaaatcga 4680

tctgatccag attggcagtg gaataggatc ttcctattca tgaagtctca gcagtgtaca 4740

aaatttgaaa aaagatttgt ggatgcaaaa gcaggtcaaa ctctagcttg tttttctcat 4800

gaaatacttt gccatttttc accatggtgc agatatatgg aaaaagtttt ttcaagatac 4860

tgcccagaga atttttatat ccatcagaga aaagactttg acaagctggc cgaattttca 4920

aagaaatatt gcaagggagg tttctgcatc gaatctgatt acgaggcctt tgatgtctca 4980

caggaccaca atgttctctc atttgaagtt caattgatgg agtacatgca gattccagat 5040

ggtgtgataa atgattatgt cagaatgaag acagaattgg gctgcaagct tggcaatttt 5100

gccatcatgc gttttacagg tgaattctgc acttttctgt tcaatacctt ctgcaatatg 5160

gcattcactt ttctgaggta tgagatgaat ggtacagaac ctgtatgttt tgctggggat 5220

gatatgtgtg cactgtctga tttaaaggaa tccaaagagt tcgagagatt cttcaactct 5280

ttttctctta aagccaaagt gtgcagaaca atgaacccac tattttgtgg atggcgtctc 5340

actcgctttg gtttattcaa ggaaccaatt ctcatttttg agagattgaa gattgcaata 5400

gaaaaagaga aacttgagga agtcattgaa tcctactttt tggaattctg ttttgcctat 5460

aagttaggtt catggctgga atgggttctt gatgaaaagc aagctgatta ccaacaaagg 5520

ttatcaaggt tctttgtgaa gaagaagcat ttgctcaaag ggaaggctgc agagttaatt 5580

tcacactgcg attatctttc agatggctct gatgaagaag atagcaaggg tttctgggaa 5640

gattgcaagc gggggtactc caattgcgaa tcttccgtca agttttatat acaatgatgt 5700

caaaggtctg aaagggtcgg caggtatact tctggagagg aatgaaattg tttaccaggt 5760

tgaaccctca tctatttcag aagaattccg tgtcacgacc atcccaattg ttccaatgga 5820

gcagttgaag ctattgaatg gatccaacat gaattacatt cattttggag ctctgtccat 5880

atcaatagat ccattattca aaaggggttc tggtgttgta ggtaaggctt ttgtgtatga 5940

ttcgcgttgg gataatgctg atcaggcttt gctccaagct ttctcatttg atctgaactc 6000

tggaacagca tcaatagttt gttcaccaaa ctattctgtt caactctctg atccaagatt 6060

gtccacctgc ttatctaccg ttcttgtgtt tgaaaatttg aatttcaggg ccggcagttt 6120

tgctatatct gttagaatag gcgtaatgta tagaccttat aacagcttta ttggtgatgc 6180

gctagcgttg gatcagacca atttcaaaat tgatggtaaa gatgtggctg aattgggtct 6240

gaaggacttt ggtctctctg aaaacgataa tttggatgag cttttcaaaa aggtcccgac 6300

ggatagctca aggattgtga gatccttcac cgaaaattac aagaggaaag gtctgttggg 6360

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agctgataac aaagttttcg gaggacaaac aggtccttca tggtctaaat gaaaatcagc 6660

aatcacttgt tctggatcac atctttggaa atattgccat tgaggggaca tcagaggaga 6720

cagtctaccc acagtcagca actcagtgca aagaaggttt tgatccaacc atgccggtaa 6780

ttagggaata taatctctct agtgtagtca ataaaatcag gatttacaag gagtcccaca 6840

aaaatgaaga catcaagtcc atgacattcc gtcagatttg tgcttcattt gcaatagatg 6900

caaaattggg gctacaaaaa tttaataggt atggtgtgca ctctaatata tataagaaac 6960

acccgaagat atgtgacaaa gcgccagaga tggcctttga tttcaatgat ggtctaaatt 7020

tcaacctcct gacaaaacaa caaaagacgg tgattcagaa tctgaatcaa cttctttttc 7080

gtgttgagag tgagaaacag aagactaatg cgatcacatc ttcaagcgag ggtgctttta 7140

ctatgtgata tatgtttgca tttaataata aagtctcata tgagcacgta gctacttaat 7200

gtgatcgtaa tttgttttaa ttaatttcc 7229

Claims (10)

1.一种葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆的构建方法，包括如下步骤：将葡萄浆果内坏死病毒基因组全长cDNA第1-4978位所示的DNA片段和葡萄浆果内坏死病毒基因组全长cDNA第4962-7229位所示的DNA片段通过无缝克隆方式连接至植物表达载体中，得到含有葡萄浆果内坏死病毒全长cDNA的重组表达载体；所述重组表达载体即为葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆；

所述葡萄浆果内坏死病毒基因组全长cDNA序列如序列表中序列1所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述植物表达载体含有35S启动子；所述35S启动子用于启动所述葡萄浆果内坏死病毒全长cDNA的表达。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述植物表达载体含有核酶基因。

4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述植物表达载体为pCB301-2x35S-HDV_RZ-NOS载体。

5.利用权利要求1-4任一所述方法制备得到的葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆。

6.含有权利要求5所述的葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆的重组菌。

7.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为含有所述葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆的农杆菌。

8.权利要求5所述的葡萄浆果内坏死病毒侵染性克隆或权利要求6或7所述的重组菌在制备单一病毒侵染植物模型中的应用；所述单一病毒为葡萄浆果内坏死病毒。

9.权利要求5所述的葡萄浆果内坏死病毒侵染性克隆或权利要求6或7所述的重组菌在研究葡萄浆果内坏死病毒生物学特性和/或致病机理中的应用。

10.权利要求5所述的葡萄浆果内坏死病毒侵染性克隆或权利要求6或7所述的重组菌在研究葡萄浆果内坏死病毒与宿主植物互作中的应用。