CN102206666B - 一种质粒载体pLGF及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种质粒载体pLGF及其应用，属于生物技术技术领域。一种质粒载体pLGF，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供上述质粒载体pLGF在选育香菇新品种中的应用。通过本发明可以建立稳定有效的香菇外源基因转化体系，为获得稳定、遗传性状优良的转基因香菇新菌种提供了新的方法。

Description

一种质粒载体pLGF及其应用

技术领域

本发明涉及一种质粒载体pLGF及其应用，属于生物技术技术领域。

背景技术

香菇是一种重要的食药用栽培真菌，具有很高的营养、药用和保健价值，其中的香菇多糖具有免疫调节，抗肿瘤，抗感染等生物活性而受到广泛的关注(丛阳，黄敏.香菇多糖抗肿瘤的基础研究及临床应用进展。大连医科大学学报，2010，4(32)：465-470；迟彦，周东坡，平文祥，等.根癌农杆菌介导的真菌遗传转化及其应用.菌物学报，2005，24(4)：612-619)，我国是世界香菇生产和贸易第一大国和人工栽培香菇的发源地。目前运用于香菇的遗传转化方法与动植物、微生物的转化方法基本相同，主要使用PEG法(Challen MP，Rao BG，Elliot TJ.Transformation strategies for A garicus bisporus.Wageningen：Pudoc，1991：129-134)，电激法(Chun-Yi Kuo，Ching-Tsan Huang.A reliable transformation method and heterologousexpressionof β-glucuronidase in Lentinula edodes.Journal of Microbiological Methods，2008，(72)：111-115)以及限制性内切酶介导整合法(Sato T，Yaegashi K，Ishii S1998 Transformationof the ediblebasidiomycete lentinus edodes by restriction enzymemediated DNA integration ofplasmid DNA.Bioscience Biotechnology and Biochemistry，1998，62(12)：2346-2350)。这些转化方法需要复杂的原生质体制备，假阳性率高，转化效率较低。

根癌农杆菌是革兰氏阴性菌，当其侵染双子叶植物受伤的部位时可以转移肿瘤诱导(Ti)质粒的部分T-DNA片段到植物基因组中产生冠婴瘤，属于天然遗传转化体系(迟彦，周东坡，平文祥，等.根癌农杆菌介导的真菌遗传转化及其应用.菌物学报，2005，24(4)：612-619)。农杆菌转化真菌首先是在酵母中获得成功的，之后在1998年De Groot等人首次利用农杆菌成功的转化了丝状真菌后(de Groot MJA，Bundock P，Hooykaas PJJ，Beijersbergen AGM，1998，Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi.Nat Biotechnol16：839-842.)，农杆菌被广泛的应用到真菌的转化中。在农杆菌介导真菌的转化过程中，乙酰丁香酮(AS)会诱导vir毒性基因的表达，编码的毒性蛋白会介导T-DNA的转移。VirDl和VirD2蛋白共同作用，识别T-DNA的末端重复序列，并在末端链上产生缺刻，而这些缺刻就成为T-DNA末端线性单链置换的起始位点和终止位点(M ichielse CB，Ram AF，HooykaasPJ.Role of bacterial viru lence proteins in Agrobacterium.Mediated transform ation ofAspergillusawamori.Fungal GenetBiol.2004，41(5)：571-578)。T-DNA随即的插入到宿主基因组中，在整合过程中，宿主因素对同源或非同源整合起主要作用。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种质粒载体pLGF及其应用。该质粒载体可转化农杆菌后，通过农杆菌浸染香菇，从而将目的基因导入香菇菌体中获得稳定表达。通过本发明可以建立稳定有效的香菇外源基因转化体系，为获得稳定、遗传性状优良的转基因香菇新菌种提供了新的方法。

本发明的目的是通过以下技术措施来实现的：

一种质粒载体pLGF，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述质粒载体pLGF在选育香菇新品种中的应用。

上述应用，步骤如下：

(1)将经Nco I、BglII或Spe I内切酶中任意两个内切的目的基因插入经同样内切酶内切的上述质粒载体pLGF中，得到插入目的基因的质粒载体；

(2)将步骤(1)制得的插入目的基因的质粒载体转化根癌农杆菌EHA105，得到含目的基因的根癌农杆菌；

(3)将步骤(2)制得的含目的基因的根癌农杆菌侵染处理后的香菇菌球，得到侵染后的香菇菌球；

(4)将步骤(3)制得的侵染后的香菇菌球在含有10-20μg/mL潮霉素和300-500μg/mL头孢霉素的选择培养基中选择培养，得到表达目的基因的香菇新品种。

所述步骤(2)中的转化，具体操作如下：

将根癌农杆菌EHA105在26-28℃ 200-250rpm的条件下，于含50μg/mL链霉素的LB液体培养基中培养至OD₆₆₀为0.5-0.8，然后置于冰上15min，离心，弃上清液，再加入预冷的20mM CaCl₂溶液重悬，得重悬液；然后，向重悬液中加入含有插入目的基因的质粒载体，混匀，冰浴30min后，液氮速冻2min，37℃水浴5min，然后，加入等体积的LB液体培养基，26-28℃220rpm培养1h，再经过含50μg/mL链霉素和50μg/mL卡那霉素的LB平板培养基筛选培养，得到含目的基因的根癌农杆菌。

所述步骤(3)中的侵染，具体操作如下：

(a)将含目的基因的根癌农杆菌在26-28℃ 200-250rpm的条件下，于含50μg/mL链霉素和50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中培养22-25小时，再加入诱导培养基和AS(乙酰丁香酮)培养基，继续培养至OD₆₆₀ 0.2-0.5，得诱导后的农杆菌溶液；

(b)将处理后的香菇菌球浸入步骤(a)制得的诱导后的农杆菌溶液，浸染20-30min，浸染期间每隔5-10min振荡一次；然后将香菇菌球在诱导平板培养基中培养2-4天，培养温度22-25℃，得到侵染后的香菇菌球。

上述处理后的香菇菌球制备方法如下：

取香菇菌体接种于PDA液体培养基中25℃，150-160rpm培养10天，离心，弃上清液，然后，用诱导培养基洗涤离心2-4次，得到处理后的香菇菌球。

上述培养基采用如下配方配制：

LB液体培养基为：950mL去离子水中加5g酵母抽提物，10g胰蛋白胨，10gNaCl，定容至1L。

LB平板培养基为：在1L上述LB液体培养基中加入15g琼脂

诱导培养基为：850mL去离子水中加入1.45g KH₂PO₄、0.066g CaCl₂·2H₂O，0.00248g FeSO₄·7H₂O、0.5g(NH₄)₂SO₄、1.8g葡萄糖、5mL甘油，定容至940mL。

诱导平板培养基：850mL去离子水中加1.45g KH₂PO₄，2.05g K₂HPO₄，0.15g NaCl，0.5g MgSO₄·7H₂O，0.066g CaCl₂·2H₂O，0.00248g FeSO₄·7H₂O，0.5g(NH₄)₂SO₄，0.9g葡萄糖，5mL甘油，15g琼脂，定容至940mL。

AS(乙酰丁香酮)培养基配比为：0.01962g乙酰丁香酮溶于甲醇，去离子水定容至10mL，过滤除菌。

PDA液体培养基为：200g土豆泥，20g葡萄糖，2g KH₂PO₄，1.5gMgSO₄·7H₂O，1.5g蛋白胨，定容至1L。

PDA固体培养基：在上述PDA液体培养基中加入15g琼脂。

选择培养基为：在上述PDA固体培养基中加入潮霉素和头孢霉素，使潮霉素终浓度为10-20μg/ml，头孢霉素终浓度为300-500μg/ml。

有益效果：

1、根癌农杆菌EHA105介导转化可以转移Ti质粒的部分片段T-DNA整合到宿主基因组中，以香菇的菌丝作为初始材料，转化效率高且遗传稳定性好，可进行同源整合，也可以随机插入，避免了传统转化方法中原生质体制备困难，再生率低的缺点；可以从农杆菌介导转化后的香菇中直接获得T-DNA插入位点两侧的序列和确定被破坏的基因，并通过表型的变化实现正反向遗传性的结合分析。

2、利用香菇转化获得突变体已成为进行基因克隆和遗传学分析最有效的方法之一，建立相应的插入突变体库是功能基因组学发展的趋势，通过对不同表型突变体的正、反向遗传学分析揭示香菇生长、代谢的分子机理，对进一步了解这个经济重要的工业菌株具有重大意义，同时也为鉴定那些与菌株生长发育、代谢途径相关的关键基因，深入了解基因功能和阐明相关的分子机理提供了技术平台和研究基础。

3、与传统的转化方法相比农杆菌介导转化法具有明显的优势，孢子、菌丝子实体均可作为初始材料，避免了制备原生质体的麻烦；T-DNA单拷贝插入效率高；不需要专门仪器，转化率高于其它转化方法；可以避免菌丝的多核所造成的转化子的不稳定。除此之外，农杆菌介导的转化还有一个突出的优点，由于T-DNA插入位点两侧的序列，这有利于突变相关基因的确定。本发明方法所建立的香菇转化系统，为香菇新品种的选育开辟了新的途径，更好的满足人们对香菇质量和产量的要求。

附图说明

图1为pLGF的质粒图谱；

其中，RB为T-DNA区右边界；LB为T-DNA区的左边界；EcoR I、Xho I、BamH I、Pst I、Bgl II为限制性内切酶位点；gpd 1和gpd 2为3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子，hphR为潮霉素磷酸转移酶基因，KanR为卡那霉素，mGFP为绿色荧光蛋白基因，NOS-poly A为终止子，CaMV35S poly A为烟草花椰菜病毒启动子；

图2为pLGF酶切鉴定电泳图；

图3为含有swo基因的pLGF酶切鉴定电泳图

其中，M：1kb marker 1：Pst I和Bgl II；2：EcoR I和BamH I；3：Xho I和EcoR I；

图4为pLGF转化农杆菌PCR鉴定电泳图；

图5为香菇转化子在潮霉素抗性平板生长情况的照片；

图6为香菇转化子潮霉素hph基因的PCR鉴定电泳图；

其中，泳道1为1kb marker，泳道2，3为香菇转化子PCR，泳道4为原菌株PCR，泳道5为pLGF质粒PCR；

图7香菇转化子的点杂交鉴定图；

其中，1：质粒对照；2：原菌株对照；3：香菇转化子；4：香菇转化子。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实例对本发明的技术方案作进一步的阐述，但本发明所保护范围不限于此。

实施例1

质粒载体pLGF的构建，步骤如下：

(1)按以下步骤提取质粒pCAMBIA1302

(a)将含有质粒pCAMBIA1302的大肠杆菌DH5α接种至含有卡那霉素的20mL的LB液体培养基(每升含酵母抽提物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g)中，37℃180rpm振荡培养过夜，得培养液。

(b)取1.5mL培养液于微量离心管中，12000rpm离心30s，弃上清液，得细胞沉淀。

(c)向细胞沉淀中加入100μL预冷的溶液I(每100mL中含20mM葡萄糖25mL，1MTris-HCl(pH8.0)2.5mL，250mM EDTA(pH8.0)4mL)，用旋涡混合仪剧烈振荡，使菌体充分悬浮。

(d)加入200μL新配制的溶液II(10M NaOH 200μL，10％SDS(W/V)1mL，临用前加去离子水定容至10mL)，立即温和颠倒离心管5～6次(避免剧烈振荡)，静置2min。

(e)加入150μL预冷的溶液III(每100mL含5M乙酸钾60mL，冰乙酸11.5mL)，反复颠倒数次，冰浴10min，12000rpm离心10min。

(f)取上清液于另一1.5mL离心管中，加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇(体积比25∶24∶1)，颠倒混匀，12000rpm离心5min。

(g)取上清液，加入两倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，静置10min，12000rpm离心10min。

(h)弃上清液，沉淀用1mL 70％乙醇洗涤两次，12000rpm离心2min。弃上清液，除酒精。

(i)沉淀用30μL的TE(每升含Tris 1.21g，EDTA-Na₂ 0.37g，pH 8.0)溶解，即得质粒pCAMBIA1302。

(2)以质粒pCAMBIA1302为模板，设计的引物

ZHFn：5’-CCGGAATTCGCTTTCGCAGATCCCGGG-3’(下划线处为EcoR I位点)SEQ ID NO.2

ZHR1：5’-CCGCTCGAGTTATGGAGAAACTCGAGCTT-3’(下划线处为Xho I位点)SEQ ID NO.3，

扩增出1kb的hph基因，带有EcoR I和Xho I位点。

(3)回收后用限制性内切酶EcoR I和Xho I酶切hph片段，并用T4连接酶将hph片段与同样酶切回收后的pCAMBIA1302大片段相连。

(4)按以下步骤提取香菇的基因组DNA：

(a)刮取香菇菌丝，倒入液氮迅速研磨成粉末，转移至1.5mL离心管中。

(b)加入600μL于65℃预热的CTAB(100mM Tris，pH 8.0；20mMEDTA，pH 8.0，1.4M NaCl提取缓冲液)，65℃下孵育60min，每15min颠倒混合一次。

(c)加入等量的600μL苯∶氯仿∶异戊醇(体积比25∶24∶1)，颠倒混匀。

(d)8000rpm，离心10min后吸取上清液加入另一干净的离心管中。

(e)加入0.6倍体积预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，在-20℃下放置45min，12000rpm离心5min，倒掉上清。

(f)加入500μL预冷的70％乙醇漂洗两次。

(g)除乙醇，加入40μL TE溶液，溶解DNA。

(5)以提取的香菇基因组DNA为模板，设计的引物

pLgF1：5’-CGCGGATCCGATATCAGTCAGATTG-3’(下划线处为EcoR I位点)SEQ ID NO.4，

pLgR1：5’-CCGGAATTCGGCCATTTTAATTCAAGC-3’SEQ ID NO.5，

(下划线处为BamH I位点)扩增出750bp的启动子gpd1。

以引物PLgF3：5’-AACTGCAGTCGATATCAGTCAGATTG-3’(下划线处为PstI位点)SEQ ID NO.6和pLgR1：5’-GAAGATCTGGCCATTTTAATTCAAGC3-3’(下划线处为Bg/II位点)SEQ ID NO.7扩增出750bp的启动子gpd2(带有Pst I位点)。

(6)将启动子gpd1回收并用限制性内切酶EcoR I和BamH I酶切后和同样酶切回收后的带有hph片段的载体大片段相连。

(7)将回收的启动子gpd2用限制性内切酶Pst I和Bgl II酶切，与同样酶切后的带有hph基因和gpd1启动子的大片段相连，即得质粒载体pLGF，见图1，图2。

经测序，该质粒载体pLGF核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2

上述质粒载体在选育香菇新品种中的应用，步骤如下：

(1)按以下步骤提取质粒pUC19-swo

(a)将含有质粒pUC19-swo的大肠杆菌DH5α接种至含有氨苄霉素的20mL的LB液体培养基(每升含酵母抽提物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g)中，37℃ 180rpm振荡培养过夜，得培养液。

(b)取1.5mL培养液于微量离心管中，12000rpm离心30s，弃上清液，得细胞沉淀。

(c)向细胞沉淀中加入100μL预冷的溶液I(每100mL中含20mM葡萄糖25mL，1MTris-HCl(pH8.0)2.5mL，250mM EDTA(pH8.0)4mL)，用旋涡混合仪剧烈振荡，使菌体充分悬浮。

(d)加入200μL新配制的溶液II(10M NaOH 200μL，10％ SDS(W/V)1mL，临用前加去离子水定容至10mL)，立即温和颠倒离心管5～6次(避免剧烈振荡)，静置2min。

(e)加入150μL预冷的溶液III(每100mL含5M乙酸钾60mL，冰乙酸11.5mL)，反复颠倒数次，冰浴10min，12000rpm离心10min。

(f)取上清液于另一1.5mL离心管中，加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，颠倒混匀，12000rpm离心5min。

(g)取上清液，加入两倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，静置10min，12000rpm离心10min。

(h)弃上清液，沉淀用1mL 70％乙醇洗涤两次，12000rpm离心2min。弃上清液，除酒精。

(i)沉淀用30μL的TE(每升含Tris 1.21g，EDTA-Na₂ 0.37g，pH 8.0)溶解，即得质粒pUC19-swo。

(2)以质粒pCAMBIA1302为模板，设计的引物

swoF：5’-GAAGATCTCACCACCACCACCACCAC-3’(下划线处为Bgl II酶切位点)SEQ IDNO.8，swoR：5’-GAAGATCTGCGCTTGGAAATCACATT-3’(下划线处为Bgl II酶切位点)SEQ ID NO.9，扩增出1.4kb的swo基因，两端均带有Bgl II位点。

(3)回收后用限制性内切酶Bgl II酶切swo片段，并用T4连接酶将swo片段与同样酶切回收后并去磷酸化处理的pLGF相连。

(4)经测序验证连入swo片段方向的正确性，见图3。

实施例3

将pLGF质粒导入EHA105：

(a)从LB平板上(含50μg/ml链霉素)挑取农杆菌EHA105菌株的单菌落，接种于7ml LB液体培养基(含50μg/ml链霉素)中，在27℃ 220rpm培养24h。

(b)取步骤(a)中的培养液0.5ml接种于LB培养基(含50μg/ml链霉素)中，在26-28℃ 220rpm培养OD₆₆₀为0.5-0.8，冰上放置15min，4℃ 3000rpm离心10min，弃上清，加入10mL预冷的20mM CaCl₂重悬菌体。

(c)取步骤(b)中的溶液200μL，加入适量pLGF载体，混匀，冰浴30min，转入液氮速冻2min，然后37℃水浴5min，加入等体积的LB培养基，26-28℃ 220rpm培养1hr，涂布于LB培养基平板(含50μg/mL链霉素和50μg/mL卡那霉素)，26-28℃培养，筛选转化子，见图4。

将上述已导入pLGF质粒的EHA105单菌落接种于7mL LB培养基(含50μg/mL链霉素和50μg/mL卡那霉素)中，27℃ 220rpm培养24hr，再加入13mL诱导培养基和400μLAS，继续培养至OD₆₆₀为0.3。

取接种于PDA液体培养基中25℃ 150rpm培养好的新鲜香菇菌球于无菌培养皿中，加入活化好的农杆菌菌液，侵染30min，期间每隔5min振荡一次。侵染结束后吸掉培养皿中的菌液，然后将菌球转移至铺有一张滤纸的诱导平板中，25℃共培养3天至菌球萌发。在诱导平板上倒入选择培养基含有10μg/mL潮霉素和300μg/mL头孢霉素)继续培养得到香菇转化子，转化效率为18.23％，见图5。

对PCR扩增鉴定为阳性的转化子(见图6)，液体培养后，抽取基因组DNA，通过酶切、电泳、转膜等操作，与地高辛标记的目的基因swo探针杂交，出现明显杂交信号(见图7)。

本发明适用于现有的各种香菇菌种。经检测，经侵染后的香菇菌球经多代培养后，仍能检测到均有明显的信号；说明本发明方法已有效的将外源swo基因整合到香菇的基因组中，并且使swo基因在香菇中得到稳定表达。上述结果说明本发明方法能有效的介导外源基因整合入香菇基因组中，并使之得到稳定的表达，从而建立了香菇的转化系统。

实施例4：

按实施例3中的步骤将pLGF质粒导入农杆菌EHA105中；将已导入pLGF质粒的EHA105单菌落于7mL LB培养基(含60μg/mL链霉素和60μg/mL卡那霉素)中，28℃ 200rpm培养24hr，再加入13mL诱导培养基和500μL AS，继续培养至OD₆₆₀为0.4。

取接种于PDA液体培养基中25℃ 160rpm培养好的新鲜香菇菌球于无菌培养皿中，加入活化好的农杆菌菌液，侵染20min，期间每隔10min振荡一次。侵染结束后吸掉培养皿中的菌液，然后将菌球转移至铺有一张滤纸的诱导平板中，25℃共培养3天至菌球萌发。在诱导平板上倒入选择培养基含有15μg/mL潮霉素和400μg/mL头孢霉素)继续培养得到香菇转化子，转化效率为19.73％。

实施例5：

按实施例3中的步骤将pLGF质粒导入农杆菌EHA105中；将已导入pLGF质粒的EHA105单菌落于7mLLB培养基(含60μg/mL链霉素和60μg/mL卡那霉素)中，28℃ 220rpm培养24hr，再加入13mL诱导培养基和600μL AS，继续培养至OD₆₆₀为0.5。

取接种于PDA液体培养基中25℃ 160rpm培养好的新鲜香菇菌球于无菌培养皿中，加入活化好的农杆菌菌液，侵染25min，期间每隔10min振荡一次。侵染结束后吸掉培养皿中的菌液，然后将菌球转移至铺有一张滤纸的诱导平板中，25℃共培养4天至菌球萌发。在诱导平板上倒入选择培养基含有20μg/mL潮霉素和500μg/mL头孢霉素)继续培养得到香菇转化子转化效率为18.85％。

Claims (2)

1.一种质粒载体pLGF，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的质粒载体pLGF在选育香菇品种中的应用。

3、如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤如下：

（1）将经NcoⅠ、BglⅡ或SpeⅠ内切酶中任意两个内切的目的基因插入经同样内切酶内切的上述质粒载体pLGF中，得到插入目的基因的质粒载体；

（2）将步骤（1）制得的插入目的基因的质粒载体转化根癌农杆菌EHA105，得到含目的基因的根癌农杆菌；

（3）将步骤（2）制得的含目的基因的根癌农杆菌侵染处理后的香菇菌球，得到侵染后的香菇菌球；

（4）将步骤（3）制得的侵染后的香菇菌球在含有10-20 μg/mL潮霉素和300-500 μg/mL头孢霉素的选择培养基中选择培养，得到表达目的基因的香菇新品种。

4、如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中的转化，具体操作如下：

将根癌农杆菌EHA105在26-28 ℃ 200-250 rpm的条件下，于含50 μg/ml链霉素的LB液体培养基中培养至OD₆₆₀为0.5-0.8，然后置于冰上15 min，离心，弃上清液，再加入预冷的20 mM CaCl₂溶液重悬，得重悬液；然后，向重悬液中加入含有插入目的基因的质粒载体，混匀，冰浴30 min后，液氮速冻2 min，37 ℃水浴5 min，然后，加入等体积的LB液体培养基，26-28 ℃ 220 rpm培养1 hr，再经过含50μg/ml链霉素和50μg/ml卡那霉素的LB平板培养基筛选培养，得到含目的基因的根癌农杆菌。

5、如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）中的侵染，具体操作如下：

（a）将含目的基因的根癌农杆菌在26-28 ℃ 200-250 rpm的条件下，于含50 μg/ml链霉素和50 μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中培养22-25 hr，再加入诱导培养基和乙酰丁香酮培养基，继续培养至OD₆₆₀ 0.2-0.5，得诱导后的农杆菌溶液；

（b）将处理后的香菇菌球浸入步骤（a）制得的诱导后的农杆菌溶液，浸染20-30 min，浸染期间每隔5-10 min振荡一次；然后将香菇菌球在诱导平板培养基中培养2-4天，培养温度22-25 ℃，得到侵染后的香菇菌球。

6、如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述处理后的香菇菌球制备方法如下：

取香菇菌体接种于PDA液体培养基中25 ℃，150-160 rpm培养10天，离心，弃上清液，然后，用诱导培养基洗涤离心2-4次,得到处理后的香菇菌球。

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